Summary
Detta manuskript beskriver användningen av genetiskt-kodade fluorogenic reportrar i ett program för live-cell imaging för undersökning av xenobiotiska-inducerad oxidativ stress. Detta experimentella tillvägagångssätt erbjuder oöverträffad spatiotemporal upplösning, känslighet och specificitet samtidigt undvika många av bristerna i konventionella metoder som används för detektion av toxikologiska oxidativ stress.
Abstract
Oxidativ stress är en ofta citerade toxikologiska mekanism, lider konventionella metoder för att studera det av ett antal brister, inklusive förstörelsen av provet, införandet av potentiella artefakter och bristande specificitet för den reaktiva arter inblandade. Således finns det ett aktuellt behov inom toxikologi för icke-förstörande, känsliga och specifika metoder som kan användas för att observera och kvantifiera intracellulära redox störningar, mer allmänt kallas oxidativ stress. Här presenterar vi en metod för användning av två genetiskt-kodade fluorogenic sensorer, roGFP2 och HyPer, att användas i live-cell imaging studier för att iaktta xenobiotiska-inducerad oxidativ svaren. roGFP2 balanserar med den glutation redox potential (EGSH), medan HyPer direkt upptäcker väteperoxid (H2O2). Båda sensorerna kan uttryckas i olika celltyper via transfection eller transduktion och riktas till specifika cellulära fack. Viktigast av allt, erbjuder live-cell mikroskopi använda dessa sensorer hög rumsliga och temporal upplösning som inte är möjligt med konventionella metoder. Förändringar i fluorescensintensiteten övervakas på 510 nm serverar som avläsningen för både genetiskt-kodade fluorogenic sensorer när sekventiellt upphetsad av 404 nm och 488 nm ljus. Denna egenskap gör båda sensorer proportionerlig, eliminera gemensamma mikroskopi artefakter och korrigering för olikheter i sensorn uttryck mellan celler. Denna metod kan appliceras över en mängd olika fluorometric plattformar kan spännande och samlande utsläpp vid de föreskrivna våglängder, vilket gör den lämplig för användning med confocal bildsystem, konventionella wide-fältet mikroskopi och plattan läsare. Både genetiskt-kodade fluorogenic sensorer har använts i en mängd olika celltyper och toxikologiska studier för att övervaka cellulära EGSH och H2O2 generation i realtid. Beskrivs här är en standardiserad metod som är mycket anpassningsbar över celltyper och fluorometric plattformar för tillämpningen av roGFP2 och HyPer i live-cell toxikologiska bedömningar av oxidativ stress.
Introduction
Termen ”oxidativ stress” omnämns ofta som en mekanism i toxikologi, men är sällan denna term som beskrivs specifikt. Oxidativ stress kan avse flera intracellulära processer, inklusive generation av reaktiva syreradikaler, skador orsakade av fria radikaler, oxidation av antioxidant molekyler, och även aktivering av specifika signalering kaskad. Ett brett utbud av miljöföroreningar1,2 och farmaceutiska medel3,4 har dokumenterats för att inducera oxidativ stress genom antingen direkt aktion av xenobiotiska föreningen själv5 ,6 eller sekundärt genom produktionen av antioxidant arter som en del av ett cellulärt svar7,8,9,10. Det är därför av stort intresse i toxikologi att noggrant iaktta och karaktärisera de oxidativa processer som leder till negativa resultat. Konventionella metoder för mätning av oxidativ stress innebär identifiering av oxiderade biomolekyler11,12,13,14,15 eller antioxidanter16 ,17,18,19,20, eller direkt mätning av reaktiva arter själva21,22,23, 24. Dessa metoder kräver dock normalt cellulära störning, som ofta förbrukar provet, eliminerar rumslig upplösning och potentiellt introducerar artefakter25. Utvecklingen av mer känsliga och specifika metoder för detektion av oxidanten arter och markörer för oxidativ stress är allmänt tillämplig på utredningen av de negativa effekterna av xenobiotiska exponering.
Live-cell mikroskopi med hjälp av en ny generation av genetiskt-kodade fluorogenic sensorer har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för att övervaka intracellulära redox status av levande celler. Dessa sensorer uttrycks vanligen använder en vector under kontroll av en viral arrangören som införs via transfection eller transduktion metoder. Hög uttryck effektivitetsvinster är inte nödvändiga, eftersom celler som uttrycker fluorescerande sensorn lätt kan identifieras visuellt. För toxikologiska bedömningar, kan celler som uttrycker dessa sensorer observeras med fluorescensmikroskopi som de utsätts för xenobiotiska föreningar i realtid. Denna experimentella design tillåter upprepade mätningar i samma cell, så att alla cellens etablerade baslinjen till fungera som sin egen kontroll. Den höga temporal upplösning genom live-cell imaging är väl lämpad för detektion av oxidativ händelser, särskilt sådana som är blygsam i storleksordning eller övergående natur. Förutom att vara både känsligt och specifikt till deras målmolekyler, kan fluorescensen av några av dessa sensorer vara upphetsad med hjälp av två våglängder av ljus. Detta fenomen kan fluorescerande utsläpp uttrycks som en kvot, som tillstånd urskillning av signalförändringar i samband med autentiska sensor svaren från de som orsakas av artefakter såsom variationer i sensorn uttryck, cell tjocklek, lampa intensitet, fotoblekning och känslighet av fluorescens detektorn26. En annan fördel av användningen av fluorogenic sensorer är att de kan riktas till specifika cellulära fack, att skapa en nivå av rumslig upplösning som är oöverträffad av konventionella metoder25,26,27.
En stor familj av genetiskt-kodade sensorer baserat på grönt fluorescerande protein (GFP) har utvecklats och kännetecknas till rapport om en lång rad fysiologiska markörer, inklusive pH, temperatur, kalcium koncentrationer och ATP/ADP kvoten25 ,28,29,30,31. Bland dessa ingår sensorer av glutation redox potential (EGSH) och väteperoxid (H2O2). Medan dessa sensorer har utvecklats för applikationer i redox biologi och fysiologi, har de även anpassats till studera xenobiotiska-inducerad oxidativ stress. Specifikt, beskriver det protokoll som beskrivs här användningen av de EGSH sensor roGFP2 och H2O2 sensorn HyPer.
roGFP2 rapporter om redoxpotential av intracellulära reducerade och oxiderade glutation (GSH/GSSG) genom en redox relä som involverar glutationperoxidas (GPx), glutaredoxin (Grx) och glutation reduktas (GR) (figur 1)25, 32 , 33. glutation är dominerande cellulär antioxidant molekyl och förekommer främst i dess reducerade form (GSH) i millimolar koncentrationer i det cytosol25,34. Medan EGSH inte har kopplats till något funktionellt resultat, är det erkänd som en viktig indikator på intracellulära oxidativ status34. En relativt liten ökning av koncentrationen av GSSG resulterar i en ökning av EGSH som detekteras av roGFP2. Lika viktigt, övervakning av EGSH använder roGFP2 under xenobiotiska exponeringar kan potentiellt avslöja mycket om verkningsmekanismen vid flera punkter i redox reläet och associerade vägar, såsom det pentosjäsande fosfatet shunt (figur 1 )35. Den andra sensor som diskuteras här, HyPer, är en intracellulär H2O2 sond härrör från införandet av gula fluorescerande protein (YFP) in i föreskrivande domänen för bakteriell H2O2-känsliga transkription faktorn OxyR136. Även om det har tidigare ansetts vara en skadliga reaktiva syre mellanliggande, är H2O2 alltmer att erkännas som en viktig intracellulära signalmolekyl under fysiologiska betingelser37, 38, vilket tyder på att okända roller för H2O2 finns i toxikologi samt. Överflödigt H2O2 induceras av en xenobiotiska exponering kan exempelvis vara en föregångare till dysreglering i cellulär signalering eller en förskjutning i bioenergetik.
Både genetiskt-kodade fluorogenic sensorer har uttryckts i flera etablerade cellinjer, inklusive mänskliga epidermoid karcinom cell linjen A431 och raden mänsklig bronkial epitelial cell BEAS-2B, att observera ändringar i EGSH och H2 O2 som svar på en mängd olika toxikologiska exponeringar. Dessa inkluderar gasformiga föroreningar (ozon35), lösliga komponenter partiklar (1,2 naphthoquinone39,40 och zink41), och nickel nanopartiklar (opublicerade data). Dessa studier utgör endast en liten delmängd av de möjliga tillämpningarna av dessa två sensorer. Teoretiskt, vilken celltyp som kan ta emot och att uttrycka DNA av dessa sensorer genom konventionella molekylärbiologiska tekniker kan utnyttjas för att bedöma effekterna av xenobiotika misstänks ändra cellulära oxidativ staten. Hittills har har en eller flera av dessa sensorer uttryckts i olika prokaryoter och Eukaryoter, inklusive flera däggdjur, växt, bakterier och jäst cell typer25,26,36,42. Utläsningen för både EGSH och H2O2 sensorer är en förändring i intensitet av fluorescens som avges på 510 nm vid excitation med 488 och 404 nm ljus. Denna metod är mycket anpassningsbar på fluorometric plattformar, inklusive olika typer av mikroskopi (confocal och wide-field) och plattan läsare. Metoden presenteras här tillåter för känsligt och specifikt observation av intracellulära EGSH och H2O2 i in vitro- toxikologiska system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av celler
Obs: Den här proceduren beskriver den lentiviral transduktion av en förevigade cellinje (BEAS-2B. ATCC, Manassas, VA) att uttrycka den önska reportern (roGFP2 eller HyPer). Andra cell-linjer /-typer eller metoder av genöverföring, inklusive transfection, kan utnyttjas så länge som de resulterar i en nivå av reporter uttryck tillräckligt att visualisera ett tillräckligt antal sensor-uttryckande celler per synfält (vanligtvis 5-10 celler). Om du använder transfection metoder, förfarandet bör utföras i skålen som slutligen kommer att användas för analysmetoden (t.ex. transfect cellerna i samma skålen som kommer att presenteras för mikroskopet). Anvisningarna nedan ger information för att förbereda cell transductions ska utföras i en 6-väl cell kultur plattan. Om detta format inte är en lämplig storlek för önskat program, kan andra fartyg ersättas.
- Odla cellerna till cirka 40-60% sammanflödet i normal tillväxt medier.
Obs: Denna studie utnyttjade människa bronkial epitelial cell linjen, BEAS-2B, odlas i keratinocyter odlingsmedium (KGM). - Strax före transduktion, ersätta tillväxt medier på cellerna med 500 µL serum-fria medier som innehåller lämplig mängd virus, som beräknas av formeln:
- För transduktion BEAS-2B celler, använder du serumfritt keratinocyter basala medium (KBM) för att ersätta KGM tillväxt medier under viral inkubationer.
Obs: Ovanstående beräkning är för en enda transduktion i en brunn av celler i ett 6-väl format. Vid behov, utföra transductions av flera brunnar kan utföras genom att justera formeln med en multiplikation av antalet brunnar att vara sensorik. För lentiviral transductions, använda en multiplicity av infektion (MOI) mellan 5 och 20. För adenovirala transductions, använda en MOI mellan 100 och 500.
- För transduktion BEAS-2B celler, använder du serumfritt keratinocyter basala medium (KBM) för att ersätta KGM tillväxt medier under viral inkubationer.
- Inkubera cellerna med viral blandningen vid 37 ° C i 4 h, omfördela viruspartiklarna i skålen var 30-60 min med en kort gunga eller virvlande rörelse.
- Tillsätt 1 mL av komplett tillväxtmassmedia till skålen och inkubera vid 37 ° C för en extra 4-16 h.
- Ta bort alla medier och ersätta med färsk komplett tillväxt medier.
- Fortsätta att växa och passage celler, expandera som behövs.
Obs: Celler bör börja påtagligt uttrycker sensorn inom 12-48 h. Om en lentiviral vektor användes för transduktion, bör stabilt uttryck för önskad sensorn fortsätta över passager. - För mikroskopi-baserade bedömningar, utsäde celler i glas botten Mikroskop rätter och växa till önskad sammanflödet (≥ 70 - 80%) före imaging.
Obs: Sådd densitet beror på storleken på skålen, tillväxttakten av cell-linjen som används och tiden för bedömningen efter sådd. Till exempel utsäde 300.000 BEAS-2B celler i en 35 mm skål att ge cirka 70-80% sammanflödet efter 1 dag av tillväxt.
2. mikroskopi Set-up
Obs: Protokollet beskrivs nedan utförs med confocal Mikroskop utrustat med laserlinjerna vid 404 och 488 nm. Andra sätt att göra fluorometric bedömningar av sensorer beskrivs inom detta protokoll på sin föreskrivna excitationer/utsläpp bör också ge livskraftiga data. Ännu viktigare, kan utrustning inställningar variera beroende på typ, ålder och skick av instrument som används; alla instrument värden nämns kan således inte vara specifika för den utrustning som används i andra laboratorier.
- Utföra alla bildanalys med miljökontroll för att behålla en lämplig temperatur t.ex. 37 ° C, luftfuktighet (normalt > 95% relativ fuktighet), och/eller gas koncentration (t.ex., 5% CO2) lämplig för cellerna i hela den varaktighet av experimentet.
- Om du använder höga värden på relativ luftfuktighet, hålla några ytor som kan komma i kontakt med den befuktade atmosfären (t.ex., Mikroskop målet) på eller något över temperaturen då luftfuktigheten genereras för att förhindra kondens. Detta kan åstadkommas med hjälp av en objektiv värmare och/eller värme tejp och en lämplig värmare kontroll.
- Aktivera alla Mikroskop komponenter och ställa in all utrustning som krävs för sekventiell excitation vid 488 och 404 nm med utsläpp på 510 nm. Kontrollera alla komponenter av optisk konfiguration är lämpligt för realtid förvärv.
- Ställa in en scen-top miljökammare att hålla konstant temperatur vid 37 ° C, 5% CO2 atmosfär, och > 95% luftfuktighet. Före start bild förvärvandet, temperera miljökammare för minst 10 minuter efter den första installationen av alla miljökontroll.
Obs: Miljöförhållanden kan elimineras eller justeras beroende på experiment längd, celltyp och exponering som används. - Placera skålen av celler (steg 1,7) på scenen-toppen inom klimatkammare.
- Med det önskade objektivet, hitta fokalplanet celler med hjälp av okular och vitt ljus, och säkerställa normal morfologi.
Obs: En 1.4 NA 60 X violett-korrigerad, oljebad objektiv används ofta, som medger identifiering av intracellulär fack samtidigt maximera de confocal systemet optisk upplösning. - Kontrollera fluorescens uttrycket av cellerna i synfältet. Göra det samtidigt visualisera cellerna under wide-fältet fluorescens belysning med ett lämpligt filter set, såsom fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC). Vid denna punkt, med wide-fältet belysning medan tittar genom okularet är mer praktiskt eftersom det är lättare att flytta skålen att välja ett fält av celler att studera. I allmänhet Välj ett synfält som innehåller minst 5 till 10 celler som uttrycker sensorn, som indikeras av grön fluorescens.
- Alternativt utföra denna bedömning confocally med laser excitation vid en våglängd som är mest kompatibel med sensorn uttrycks (488 nm vanligtvis fungerar bäst).
Obs: På grund av sina inneboende fluorescerande egenskaper, det kommer vara svårt att visualisera celler som uttrycker HyPer än dessa uttrycker roGFP2 använder antingen FITC eller på 488 nm. Dock bör det fortfarande vara möjligt att se svaga celler.
- Alternativt utföra denna bedömning confocally med laser excitation vid en våglängd som är mest kompatibel med sensorn uttrycks (488 nm vanligtvis fungerar bäst).
- När en önskad synfält finns, Stäng klimatkammare.
Obs: Funktionen fokus-underhåll, ofta tillgängliga på avancerade Mikroskop står, för att underlätta upprätthållandet av en stabil fokalplan under hela studien. - Ställ in förvärv parametrar att säkerställa optimal bedömning av sensorn sevärdheter hela exponeringsperioden önskad. Nedan följer rekommendationer och strategier för confocal avbildning av sensorn svaren:
- Justera lasereffekten för magnetiseringen på 488 nm och utsläpp på 510 nm. Välj en laser power nivå som möjliggör visualisering av celler och hålla detta konstant mellan prover eller replikera rätter.
Obs: För denna studie, 12% och 1,5% lasereffekt användes för 488 och 404 nm laserlinjerna, respektive. - Använd confocal kontrollerna av programvaran förvärvet för att säkerställa att valda fokalplanet har optimerats för maximal fluorescensintensiteten utsläpp i mitten av cellerna (z-axel) genom att skanna på 488 nm medan du justerar z-planet. Detta underlättas genom att använda en hög känslighetsinställningen samtidigt söka efter z-planet som resulterar i de mest överexponerade cellerna. När lämpliga fokalplanet har hittats, återgå vinsten till en inställning som är mest optimala för fluorescensen av reporter används utan oversaturating pixlarna observeras.
Obs: Laser och få inställningarna som är lämpliga för att hitta och observera celler under experiment är helt beroende av confocal systemet utnyttjades. I allmänhet när cellerna har hittats i synfältet, det rekommenderas att en minimal mängd av lasereffekten används (vanligen ≤20%), som överdriven genomsökning av celler med motorstarka laserljus kan inducera oxidativ förändringar upptäckas av sensorn. - Använd vinsten för att finjustera baslinjen fluorescensen. Med roGFP2, upprätta baslinjen nära den övre gränsen (≈ 90% relativ intensitet) av instrumentet utan överdriven färgmättnad, eftersom dessa celler förlorar 510 nm fluorescens induceras av 488 nm excitation när EGSH ökar. Däremot fluorescensintensiteten med 488 nm excitation bör vara låg (≈ 10% relativ intensitet) vid baslinjen för HyPer uttrycker celler, dessa celler kommer få 510 nm fluorescensintensiteten när H2O2 upptäcks.
- Upprepa steg 2.9.2 och 2.9.3 med excitation vid 404 nm och utsläpp på 510 nm. Vinst i inställningarna för 404 nm excitation våglängden är motsatsen till de som används med 488 nm magnetisering för varje sensor (dvs låg baslinje fluorescens (≈ 10% relativ intensitet) på 404 nm för roGFP2, högt vid fluorescens (≈ 90% relativ intensitet) för H2 O2 sensor).
Obs: I allmänhet fluorescensen (510 utsläpp) på 404 nm magnetiseringen blir betydligt lägre än att erhållas med 488 nm magnetiseringen i celler uttrycker både roGFP2 och HyPer, som 404 nm topp är en relativt liten excitation maximal för båda dessa sensorer.
- Justera lasereffekten för magnetiseringen på 488 nm och utsläpp på 510 nm. Välj en laser power nivå som möjliggör visualisering av celler och hålla detta konstant mellan prover eller replikera rätter.
3. data Acquisition
- Ställa in programvaran förvärvet att sekventiellt excitera två excitation våglängder (första 488 nm och sedan 404 nm) och samla utsläpp för både på 510 nm vid ett förutbestämt tidsintervall hela experimentet önskad längd (t.ex. fånga bilder var 60 s för 60 min).
- Alternativt skaffa bilder manuellt före och efter exponeringar om ungefärliga tidpunkten för ändringar i EGSH eller H2O2 är kända för de xenobiotiska testas. Detta kan dock leda till förlust av temporal upplösning.
- För realtid bedömning av experimentella parametrar, välj minst 5-10 sensor-uttryckande celler i fältet och fastställa dem som regioner av intresse (”ROIs”) för att övervaka deras fluorescens förändringar under experimentet.
Obs: Detta steg är valfritt och kan utföras efter experimentet om direkt observation i realtid är önskvärt eller programvara begränsningar förhindra kontinuerlig övervakning. Beroende på befolkningens cell, kan valet av sensorn uttrycker celler som ROIs representera olika uttryck nivåer över cellerna.- För dessa studier, lägga till den miljömässiga toxiska 9,10-fenantrenkinon (9,10-PQ) eller väteperoxid (H2O2) efter en 5-min baseline-period.
- Förbereda alla reagenser för senare användning i detta protokoll. Lös 9,10-PQ i dimetyl sulfoxid (DMSO) till en koncentration av 15 mM, och späd i basalcellscancer medier ge en 250 µM fungerande lösning. Dessutom Förbered en fungerande lösning av väteperoxid i vatten som kommer att ge en slutlig koncentration på 1mM vid injektion.
- När de experimentella parametrarna har definierats, börja tid kursen förvärvet. Upprätta en baseline-period av minst 5 min (eller 5 datapunkter) före start xenobiotiska exponeringar.
- Utsätter cellerna för människor som har undersökts med hjälp av konventionella metoder för in vitro- dosering. Förbereda lösliga föreningar i vatten eller andra lämpliga lösningsmedel och injicera direkt i media.
- Om organiska lösningsmedel (t.ex. dimetyl sulfoxid eller etanol) krävs, hålla slutliga lösningsmedel koncentration vid eller under 0,1%. Verifiera att lösningsmedlet inte ger en effekt på EGSH eller H2O2 produktion med en fordonskontroll i en separat skål av celler.
- För föreningar med lägre löslighet, lägga till en blandande steg med hjälp av en mikropipett till protokollet efter injektionen görs. Pumpa gasformiga exponeringar direkt i den klimatkammare med lämplig bärare gasblandningen.
- Övervaka ändringar i fluorescens under exponeringsperioden. Utföra efterföljande injektioner som behövs. Ta stor omsorg inte att skifta skålen under injektioner, så att samma celler följs under hela tiden medan avbildas i samma fokalplan.
- Vid slutet av experimentet, exponera cellerna att lämpliga kontroller. För både genetiskt-kodade fluorogenic sensorer, lägga till särskilda koncentrationerna av föreningar känt att oxidera och minska dessa sensorer i en spetsig demonstration av lyhördheten proportionerlig. H2O2 och Ditiotreitol (DTT) fungera som lämpliga kontroller för att oxidera och minska både sensorer. Vanligtvis tillåter en slutlig koncentration på 100-1000 µM H2O2, följt av 1-5 mM Ditiotreitol (DTT), användaren att fullt oxidera och minska dessa sensorer.
- För dessa studier Använd 1 mM H2O2 följt av 5 mM DTT för att bestämma den maximala sensor svaren.
- Vänta minst 5 minuter för att sensorn att svara och sedan injicera reduktionsmedel, såsom DTT, att minska senor och returnera den till en nivå av fluorescens vid eller nära dess etablerade baslinjen.
Anmärkning: Användning av kontroller i det här steget är avgörande för normalisering och bör utföras i slutet av varje experiment för att fastställa det dynamiska omfånget av sensorn i varje cell. För roGFP2, kan aldrithiol också läggas i slutet av experimentet. Aldrithiol kringgår roGFP2 redox reläet för att oxidera sensorn direkt. Detta är användbart för att bedöma sensor funktion efter xenobiotiska exponering.
4. dataanalys
- Om inte redan etablerad, rita ROIs runt cellerna för att analyseras. Använd lämplig programvara för att mäta fluorescensintensiteten hos varje ROI på varje våglängd under hela tiden. Se till att cellerna inte flytta eller plattan inte skifta under körning.
Obs: Inrättandet av ROIs sker lättast genom att rita en sluten region som följer den fluorescerande uttrycksmönstret för varje cell. För att ytterligare hjälpa med denna process, kan en överförda ljus (eller brightfield) bilden av cellerna inom etablerade synfältet vara överlagras på fluorescerande bilden i ansträngningar att definiera cellgränserna. Användning av en överförda ljus bilden kräver dock användaren att fånga en ytterligare kanal (uppsättning bilder) under hela försöket. Alternativt, vissa tillverkare införliva algoritmer i deras bildbehandling programvara som använder specifika parametrar såsom intensitet trösklar för att etablera ROIs i en mer kvantitativ metod med mindre subjektiva. - Exportera data till önskat analysprogram (t.ex. elektroniska kalkylblad).
- Beräkna den proportionerlig sensor Svaren för varje ROI vid varje tidpunkt med hjälp av formlerna:
- För varje tidpunkt, den genomsnittliga beräknade proportionerlig värdena för alla ROIs.
- Beräkna baslinjen, som kommer att användas att normalisera data, av genomsnitt tidigare beräknat proportionerlig värdena (steg 4,4) samlas in före tillsats av xenobiotiska (t.ex. första fem-tiden pekar).
- Normalisera proportionerlig värdena från steg 4.4 genom att dividera varje värde av utgångsvärdet beräknas i 4.5. Normaliserade nyckeltal kommer centrum kring värdet 1 på baslinjen, medan ökningar EGSH eller H2O2 följande injektioner kommer att orsaka förhållandet att öka. Bedömningar av xenobiotiska att inducerar oxidativ förändringar tenderar att ge värden i ett intervall av 3 - 6 gånger utgångsvärdet.
- För att underlätta jämföra svaren inom och över experiment, uttrycka normaliserade data som en procentandel av maximal sensor svar genom att definiera svar på kontroll oxidationsmedlet (t.ex. 1 mM H2O2) 100%.
Obs: Om att uttrycka data som en procentandel av maximal sensor svar, det är viktigt att se till att samma koncentration av kontroll oxidationsmedlet används konsekvent över experiment. Alla data som härrör från live-cell bildanalys är mottagliga för konventionella parvisa och tredagars statistisk analys väljas efter bedömning av prövaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användning av roGFP2 och HyPer i att upptäcka förändringar i EGSH och intracellulära H2O2 har varit väl beskrev tidigare25,36,42,43 och demonstreras här. Confocal bilder av celler som uttrycker roGFP2 vid studiestart och följande tillägg av H2O2 och DTT visas i figur 2. Data från bilder som samlats in i hela experimentet var sedan exporteras och analyseras som beskrivs i avsnitt 4 i protokollet. Som visad, ger tillsats av EXOGEN H2O2 som positiv kontroll reproducerbara Svaren när data är normaliserad till deras respektive baslinjen och en definierad dynamiskt omfång fastställas genom tillägg av kända exogena oxidanter/reduktionsmedel (dvs H2O2 och DTT) (siffror 3, 4, och 5).
Svaren till toxikologiska stimuli är vanligtvis mer variabel än de som inducerats av kontroller. Detta förväntas kan, eftersom xenobiotiska föreningar kan ha pleiotropiska effekter på celler, alltifrån redox cykling till adduktion av intracellulära proteiner. Exempel på roGFP2 och HyPer svar induceras av exponering för toxiska 9,10-PQ, en oxiderande luftförorening som bildas av atmosfäriska reaktioner av fenantren44, presenteras i figurerna 6 och 7. Grafer i dessa siffror skildrar utvecklingen av varje steg som är involverade i dataanalysen som beskrivs i avsnitt 4 i protokollet. Som visad, minskar normalisering av varje cell till egen baslinje och positiv kontroll (figur 6B), intercellulära variationer i omfattningen av sensorn svaret från rådata(figur 6). I fall där variansen i den cellulära svaren är av intresse, kan normalisering av data utföras upp till denna punkt, med enskilda celler representeras av egna linjerna i diagrammet. Variationer i omfattningen eller kinetik av svaren bland celler i samma skålen kan avslöja viktiga mekanistiska insikter som återspeglar skillnader i cellcykeln, t.ex. Alternativt kan cellerna i skålen i genomsnitt svar presenteras tillsammans med standardavvikelsen (figur 6C). Annars, om replikat av separata experiment presenteras, data kan presenteras som normaliserade relativa fluorescens intensitetsvärdena eller en procentandel av den maximala svar som induceras av kontroll oxidationsmedlet (siffror 3, 4, 5, och 6 D), visar medelvärdet av alla replikat åtföljs av standardavvikelsen för medelvärdet. Omgivande luft föroreningar 9,10-PQ är kända för att vara en potent redox-apparat, som vi hypotes är ansvarig för de cykliska topparna av väteperoxid produktionen upptäcks av HyPer (figur 7) och stegvis EGSH ökar identifieras genom roGFP2 ( Figur 6 ( D).
Figur 1 . RoGFP2 glutation redox reläet. Glutation peroxidaser (GPx) oxiderar reducerat glutation (GSH) till GSSG svar på väteperoxid (H2O2), vilket ökar den glutation redox potential (EGSH). Den fluorogenic sensor roGFP2 balanserar med intracellulära EGSH när oxideras av glutaredoxin (Grx). I reduktiv väg katalyserar Grx minskning av roGFP2 genom deglutathionylation som GSSG nivåer minskar och normala nivåer av GSH är återupprättats av glutation-reduktas (GR) på bekostnad av NADPH. NADPH levereras av glukos via pentosjäsande fosfat vägen (PPP). Anpassad från Gibbs-Flournoy et al35. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Konfokalmikroskopi bilder av den mänskliga bronkiella epitelial cellen linje BEAS-2B uttrycker cytosoliska roGFP2. Cellerna var upplyst på 488 nm (A-D), följt av 404 nm (E-H). Bilderna visar fluorescens som avges på 510 nm för följande villkor: baslinje (A, E), 100 µM H2O2(B, F), 1 mM H2O2 (C, G)och 5 mM DTT (D, H). 60 X planerar Apo VC mål. Skala staplarna representerar 25 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 . Dosering beroende av förändringar i roGFP2 som induceras av H2O2 i BEAS-2B celler. Cellerna var jämviktas i 30 min i fenol-röd Gratis keratinocyter basala media (KBM) före exponeringar. Alla tillägg H2O2 inträffade efter en originalplan 5 min. roGFP2 fluorescens som avges på 510 nm samlades med en 525/30 nm band-pass filtrera efter laser excitation vid 404 och 488 nm. Cellulära svar var normaliserade till sina respektive baslinjen och maximal sensor svar efter tillägg av 1 mM H2O2. Värden presenteras som medelvärde ± medelfel, n = 3, där n består av ett genomsnitt på 5-10 oberoende celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Svar av glukos svultit BEAS-2B celler som uttrycker roGFP2 för olika doser av H2O2. Cellerna var jämviktas i 2 timmar i en minimal salt medium som inte innehåller glukos före exponeringar. Alla tillägg H2O2 inträffade efter en originalplan 5 min. roGFP2 fluorescens som avges på 510 nm samlades med en 525/30 nm band-pass filtrera efter laser excitation vid 404 och 488 nm. Cellulära svar var normaliserade till sina respektive baslinjen och maximal sensor svar efter tillägg av 1 mM H2O2. Värden presenteras som medelvärde ± standardavvikelsen, n = 3, där n består av ett genomsnitt på 5-10 olika celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Svar av BEAS-2B celler som uttrycker HyPer för olika doser av H 2 O 2 . Cellerna var jämviktas i 30 min i fenol-röd Gratis KBM före exponeringar. Alla tillägg H2O2 inträffade efter en originalplan 5 min. fluorescens som avges på 510 nm samlades med en 525/30 nm band-pass filtrera efter laser excitation vid 404 och 488 nm. Cellulära svar var normaliserade till sina respektive baslinjen och maximal sensor svar efter tillägg av 1 mM H2O2. Värden presenteras som medelvärde ± standardavvikelsen, n = 3, där n består av ett genomsnitt på 5-10 olika celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. 9,10-PQ-inducerad Svaren av BEAS-2B celler som uttrycker roGFP2. Cellerna var jämviktas i 30 min i fenol-röd Gratis KBM före exponering. Tillägg av 25 µM 9,10-PQ med blandning inträffade på 5 min, följt av tillägg av 1 mM H2O2 på 20 min och 5 mM DTT på 24 min. Panel A skildrar förhållandet råa roGFP2 av enskilda celler i skålen, varje cell som representeras av en separat rad. Panel B visar normalisering av värden från varje enskild cell till dess baslinjen sensor fluorescens, och i genomsnitt och standardavvikelse för denna data läggs ovanpå de enskilda normaliserade nyckeltal i Panel C. Procentandelen av maximal sensor svar i genomsnitt över alla celler är avbildad i panelen D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 . 9,10-PQ-inducerad Svaren av BEAS-2B celler som uttrycker HyPer. Cellerna var jämviktas i 30 min i fenol-röd Gratis KBM före exponering. Tillägg av 25 µM 9,10-PQ med blandning inträffade på 5 min, följt av tillägg av 1 mM H2O2 på 20 min och 5 mM DTT på 25 min. fluorescens som avges på 510 nm samlades med en 525/30 nm band-pass filtrera efter laser excitation vid 404 och 488 nm. Cellulära svar var normaliserade till sina respektive baslinjen och maximal sensor svar efter tillägg av 1 mM H2O2. Värden presenteras som medelvärdet av 5-10 olika celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användning av roGFP2 och HyPer att upptäcka förändringar i intracellulära EGSH och H2O2, respektive, har varit väl beskrivna i föregående fysiologiska och toxikologiska studier 25,35,36 ,39,40,41,42,43. Protokollet beskrivs här rapporterar ett effektivt sätt att genomföra dessa genetiskt-kodade redox sensorer i spetsiga toxikologiska studier för att bedöma xenobiotiska-inducerad störningar av intracellulära redox homeostas. Viktigast av allt, länkar korrekt användning av dessa sensorer några förändringar som observerats till en specifik redox par eller ROS (EGSH eller H2O2), slutligen klargöra bristande specificitet med många konventionella oxidativ stress metoder. I säkerställa kvaliteten på de data som genereras från dessa sensorer, några aspekter måste beaktas när man utformar experiment och analysera/tolka data. De omfattar: 1) användning av lämpliga kontroller, 2) kontroll av lämplig sensor svaren, och 3) manipulation av experimentella parametrar att klarlägga mekanismer. Av dessa tjänar tillägg av exogena H2O2 och DTT som kontroller i slutet av observationsperioden flera syften. Först, det ger en möjlighet att bedöma omfattningen av svaret till toxisk exponering i förhållande till maximal och minimal signalerna kan uppnås från sensorn. Detta är mest användbart i normalisera Svaren för jämförelser mellan experiment. Dessutom kan slutar experimentet med tillägg av stark exogena oxidationsmedel och reduktiv stimuli utvärdera effekten av den föregående exponeringen på sensor/relä integritet. Aldrithiol kan dessutom läggas till i slutet av körningen till förbifartsleden reläet och testa funktionaliteten i sensorn direkt för potentiella skador som exponeringen kan har tillfogat att fluorophore själv.
Precis som med andra tekniker, vid tillämpning av denna metod för den konkreta prövningen av toxikologiska resultat, är det viktigt att göra kvalitativa bedömningar angående riktigheten av de iakttagelser som gjorts. När du använder roGFP2 eller HyPer med någon ny xenobiotiska är det viktigt att först testa en rad doser, samtidigt som fluorescensintensiteten (510 nm utsläpp) från varje excitation våglängd (404 nm och 488 nm) ändras på lämpligt sätt (dvs. en ökning eller minska) för de redox senor som används. Målet är att identifiera en dos som en sensor svar detekteras, men är inte överväldigad av uppenbar manipulation av sensorn eller andra icke-specifika effekter av föreningen. Omedelbarhet eller skador på sensorn kan manifesteras som atypiska förändringar i fluorescens vid antingen excitation våglängd (488 eller 404 nm). I situationer där antingen sensorn har observerats att konsekvent bemöta olämpligt tillägg av en för människor över exponeringar, det rekommenderas att försöksledaren överväga undersöka experimentella parametrar i relation till dosimetri, cell livskraft, sensor uttryck eller optisk/kromatiska avvikelser av instrument som används för att följa svaren.
Som med några toxikologiska avläsning, de uppgifter som erhållits är oftast mer meningsfull när de observerade svaren är undersökt eller valideras med hjälp av en mekanistisk syn och experimentella begränsningar är ansedd. För detta ändamål kan flera experimentella parametrar kombineras med de inneboende egenskaperna hos sensorn användas för att generera robusta redox bedömningar. Utredningar som är specifika för användning av roGFP2 sensorn rör slutligen redox reläet genom vilken roGFP2 sinnen EGSH (figur 1). Reläet innebär intracellulära enzymer, inklusive glutaredoxin (Grx), glutation-reduktas (GR) och glutationperoxidas (GPx). Skillnader i endogena nivåerna av Grx över både cellulära fack och celltyper kan påverka mätningarna av EGSH och göra jämförelser mellan experiment svårt43. För att lösa problemet, en serie av ”fusion sonder” har syntetiserats, vilken länk det relevanta enzymet direkt till roGFP2 sensor. Mest nyligen, mänskliga Grx-1 var kopplad till roGFP2 av Gutscher och kollegor32 att bilda Grx1-roGFP2. Förutom att ha ett större dynamiskt omfång än roGFP1 och vara pH okänslig, kan Grx1-roGFP2 övervaka EGSH i celltyper eller delområden i som Grx verksamhet annars skulle vara begränsande. Skillnader i NADPH nivåer över celltyper eller även bland celler i samma skålen kan också bidra till variationer i roGFP2 svar. NADPH produceras från glukos via pentos-fosfat vägen, och kan utnyttjas av glutation-reduktas (GR) för att minska GSSG tillbaka till GSH (figur 1). Om celler i samma område börjar experimentet med olika reducerande kapacitet, kanske sin EGSH förändringar och resulterande roGFP2 Svaren till en stimulans inte enhetlig. Detta problem kan övervinnas genom en period av glukos svält innan experimentet, vilket utarmar cellulära NADPH bestånd och harmoniserar roGFP2 svar. En minskad kapacitet för EGSH återhämtning kan också ses i 25 µM H2O2 dosen i celler som var svältfödd på glukos jämfört med celler som kompletteras med normal glukos koncentrationer (figur 3 och 4). Thusly, kan manipulation av NADPH nivåer genom glukos svält fungera som ett sätt att kontrollera medverkan av flera relä komponenter i transducing effekten av en xenobiotiska exponering till sensorn. Ett annat bekymmer när du använder roGFP2 i toxikologiska sammanhang är risken för de xenobiotiska interagera direkt i oxiderande sensorn, snarare än genom redox reläet för att förändra EGSH. Direkt oxidation av roGFP2 kan bestämmas genom att sondera varje punkt av redox reläet och utvärdera dess effekt på signalen roGFP2. Ett exempel på denna teknik som använder ozon som stimulans demonstreras i studien av Gibbs-Flournoy et al 35.
För experiment med H2O2 sensor är oro som ovan inte så relevant eftersom domänen OxyR1 av HyPer sinnen H2O2 direkt i stället för genom en redox relä. Men till skillnad från roGFP2 är H2O2 sensor känslig för förändringar i pH, vilket kan orsaka förändringar i fluorescens inte kan tillskrivas H2O2 under ett experiment. Av denna anledning, användning av korrekt buffrade media, en klimatkammare att upprätthålla önskad temperatur och användning av fordonets reglage är avgörande för några experiment som utnyttjar H2O2 sensorn. Fluorogenic sensorer har dessutom utvecklats till särskilt övervaka pH, såsom pHRed, som avger fluorescens i den röda kanalen och kan tillsammans uttryckas i celler som uttrycker också HyPer45. Den idealiska pH-kontrollen för H2O2 sensorn är SypHer, som är en version av H2O2 sensorn som har en enda punktmutation som gör den oförmögen till känsla H2O2, ännu bevarar lyhördhet för pH 46. det har också observerats att celler som uttrycker H2O2 sensor kräver längre baslinjen temperera, särskilt efter transporteras från en inkubator till platsen för analys, under vilken de upplever smärre förändringar i media temperatur och pH. Det rekommenderas att förvärva minst 5 datapunkter efter baslinjen har stabiliserats innan du påbörjar någon exponering.
De sensorer som diskuteras i denna metod, roGFP2 och HyPer, är två av många fluorogenic sensorer som har en mängd nya tillämpningar inom toxikologi. Detta inkluderar sensorer för att upptäcka inte bara EGSH och H2O2, men peroxynitrit47, kväveoxid48,49, och även ozon50. Dessa sensorer kan utnyttjas i live-cell imaging studier att speciellt och övervaka känsligt de oxidativa arterna av intresse. Framstegen inom tekniker såsom spektrala minoriteter, det är också möjligt att samtidigt uttrycka två sensorer med liknande spektrala egenskaper (inom 5 nm från varandra) i samma cell, och separata andelen fluorescensen som avges av varje sensor51 . Denna teknik är av särskilt intresse för roGFP2 och HyPer, eftersom de inbegriper Magnetiseringar och utsläpp på samma våglängder. Som kortfattat nämns här, kan vissa sensorer riktas till specifika intracellulära fack, såsom mitokondrierna, att observera oxidativ evenemang av intresse. Medan dessa framväxande sensorer och tekniker är utanför ramen för denna metod, hänvisas till flera senaste publikationer om ämnet av intracellulära redox sensorer, till exempel översynen av löner och kollegor52. Användningen av genetiskt-kodade fluorogenic sensorer med live-cell imaging är en robust verktyg för övervakning av oxidativ Svaren under toxikologiska bedömningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Den forskning som beskrivs i denna artikel har granskats av den nationella hälso- och miljömässiga effekter Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, och godkänt för publicering. Innehållet i denna artikel skall inte tolkas för att representera byrån politik, och inte heller utgör omnämnande av varunamn eller kommersiella produkter godkännande eller rekommendation för användning.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Katelyn Lavrich för hjälp med experimentell design och manuskript redigeringar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
| HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |
References
- Cross, C. E., et al. Environmental oxidant pollutant effects on biologic systems: a focus on micronutrient antioxidant-oxidant interactions. Am J Respir Crit Care Med. 166, 44-50 (2002).
- Kobzik, L. Environmental particulate-mediated cytokine production in lung epithelial cells (A549): role of preexisting inflammation and oxidant stress. J Toxicol Environ Health. 55, 31-44 (1998).
- Jaeschke, H., McGill, M. R., Ramachandran, A. Oxidant stress, mitochondria, and cell death mechanisms in drug-induced liver injury: lessons learned from acetaminophen hepatotoxicity. Drug Metab Reviews. 44, 88-106 (2012).
- Wolf, M. B., Baynes, J. W. The anti-cancer drug, doxorubicin, causes oxidant stress-induced endothelial dysfunction. Biochim Biophys Acta. 1760, 267-271 (2006).
- Kumagai, Y., Shinkai, Y., Miura, T., Cho, A. K. The chemical biology of naphthoquinones and its environmental implications. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 52, 221-247 (2012).
- Pham, H. T., Maccarone, A. T., Campbell, J. L., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Ozone-induced dissociation of conjugated lipids reveals significant reaction rate enhancements and characteristic odd-electron product ions. J Am Soc Mass Spectrom. 24, 286-296 (2013).
- Abdel-Malek, Z. A., Kadekaro, A. L., Swope, V. B. Stepping up melanocytes to the challenge of UV exposure. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 171-186 (2010).
- Berisha, H., Pakbaz, H., Absood, A., Foda, H., Said, S. Nitric oxide mediates oxidant tissue injury caused by paraquat and xanthine oxidase. Ann N Y Acad Sci. 723, 422-425 (1994).
- Gao, X., et al. Mitochondrial dysfunction may explain the cardiomyopathy of chronic iron overload. Free Radic Bio Med. 49, 401-407 (2010).
- Shukla, A., et al. Asbestos induces mitochondrial DNA damage and dysfunction linked to the development of apoptosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 285, 1018-1025 (2003).
- Charles, R., Jayawardhana, T., Eaton, P.
- Thornalley, P. J., Rabbani, N. Detection of oxidized and glycated proteins in clinical samples using mass spectrometry-a user's perspective. Biochim Biophys Acta. 1840, 818-829 (2014).
- Arato, S., Ito, H., Miyashita, K., Hayakawa, K., Itabashi, Y. A facile method for the detection of aldehydes in oxidized lipids using solid-phase microextraction fiber and gas chromatograph equipped with a septum-free injector. J Oleo Sci. 58, 17-22 (2009).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840, 794-800 (2014).
- Churg, A., Keeling, B., Gilks, B., Porter, S., Olive, P. Rat mesothelial and tracheal epithelial cells show equal DNA sensitivity to hydrogen peroxide-induced oxidant injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 268, 832-838 (1995).
- Fraga, C. G., Oteiza, P. I., Galleano, M. In vitro measurements and interpretation of total antioxidant capacity. Biochim Biophys Acta. 1840, 931-934 (2014).
- Niki, E., Noguchi, N. Evaluation of antioxidant capacity: what capacity is being measured by which method. IUBMB Life. 50, 323-329 (2000).
- Pharikal, K., Das, P., Dey, C., Dasgupta, S. Tissue ascorbate as a metabolic marker in cadmium toxicity. Int J Vitam Nut Res. 58, 306-311 (1987).
- Tabata, M., Totani, M., Murachi, T. A chemiluminometric method for NADPH and NADH using a two-enzyme bioreactor and its application to the determination of magnesium in serum. Biomed Chrom. 4, 123-127 (1990).
- Ballatori, N., et al. Glutathione dysregulation and the etiology and progression of human diseases. Biol Chem. 390, 191-214 (2009).
- Nauseef, W. M. Detection of superoxide anion and hydrogen peroxide production by cellular NADPH oxidases. Biochim Biophys Acta. 1840, 757-767 (2014).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection and characterisation of radicals in biological materials using EPR methodology. Biochim Biophys Acta. 1840, 708-721 (2014).
- Kettle, A. J., et al. Measuring chlorine bleach in biology and medicine. Biochim Biophys Acta. 1840, 781-793 (2014).
- Carballal, S., Bartesaghi, S., Radi, R. Kinetic and mechanistic considerations to assess the biological fate of peroxynitrite. Biochim Biophys Acta. 1840, 768-780 (2014).
- Meyer, A. J., Dick, T. P.
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J Biol Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Malinouski, M., Zhou, Y., Belousov, V. V., Hatfield, D. L., Gladyshev, V. N. Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PloS One. 6, 14564 (2011).
- Guzman, J. N., et al. Oxidant stress evoked by pacemaking in dopaminergic neurons is attenuated by DJ-1. Nature. 468, 696-700 (2010).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nat Med. 20, 555-560 (2014).
- Wolf, A. M., Nishimaki, K., Kamimura, N., Ohta, S. Real-time monitoring of oxidative stress in live mouse skin. J Invest Dermatol. 134, 1701-1709 (2014).
- Mishina, N. M., et al. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally. Antioxid Redox Signal. , (2011).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nat Methods. 5, 553-559 (2008).
- Lohman, J. R., Remington, S. J. Development of a family of redox-sensitive green fluorescent protein indicators for use in relatively oxidizing subcellular environments. Biochem. 47, 8678-8688 (2008).
- Schafer, F. Q., Buettner, G. R. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic Bio Med. 30, 1191-1212 (2001).
- Gibbs-Flournoy, E. A., Simmons, S. O., Bromberg, P. A., Dick, T. P., Samet, J. M. Monitoring intracellular redox changes in ozone-exposed airway epithelial cells. Environ Health Perspect. 121, 312 (2013).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wood, Z. A., Poole, L. B., Karplus, P. A. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science. 300, 650-653 (2003).
- Sies, H. Role of Metabolic H2O2 Generation REDOX SIGNALING AND OXIDATIVE STRESS. J Biol Chem. 289, 8735-8741 (2014).
- Cheng, W. -Y., et al. Linking oxidative events to inflammatory and adaptive gene expression induced by exposure to an organic particulate matter component. Environ Health Perspect. 120, 267 (2012).
- Cheng, W. -Y., et al. An integrated imaging approach to the study of oxidative stress generation by mitochondrial dysfunction in living cells. Environ Health Perspect. , 902-908 (2010).
- Wages, P. A., et al. Role of H 2 O 2 in the oxidative effects of zinc exposure in human airway epithelial cells. Redox Biol. 3, 47-55 (2014).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E GSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radic Bio Med. 51, 1943-1951 (2011).
- Schwarzländer, M., Dick, T. P., Meyer, A. J., Morgan, B. Dissecting redox biology using fluorescent protein sensors. Antiox Redox Signal. 24, 680-712 (2016).
- Wang, L., Atkinson, R., Arey, J. Formation of 9, 10-phenanthrenequinone by atmospheric gas-phase reactions of phenanthrene. Atmos Environ. 41, 2025-2035 (2007).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: applications in neuroscience and regenerative biology. Biochim Biophys Acta. 1850, 2318-2328 (2015).
- Hou, J. -T., et al. A highly selective water-soluble optical probe for endogenous peroxynitrite. Chem Commun. 50, 9947-9950 (2014).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Gabe, Y., Ueno, T., Urano, Y., Kojima, H., Nagano, T. Tunable design strategy for fluorescence probes based on 4-substituted BODIPY chromophore: improvement of highly sensitive fluorescence probe for nitric oxide. Anal Bioanal Chem. 386, 621-626 (2006).
- Garner, A. L., et al. Specific fluorogenic probes for ozone in biological and atmospheric samples. Nat Chem. 1, 316-321 (2009).
- Cheng, W. -Y., Larson, J. M., Samet, J. M. Monitoring intracellular oxidative events using dynamic spectral unmixing microscopy. Methods. 66, 345-352 (2014).
- Wages, P. A., Cheng, W. -Y., Gibbs-Flournoy, E., Samet, J. M. Live-cell imaging approaches for the investigation of xenobiotic-induced oxidant stress. Biochim Biophys Acta. 1860, 2802-2815 (2016).
