Summary
Dit manuscript beschrijft het gebruik van genetisch-gecodeerde fluorogenic verslaggevers in een toepassing voor live-cel imaging voor de behandeling van xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve stress. Deze experimentele aanpak biedt ongeëvenaarde Spatio resolutie, gevoeligheid en specificiteit terwijl het vermijden van veel van de tekortkomingen van conventionele methoden voor de detectie van toxicologische oxidatieve stress.
Abstract
Hoewel oxidatieve stress een vaak geciteerde toxicologische mechanisme is, conventionele methoden te bestuderen, lijden aan een aantal tekortkomingen, met inbegrip van de vernietiging van het monster, invoering van potentiële artefacten, en een gebrek aan specificiteit voor de reactieve betrokken soort. Dus, is er een huidige behoefte op het gebied van toxicologie aan niet-destructieve, gevoelige en specifieke methoden die kunnen worden gebruikt om te observeren en te kwantificeren van intracellulaire redox verstoringen, beter bekend als oxidatieve stress. Hier presenteren we een methode voor het gebruik van twee genetisch-gecodeerde fluorogenic sensoren, roGFP2 en HyPer, om te wonen-cel beeldvormende onderzoeken te observeren xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve reacties worden gebruikt. roGFP2 equilibrates met de glutathion redox potentiële (EGSH), terwijl HyPer direct detecteert waterstof peroxide (H2O2). Beide sensoren kunnen worden uitgedrukt in verschillende celtypen via transfectie of signaaltransductie, en kunnen op specifieke cellulaire compartimenten worden gericht. Bovenal biedt live-cel microscopie met behulp van deze sensoren hoge ruimtelijke en temporele resolutie thats niet mogelijk met behulp van conventionele methoden. Wijzigingen in de intensiteit van de fluorescentie op 510 nm fungeert als de uitlezing voor beide genetisch-gecodeerde fluorogenic sensoren als opeenvolgend opgewonden door 404 bewaakt nm en 488 nm licht. Deze eigenschap maakt beide sensoren ratiometric, elimineren van gemeenschappelijke microscopie artefacten en corrigeren voor verschillen in sensor expressie tussen cellen. Deze methode kan worden toegepast op een verscheidenheid van fluorimetrische platforms geschikt voor spannende en verzamelen emissies bij de voorgeschreven golflengten, waardoor het geschikt is voor gebruik met confocal beeldvormingssystemen, conventionele breed-gebied microscopie en plaat lezers. Beide sensoren genetisch-gecodeerde fluorogenic zijn gebruikt in een verscheidenheid van celtypes en toxicologisch onderzoek cellulaire EGSH en H2O2 generatie in realtime te volgen. Hier geschetst is een gestandaardiseerde methode die is sterk aan te passen op celtypes en fluorimetrische platforms voor de toepassing van roGFP2 en HyPer bij live-cel toxicologische beoordeling van oxidatieve stress.
Introduction
De term "oxidatieve stress" wordt vaak aangehaald als een mechanisme in de toxicologie, maar is zelden deze term specifiek beschreven. Oxidatieve stress kan verwijzen naar verschillende intracellulaire processen, met inbegrip van de generatie van reactieve zuurstof soorten, schade veroorzaakt door vrije radicalen, de oxidatie van antioxidant moleculen, en zelfs de activering van specifieke signalering cascades stroomt. Een breed scala van milieucontaminanten1,2 en farmaceutische agenten3,4 zijn gedocumenteerd te induceren oxidatieve stress door beide directe actie van de xenobiotische compound zelf5 ,6 of subsidiair door productie van oxidant soorten als onderdeel van een cellulaire respons7,8,9,10. Het is daarom van groot belang in de toxicologie nauwkeurig observeren en karakteriseren van de oxidatieve processen die leiden tot negatieve resultaten. Conventionele methodes voor het meten van oxidatieve stress betrekken identificatie van geoxideerde biomoleculen11,12,13,14,15 of antioxidanten16 ,17,18,19,20, of directe meting van reactieve soorten zelf21,22,23, 24. Deze methoden vereisen echter meestal cellulaire ontwrichting, die vaak verbruikt het monster, elimineert ruimtelijke resolutie, en introduceert potentieel artefacten25. De ontwikkeling van meer gevoelige en specifieke methoden voor de detectie van oxidant soorten en markers voor oxidatieve stress geldt in grote lijnen voor het onderzoek van de schadelijke effecten van xenobiotische blootstelling.
Live-cel microscopie met behulp van een nieuwe generatie van genetisch-gecodeerde fluorogenic sensoren heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor de monitoring van de intracellulaire redox-status van levende cellen. Deze sensoren worden meestal uitgedrukt met behulp van een vector onder de controle van een virale promotor die wordt ingevoerd via transfectie of transductie methodologieën. Hoge expressie efficiëntie zijn niet nodig, aangezien de cellen uiten de fluorescerende sensor kunnen gemakkelijk worden visueel geïdentificeerd. Voor de beoordeling van het toxicologische, kunnen cellen uiten deze sensoren worden waargenomen met behulp van fluorescentie microscopie als ze worden blootgesteld aan xenobiotische verbindingen in real-time. Deze proefopzet toelaat herhaalde metingen in dezelfde cel, waardoor de gevestigde basislijn van elke cel om op te treden als haar eigen controle. De hoge temporele resolutie geboden door live-cel imaging is geschikt voor het opsporen van oxidatieve gebeurtenissen, met name degenen die bescheiden in omvang of aard van voorbijgaande aard zijn. Naast het feit dat zowel de specifieke als de gevoelige naar hun doel-moleculen, kan de fluorescentie van enkele van deze sensoren worden opgewekt met behulp van twee golflengten van licht. Dit verschijnsel kan de fluorescerende uitstoot moet worden uitgedrukt als een ratio die het mogelijk het onderscheidingsvermogen van signaal veranderingen geassocieerd met authentieke sensor reacties van die veroorzaakt door artefacten zoals variaties in cel dikte, expressie van de sensor, lamp maakt intensiteit, photobleaching en gevoeligheid van de detector fluorescentie26. Een ander voordeel van het gebruik van fluorogenic sensoren is dat ze kunnen worden gericht aan specifieke cellulaire compartimenten, een mate van ruimtelijke resolutie die is ongeëvenaard door conventionele methoden25,26,27.
Een grote familie van genetisch-gecodeerde sensoren op basis van groen fluorescent proteïne (GFP) zijn ontwikkeld en gekenmerkt verslag over een breed scala van fysiologische markers, inclusief pH, temperatuur, concentraties van de calcium en de verhouding van de ATP/ADP25 ,28,29,30,31. Opgenomen onder deze zijn de sensoren van de glutathion redox potentiële (EGSH) en waterstof peroxide (H2O2). Terwijl deze sensoren werden ontwikkeld voor toepassingen in redox biologie en fysiologie, zijn ze ook aangepast om te studeren xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve stress. In het bijzonder beschrijft het hier geschetste protocol het gebruik van de roGFP2 van de sensor EGSH en de H2O2 sensor HyPer.
roGFP2 rapporteert over het redoxpotentiaal van intracellulaire verminderde en geoxideerd glutathion (GSH/GSSG) via een redox-Relais met glutathion peroxidase (GPx), glutaredoxin (Grx) en glutathionreductase (GR) (Figuur 1)25, 32 , 33. Glutathion is de overheersende cellulaire antioxidant molecule en vooral in zijn gereduceerde vorm (GSH) in millimolar concentraties in het cytosol25,34aanwezig is. Terwijl EGSH is niet gekoppeld aan een functionele uitkomst, wordt dat herkend als een belangrijke indicator voor de status van de intracellulaire oxidatieve34. Een relatief kleine stijging van de concentratie van GSSG leidt tot een toename in EGSH , die kan worden opgespoord door roGFP2. Even belangrijk, toezicht op EGSH met behulp van roGFP2 tijdens xenobiotische belichtingen kan potentieel onthullen veel over het werkingsmechanisme op verschillende punten in de redox-estafette en bijbehorende studierichtingen, zoals de pentose fosfaat shunt (Figuur 1 )35. De tweede sensor hier besproken, HyPer, is een intracellulair H2O2 sonde afgeleid van het inbrengen van gele fluorescerende eiwit (YFP) in het regelgevend domein van bacteriële H2O2-gevoelige transcriptie factor OxyR136. Hoewel het is eerder beschouwd als een schadelijke reactieve zuurstof tussenliggende, wordt H2O2 steeds meer erkend als een belangrijk intracellulaire signalering molecuul onder fysiologische omstandigheden37, 38, suggereren dat niet-herkende rollen voor H2O2 in de toxicologie ook bestaan. Bijvoorbeeld, zou overtollige H2O2 -geïnduceerd door een xenobiotische blootstelling een voorloper van disregulatie in cellulaire signalering of een verschuiving in de Bioenergetica.
Beide sensoren genetisch-gecodeerde fluorogenic geuit in verschillende bestaande cellijnen, met inbegrip van de menselijke epidermoïde carcinoom cellijn A431 en de menselijke bronchiale epitheliale cellijn BEAS-2B, te observeren veranderingen in EGSH en H2 O2 in reactie op een verscheidenheid van toxicologische risico's. Het gaat hierbij om verontreinigende gassen (ozon35), oplosbare onderdelen van zwevende deeltjes (1,2 Naftochinon39,40 en zink41) en nikkel nanodeeltjes (niet-gepubliceerde gegevens). Deze studies zijn slechts een klein gedeelte van de mogelijke toepassingen van deze twee sensoren. Theoretisch, kan elk celtype die kan ontvangen en het uiten van het DNA van deze sensoren via conventionele moleculaire biologietechnieken worden gebruikt om te beoordelen van de effecten van xenobiotica verdacht te veranderen de cellulaire oxidatieve toestand. Tot op heden, heeft een of meer van deze sensoren geuit in diverse prokaryoten en eukaryoten, met inbegrip van verschillende zoogdieren, plant, bacteriële en gist cel typen25,26,36,,42. De uitlezing voor zowel EGSH en H2O2 sensoren is een verandering in de intensiteit van de fluorescentie uitgezonden bij 510 nm na excitatie met 488 en 404 nm licht. Deze methode is zeer aanpasbaar op fluorimetrische platforms, waaronder verschillende soorten van de microscopie (confocale en breed-gebied) en de lezers van de plaat. De methode die hier wordt gepresenteerd zorgt voor gevoelige en specifieke waarneming van intracellulaire EGSH en H2O2 in in vitro toxicologische systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van cellen
Opmerking: Deze procedure wordt beschreven op de lentivirale transductie van een vereeuwigd cellijn (BEAS-2B; ATCC, Manassas, VA) wil de gewenste verslaggever (roGFP2 of HyPer). Andere lijnen/celtypes en/of methoden van genenoverdracht, met inbegrip van transfectie, kunnen worden gebruikt, zolang zij leiden een niveau van verslaggever expressie voldoende tot te visualiseren van een voldoende aantal cellen per gezichtsveld (gewoonlijk 5-10 cellen) sensor-uiten. Als met behulp van transfectie methoden de procedure moet worden uitgevoerd in de schotel die uiteindelijk zal worden gebruikt voor de analysemethode (bijvoorbeeld de cellen in de dezelfde schotel die zal worden voorgelegd aan de Microscoop transfect). De hieronder beschreven stappen vindt u informatie voor het voorbereiden van de cel transductions moet worden uitgevoerd in een 6-well cel cultuur plaat. Als deze indeling niet een geschikte grootte voor de gewenste toepassing is, kunnen andere schepen worden vervangen.
- Cellen groeien tot ongeveer 40-60% samenkomst in normale groeiomstandigheden en media.
Opmerking: Deze studie gebruikt de menselijke bronchiale epitheliale cellijn, BEAS-2B, gegroeid in Keratinocyt groeimedium (kg m). - Vlak voor signaaltransductie, door de media van de groei van de cellen te vervangen door 500 µL van de serum-vrije media met de juiste hoeveelheid virus, zoals berekend door de formule:
- Gebruik voor signaaltransductie van cellen van de BEAS-2B, serumvrij Keratinocyt Basaal medium (KBM) ter vervanging van de kg m groei media tijdens virale incubations.
Opmerking: De bovenstaande berekening is voor een enkele transductie van één putje van cellen in een 6-well-indeling. Desgewenst voeren transductions van verschillende putten kunnen worden uitgevoerd door de formule met een vermenigvuldiging van het aantal putten te worden getransduceerde aan te passen. Voor lentivirale transductions, gebruikt u een veelheid van infectie (MOI) tussen 5 en 20. Voor adenovirale transductions, gebruikt u een MOI tussen 100 en 500.
- Gebruik voor signaaltransductie van cellen van de BEAS-2B, serumvrij Keratinocyt Basaal medium (KBM) ter vervanging van de kg m groei media tijdens virale incubations.
- Incubeer de cellen met de virale mengsel bij 37 ° C gedurende 4 uur, herverdeling van de virale deeltjes in de schotel elke 30 tot 60 min met een korte rockende of wervelende beweging.
- 1 mL van de volledige groei media toevoegen aan de schotel en Incubeer bij 37 ° C voor een extra 4-16 h.
- Verwijder alle media en vervangen door nieuwe volledige groei media.
- Blijven groeien en passage van de cellen, zo nodig uit te breiden.
Opmerking: Cellen moeten gaan aanzienlijk het uitdrukken van de sensor binnen 12-48 uur. Als een lentivirale vector werd gebruikt voor de signaaltransductie, moet stabiele expressie van de gewenste sensor blijven over passages. - Voor microscopie gebaseerde evaluaties, zaad-cellen in glazen bodem Microscoop gerechten en groeien tot gewenste samenkomst (≥70 - 80%) voorafgaand aan de beeldvorming.
Opmerking: Zaaien dichtheid zal afhangen van de grootte van de schotel, groeitempo op jaarbasis van de cel-lijn wordt gebruikt en het tijdstip van de beoordeling na zaaien. Bijvoorbeeld, zaad 300.000 BEAS-2B cellen in een 35-mm schotel aan opbrengst van ongeveer 70-80% samenvloeiing na 1 dag van groei.
2. microscopie Set-up
Opmerking: Het protocol die hieronder beschreven wordt uitgevoerd met behulp van een confocal microscoop uitgerust met laserlijnen op 404 en 488 nm. Andere middelen van het maken van de fluorimetrische analyses van de sensoren beschreven binnen dit protocol op hun voorgeschreven excitaties/emissie moeten ook levensvatbare gegevens opleveren. Bovenal kunnen apparatuur instellingen sterk variëren afhankelijk van het type, de leeftijd en de conditie van het instrument wordt gebruikt; Dus, de genoemde waarden voor elke instrument mogelijk niet specifiek zijn voor de apparatuur die wordt gebruikt in andere laboratoria.
- Uitvoeren van alle imaging analyse met behulp van milieucontroles te handhaven op een passende temperatuur (bv. 37 ° C), vochtigheid (meestal > 95% relatieve vochtigheid), en/of de concentratie (bijvoorbeeld, 5% CO2) geschikt voor de cellen in de hele gas de duur van het experiment.
- Als het gebruik van hoge waarden van relatieve vochtigheid, houden alle oppervlakken die in contact met de bevochtigde sfeer kunnen komen (bv., de doelstelling van de Microscoop) op of iets boven de temperatuur waarbij de luchtvochtigheid wordt gegenereerd om te voorkomen dat condens. Dit kan worden bereikt met het gebruik van een objectieve kachel en/of verwarming tape en een passende kachel-besturingselement.
- Alle onderdelen van de Microscoop inschakelen en instellen van alle nodige materiaal voor sequentiële excitatie op 488 en 404 nm met emissie bij 510 nm. Zorgen dat alle onderdelen van de optische configuratie correct zijn ingesteld voor real-time acquisitie.
- Instellen van een etappe-top milieu kamer te handhaven constante temperatuur bij 37 ° C, 5% CO2 sfeer, en > 95% vochtigheid. Vóór het opstarten Beeldacquisitie, equilibreer het milieu kamer gedurende ten minste 10 minuten na de eerste opzet van alle milieucontrole.
Opmerking: Omgevingsomstandigheden kunnen worden geëlimineerd of aangepast afhankelijk van de lengte van het experiment, celtype en blootstelling wordt gebruikt. - Plaats de schotel van cellen (stap 1.7) op de podium-top binnen het milieu kamer.
- Met de gewenste objectief, zoek het brandvlak van cellen met behulp van het oculair en wit licht en controleer van normale morfologie.
Opmerking: Een 1.4 NA 60 X violet-gecorrigeerd, objectief olie-ondergedompeld wordt vaak gebruikt, waarmee identificatie van intracellulaire compartimenten terwijl het maximaliseren van de optische resolutie van de confocal systeem. - Controleer de fluorescentie-expressie voor de cellen in het gezichtsveld. Doen terwijl het visualiseren van de cellen onder het breed-gebied fluorescentie verlichting met een juiste filter set, zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC). Op dit punt, het gebruik van breed-gebied belichting terwijl kijkend door het oculair handiger, is omdat het gemakkelijker om de schotel te selecteren van een gebied van cellen te bestuderen. In het algemeen, kies een gezichtsveld dat ten minste 5 tot 10 cellen die zijn uiting van de sensor, bevat zoals aangegeven door groene fluorescentie.
- Als alternatief, het uitvoeren van deze beoordeling confocally met behulp van laser excitatie bij een golflengte die meest compatibel is met de sensor wordt uitgedrukt (488 nm werkt meestal het beste).
Opmerking: Vanwege hun intrinsieke fluorescerende eigenschappen, het zal moeilijker worden om te visualiseren cellen uiten HyPer dan die waarin roGFP2 met behulp van beide FITC of op 488 nm. Het moet nog wel mogelijk om te zien van vaag cellen.
- Als alternatief, het uitvoeren van deze beoordeling confocally met behulp van laser excitatie bij een golflengte die meest compatibel is met de sensor wordt uitgedrukt (488 nm werkt meestal het beste).
- Zodra een gewenste gezichtsveld wordt gevonden, sluit de milieu kamer.
Opmerking: Gebruik de behoud van focus functie, vaak beschikbaar op geavanceerde Microscoop stands, ter vergemakkelijking van de handhaving van een stabiele brandvlak tijdens de studie. - Overname parameters instellen om optimale beoordeling van de sensor van belang over de gewenste blootstellingsperiode. Hieronder volgen aanbevelingen en benaderingen voor de beeldvorming van de confocal van sensor Reacties:
- Aanpassen van de kracht van de laser voor excitatie op 488 nm en emissie bij 510 nm. Kies een laser energieniveau waarmee visualisatie van de cellen en houden dit constant tussen monsters of repliceren gerechten.
Opmerking: Deze studie, 12% en 1,5% laser macht werden gebruikt voor de 488 en 404 nm laserlijnen, respectievelijk. - Gebruik van de confocal besturingselementen van de acquisitie software om ervoor te zorgen dat het geselecteerde brandvlak is geoptimaliseerd voor maximale fluorescentie emissie-intensiteit in het midden van de cellen (z-as) door het scannen van 488 nm terwijl u aanpast het z-vlak. Dit is gemakkelijker gemaakt met behulp van de instelling van een hoge winst tijdens het zoeken naar het z-vlak dat in de meest overbelicht cellen resulteert. Zodra het juiste brandvlak is gebleken, keren de winst naar een instelling die is het meest optimaal voor de fluorescentie van de verslaggever wordt gebruikt zonder oversaturating van de pixels in acht worden genomen.
Opmerking: De instellingen van de laser en winst die geschikt zijn voor het vinden en observeren van cellen tijdens experimenten is volledig afhankelijk van de confocal systeem wordt gebruikt. In het algemeen, zodra de cellen in het gezichtsveld gevonden, het wordt aanbevolen dat een minimale hoeveelheid laser stroom gebruikt (gewoonlijk ≤20%), zoals overmatige scannen van cellen met behulp van high-powered laserlicht oxidatieve veranderingen waarneembaar door de sensor veroorzaken. - Gebruik de winst om te fine-tunen van de fluorescentie van de basislijn. Met roGFP2, tot stand brengen de basislijn in de buurt van de bovengrens (≈ 90% relatieve intensiteit) van het instrument zonder overmatige verzadiging, als deze cellen 510 nm fluorescentie geïnduceerd door 488 nm excitatie verliezen zal wanneer EGSH stijgt. In tegenstelling, de intensiteit van de fluorescentie met 488 nm excitatie moet laag (≈ 10% relatieve intensiteit) op basislijn voor HyPer uiting van cellen, aangezien deze cellen de intensiteit van de fluorescentie 510 nm krijgt wanneer H2O2 wordt gedetecteerd.
- Herhaal stap 2.9.2 en 2.9.3 met excitatie op 404 nm en emissie bij 510 nm. Winst instellingen voor de 404 nm excitatie golflengte zijn tegengesteld aan die worden gebruikt met 488 nm excitatie voor elke sensor (dat wil zeggen, lage basislijn fluorescentie (≈ 10% relatieve intensiteit) bij 404 nm voor de roGFP2, hoge basislijn fluorescentie (≈ 90% relatieve intensiteit) voor de H2 O2 sensor).
Opmerking: In het algemeen, de fluorescentie (510 emissie) bij 404 nm excitatie worden aanzienlijk lager ligt dan dat verkrijgbaar met 488 nm excitatie in cellen een relatief kleine excitatie maximale voor beide van deze uiting van zowel roGFP2 en HyPer, als de 404 nm piek is sensoren.
- Aanpassen van de kracht van de laser voor excitatie op 488 nm en emissie bij 510 nm. Kies een laser energieniveau waarmee visualisatie van de cellen en houden dit constant tussen monsters of repliceren gerechten.
3. data-acquisitie
- Instellen dat de acquisitie software sequentieel prikkelen de twee excitatie golflengten (eerste 488 nm en vervolgens 404 nm) en verzamelen van uitstoot voor zowel op 510 nm bij een vooraf bepaald tijdsinterval in de gewenste lengte van het experiment (bijvoorbeeld vastleggen beelden elke 60 s voor 60 min).
- Als alternatief, verwerven afbeeldingen handmatig voor en na blootstelling als het geschatte tijdstip van wijzigingen in EGSH of H2O2 staan bekend om de xenobioticum wordt getest. Dit kan echter leiden tot een verlies aan temporele resolutie.
- Minstens 5-10 sensor-uiten cellen selecteert in het veld voor real-time beoordeling van experimentele parameters, en hen vast te stellen als de regio's van belang ("ROIs") om te controleren hun fluorescentie wijzigingen tijdens het experiment.
Opmerking: Deze stap is optioneel, en na het experiment kan worden uitgevoerd als directe observatie in real time ongewenste of software beperkingen die voorkomen continue monitoring dat. Afhankelijk van de cel bevolking, kan de selectie van cellen als ROIs uiten sensor een reeks expressie niveaus vertegenwoordigen in cellen.- Voeg de milieu toxische 9,10-phenanthrenequinone (9,10-PQ) of de waterstof peroxide (H2O2) na een periode van 5-min basislijn voor deze studies.
- Bereiden alle reagentia voor later gebruik in dit protocol. 9,10-PQ in dimethylsulfoxide (DMSO) tot een concentratie van 15 mM oplossen en verdunnen in basale cel media een 250 µM werkende oplossing opleveren. Daarnaast bereiden een werkende oplossing van waterstofperoxide in water dat een eindconcentratie van 1mM na injectie zal opleveren.
- Zodra de experimentele parameters zijn gedefinieerd, beginnen de tijd loop-acquisitie. Vast een basislijn periode van minstens 5 min (of 5 gegevenspunten) vóór het opstarten van xenobiotische posities.
- Blootstellen van de cellen aan de veroorzaken onderzocht met behulp van conventionele benaderingen voor in vitro doseren. Bereiden van oplosbare stoffen in water of andere geschikt oplosmiddel en injecteren rechtstreeks in de media.
- Als organische oplosmiddelen (bijv dimethylsulfoxide of ethanol) vereist zijn, houden de eindconcentratie oplosmiddel op of beneden 0,1%. Controleer of dat het oplosmiddel niet een effect op de EGSH of H2O2 productie met de controle van een voertuig in een aparte schaal van cellen produceert.
- Voor verbindingen met lagere oplosbaarheid, toevoegen een mengen stap met behulp van een micropipet bij het protocol na de injectie wordt gemaakt. Pomp gasvormige posities rechtstreeks in het milieu kamer met behulp van de juiste vervoerder gasmengsel.
- Monitor veranderingen in fluorescentie tijdens de periode van blootstelling. Latere injecties desgewenst uitvoeren Neem grote zorg niet te verschuiven van de schotel tijdens injecties, zodat dezelfde cellen worden gevolgd in de loop van de hele tijd terwijl het beeld in de dezelfde brandvlak.
- Aan het einde van het experiment, de cellen aan passende controles worden blootgesteld. Toevoegen voor beide genetisch-gecodeerde fluorogenic sensoren, specifieke concentraties van stoffen bekend om te oxideren en deze sensoren in een puntige demonstratie van hun ratiometric reactievermogen verminderen. H2O2 en dithiothreitol (DTT) dienen als passende controles te oxideren en beide sensoren te verminderen. Typisch, een eindconcentratie van 100-1000 µM H2O2, gevolgd door de 1-5 mM dithiothreitol (DTT), kan de gebruiker volledig te oxideren en verminderen van deze sensoren.
- Voor deze studies, 1 mM H2O2 gevolgd door 5 mM DTT te gebruiken om te bepalen van de maximale sensor reactie.
- Wacht ten minste 5 min zodat de sensor te reageren en vervolgens injecteren een reductiemiddel, zoals DTT, te verminderen de senor en terug te sturen naar een niveau van fluorescentie op of in de buurt van de gevestigde basislijn.
Opmerking: Het gebruik van besturingselementen in deze stap is cruciaal voor normalisatie, en moet worden uitgevoerd aan het einde van elk experiment om te bepalen van het dynamisch bereik van de sensor in elke cel. Voor roGFP2, kunnen aldrithiol ook worden toegevoegd aan het einde van het experiment. Aldrithiol omzeilt de roGFP2 redox estafette om de sensor direct oxideren. Dit is handig voor het beoordelen van de sensor-functie na xenobiotische blootstelling.
4. de gegevensanalyse
- Als niet reeds, tekent u ROIs rond de cellen die moeten worden geanalyseerd. Gebruik de juiste software voor het meten van de intensiteit van de fluorescentie van elke ROI bij elke golflengte in de tijdsverloop. Zorgen ervoor dat de cellen niet bewoog of de plaat niet tijdens de run verschuiven deed.
Opmerking: De oprichting van ROIs is meest eenvoudig te realiseren door het opstellen van een ingesloten gebied die volgt op de TL-expressiepatroon van elke cel. Als u wilt verder helpen bij dit proces, kan een doorvallend licht (of helderveld) beeld van de cellen binnen het gezichtsveld van de gevestigde in inspanningen om celgrenzen te definiëren op de fluorescerende beeld worden bedekt. Echter vereist het gebruik van een doorvallend licht beeld de gebruiker om te vangen een extra kanaal (set van beelden) in de loop van het experiment. U kunt ook integreren bepaalde fabrikanten algoritmen hun beeldbewerkingssoftware waarmee specifieke parameters zoals intensiteit drempels vast te stellen van ROIs in een meer kwantitatieve, minder subjectief, methode. - De gegevens exporteren naar gewenste analysesoftware (bijvoorbeeld elektronische spreadsheet).
- De reactie van de sensor ratiometric voor elke ROI op elk punt van de tijd met de formules berekenen:
- Voor elk punt van tijd, gemiddelden de berekende ratiometric van alle ROIs.
- De waarde van de basislijn, die worden gebruikt voor het normaliseren van de gegevens, door het gemiddelde van de waarden (stap 4.4) van de eerder berekende ratiometric verzameld vóór toevoeging van de xenobioticum (bijvoorbeeld de eerste vijf-tijd punten) te berekenen.
- De waarden van de ratiometric uit stap 4.4 normaliseren door elke waarde door de waarde van de basislijn berekend in 4.5 te delen. Genormaliseerde verhoudingen zal centrum rond een waarde van 1 op de basislijn, terwijl de stijgingen van de EGSH of H2O2 volgende injecties zal leiden tot de ratio te verhogen. Evaluaties van xenobioticum die oxidatieve veranderingen veroorzaken de neiging om de opbrengst van de waarden in een bereik van 3 - 6 keer de waarde van de basislijn.
- Om te helpen bij het vergelijken van reacties binnen en tussen experimenten, express-de genormaliseerde gegevens als een percentage van de maximale sensor reactie door het definiëren van het antwoord op de controle oxidator (bijvoorbeeld 1 mM H2O2) als 100%.
Opmerking: Als uiting van gegevens als een percentage van de maximale sensor reactie, het is cruciaal om ervoor te zorgen dat dezelfde concentratie van de controle-oxidant consequent wordt gebruikt in experimenten. Alle gegevens die zijn afgeleid van live-cel imaging analyse is vatbaar voor conventionele paarsgewijse en group-wise statistische analyse worden gekozen ter beoordeling van de onderzoeker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gebruik van roGFP2 en HyPer bij de opsporing van wijzigingen in EGSH en intracellulaire H2O2 geweest goed beschreven eerder25,36,,42,43 en hier wordt gedemonstreerd. Confocale beelden van cellen uiten van roGFP2 op de basislijn en de volgende toevoeging van H2O2 en DTT zijn afgebeeld in Figuur 2. Gegevens uit afbeeldingen verzameld gedurende het gehele experiment werden vervolgens geëxporteerd en geanalyseerd zoals beschreven in sectie 4 van het protocol. Zoals aangetoond, produceert de toevoeging van exogene H2O2 als positieve controle reproduceerbare reacties wanneer de gegevens worden genormaliseerd op hun respectieve basislijn en een dynamisch gedefinieerd bereik is bewezen door toevoeging van bekende exogene oxidanten/reductants (dat wil zeggen, H2O2 en DTT) (figuren 3, 4, en 5).
Reacties op toxicologische stimuli zijn meestal meer variabel dan die veroorzaakt door besturingselementen. Dit is te verwachten, zoals xenobiotische verbindingen kunnen pleiotropic gevolgen voor cellen hebben, variërend van redox fietsen naar adductie van intracellulaire eiwitten. Voorbeelden van roGFP2 en HyPer reacties veroorzaakt door blootstelling aan de toxische 9,10-PQ, een oxiderende luchtvervuiler gevormd door atmosferische reacties van Fenantreen44, worden gepresenteerd in de figuren 6 en 7. De grafieken in deze cijfers tonen de progressie van elke stap die betrokken zijn bij de gegevensanalyse die worden beschreven in sectie 4 van het protocol. Zoals aangetoond, vermindert normalisering van elke cel aan haar eigen basislijn en de positieve controle (Figuur 6B), intercellulaire variabiliteit in de omvang van het antwoord van de sensor van de onbewerkte gegevens (Figuur 6A). In gevallen waarin de afwijking in de cellulaire reactie van belang is, kan normalisering van de gegevens worden uitgevoerd tot op dit punt, met afzonderlijke cellen vertegenwoordigd door hun eigen lijnen op de grafiek. Variatie in de omvang of de kinetiek van de reacties onder de cellen in de dezelfde schotel kan het onthullen van belangrijke mechanistische inzichten die verschillen in de celcyclus, bijvoorbeeld weerspiegelen. Anderzijds is de gemiddelde respons van de cellen in de schaal kan worden gepresenteerd samen met de standaarddeviatie (Figuur 6C). Anders, als wordt gerepliceerd van afzonderlijke experimenten worden gepresenteerd, de gegevens kan worden gepresenteerd als de intensiteitswaarden van de genormaliseerde relatieve fluorescentie of een percentage van de maximale respons geïnduceerd door de controle-oxidant (figuren 3, 4, 5, en 6 D), toont het gemiddelde van alle replicatieonderzoeken vergezeld gaan van de standaardfout van het gemiddelde. De omgevingslucht verontreinigingen 9,10-PQ is bekend als een krachtige redox-cycler, die wij veronderstellen is verantwoordelijk voor de cyclische pieken van waterstofperoxide productie gedetecteerd door HyPer (Figuur 7) en stapsgewijze EGSH verhoogt gedetecteerd door roGFP2) Figuur 6 D).
Figuur 1 . De roGFP2 glutathion redox estafette. Glutathion Peroxidasen (GPx) oxideren gereduceerd glutathion (GSH) om GSSG in reactie op waterstof peroxide (H2O2), waardoor de glutathion redox potentiële (EGSH). Het fluorogenic sensor roGFP2 equilibrates met intracellulaire EGSH Wanneer geoxideerd door glutaredoxin (Grx). In de reductieve traject katalyseert Grx de vermindering van de roGFP2 door deglutathionylation als GSSG niveaus dalen en de normale niveaus van GSH zijn hersteld door glutathionreductase (GR) ten koste van NADPH. NADPH is geleverd door glucose via de pentosefosfaatcascade (PPP). Aangepast Gibbs-Flournoy et al.€35. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Confocale microscopie beelden van de menselijke bronchiale epitheliale cel lijn BEAS-2B uiting van cytosolische roGFP2. Cellen werden verlicht op 488 nm (A-D), gevolgd door 404 nm (E-H). Beelden tonen fluorescentie uitgezonden bij 510 nm voor de volgende voorwaarden: basislijn (A, E), 100 µM H2O2(B, F), 1 mM H2O2 (C, G)en 5 mM DTT (D, H). 60 X Plan Apo VC doelstelling. Schaal staven 25 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Dosis afhankelijk veranderingen in roGFP2 geïnduceerd door H2O2 in BEAS-2B cellen. Cellen zijn geëquilibreerd gedurende 30 min. in fenol-rood gratis Keratinocyt basale media (KBM) voorafgaand aan blootstelling. Alle toevoegingen van H2O2 is opgetreden na een periode van de basislijn van 5 min. roGFP2 fluorescentie uitgezonden bij 510 nm werd verzameld met behulp van een 525/30 nm band pass filter na excitatie van de laser op 404 en 488 nm. Cellulaire reacties waren op hun respectieve basislijn en maximale sensor reactie na de toevoeging van 1 mM H2O2genormaliseerd. Waarden worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking, n = 3, waar n uit een gemiddelde van 5-10 onafhankelijke cellen bestaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Reactie van glucose uitgehongerd BEAS-2B cellen uiten van roGFP2 aan verschillende doses van H2O2. Cellen zijn geëquilibreerd gedurende 2 uur in een minimale zout medium dat geen glucose voorafgaand aan blootstelling bevat. Alle toevoegingen van H2O2 is opgetreden na een periode van de basislijn van 5 min. roGFP2 fluorescentie uitgezonden bij 510 nm werd verzameld met behulp van een 525/30 nm band pass filter na excitatie van de laser op 404 en 488 nm. Cellulaire reacties waren op hun respectieve basislijn en maximale sensor reactie na de toevoeging van 1 mM H2O2genormaliseerd. Waarden worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking, n = 3, waar n uit een gemiddelde van 5-10 verschillende cellen bestaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Reactie van BEAS-2B cellen uiten van HyPer naar verschillende doses van H 2 O 2 . Cellen zijn geëquilibreerd gedurende 30 min. in fenol-rood gratis KBM voorafgaand aan blootstelling. Alle toevoegingen van H2O2 is opgetreden na een periode van de basislijn van 5 min. fluorescentie uitgezonden bij 510 nm werd verzameld met behulp van een 525/30 nm band pass filter na excitatie van de laser op 404 en 488 nm. Cellulaire reacties waren op hun respectieve basislijn en maximale sensor reactie na de toevoeging van 1 mM H2O2genormaliseerd. Waarden worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking, n = 3, waar n uit een gemiddelde van 5-10 verschillende cellen bestaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. 9,10-PQ-geïnduceerde reacties van BEAS-2B cellen uiten van roGFP2. Cellen zijn geëquilibreerd gedurende 30 min. in fenol-rood gratis KBM voorafgaand aan blootstelling. Toevoeging van 25 µM 9,10-PQ onder omzwenken heeft plaatsgevonden op 5 min, gevolgd door toevoeging van 1 mM H2O2 20 min en 5 mM DTT op 24 min. Panel A toont de verhouding van de rauwe roGFP2 van afzonderlijke cellen in de schotel, elke cel vertegenwoordigd door een aparte regel. Deelvenster B toont normalisering van waarden van elke afzonderlijke cel tot de basislijn sensor fluorescentie, en het gemiddelde en de standaarddeviatie van deze gegevens is bovenop de individuele genormaliseerde verhoudingen in deelvenster C. Het percentage van de maximale sensor reactie gemiddeld over alle cellen wordt afgebeeld in deelvenster D. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 . 9,10-PQ-geïnduceerde reacties van BEAS-2B cellen uiten HyPer. Cellen zijn geëquilibreerd gedurende 30 min. in fenol-rood gratis KBM voorafgaand aan blootstelling. Toevoeging van 25 µM 9,10-PQ onder omzwenken heeft plaatsgevonden op 5 min, gevolgd door toevoeging van 1 mM H2O2 20 min en 5 mM DTT op 25 min. fluorescentie uitgezonden bij 510 nm werd verzameld met behulp van een 525/30 nm band pass filter na excitatie van de laser op 404 en 488 nm. Cellulaire reacties waren op hun respectieve basislijn en maximale sensor reactie na de toevoeging van 1 mM H2O2genormaliseerd. Waarden worden voorgesteld als het gemiddelde van 5-10 verschillende cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van roGFP2 en HyPer bij de opsporing van wijzigingen in de intracellulaire EGSH en H2O2, respectievelijk, is goed beschreven in de vorige fysiologische en toxicologische studies 25,35,36 ,39,40,41,42,43. Het protocol hier geschetste meldt een effectieve manier om het implementeren van deze genetisch-gecodeerde redox-sensoren in puntige toxicologisch onderzoek ter xenobioticum-geïnduceerde verstoringen van intracellulaire redox homeostase te beoordelen. Belangrijkst, koppelt het juiste gebruik van deze sensoren wijzigingen waargenomen om een specifieke redox pair of ROS (EGSH of H2O2), uiteindelijk de verduidelijking van het gebrek aan specificiteit met veel conventionele oxidatieve stress benaderingen. In het verzekeren van de kwaliteit van de gegevens die zijn gegenereerd op basis van deze sensoren, een paar aspecten rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van experimenten en het analyseren/interpretatie van gegevens. Zij omvatten: 1) het gebruik van de juiste besturingselementen, 2) bevestiging van passende sensor reacties, en 3) manipulatie van experimentele parameters voor het ophelderen van de mechanismen. Van deze dient de toevoeging van exogene H2O2 en DTT als besturingselementen aan het eind van de observatieperiode meerdere doeleinden. Ten eerste, het biedt een gelegenheid om te evalueren van de omvang van de reactie op de giftige blootstelling ten opzichte van de maximale en minimale signalen haalbare van de sensor. Dit is vooral handig in het normaliseren van de Responsie voor vergelijkingen tussen experimenten. Bovendien kan eindigt het experiment met de toevoeging van sterke exogene oxidator en reductieve stimuli evalueren het effect van de voorgaande belichting op de sensor/relay integriteit. Bovendien kunnen aldrithiol worden toegevoegd aan het einde van de run te omzeilen de estafette en testen van de functionaliteit van de sensor direct voor mogelijke schade die de blootstelling kan hebben toegebracht aan de fluorophore zelf.
Net als met andere technieken, bij de toepassing van deze methodologie voor de specifieke behandeling van de resultaten van de toxicologische, is het belangrijk dat de kwalitatieve beoordeling met betrekking tot de juistheid van de opmerkingen. Wanneer met behulp van roGFP2 of HyPer met elke nieuwe xenobioticum is het belangrijk om eerst het testen van een aantal doses, terwijl ervoor te zorgen dat de intensiteit van de fluorescentie (510 nm emissie) vanaf elke golflengte excitatie (404 nm en 488 nm) op de juiste manier verandert (d.w.z. een toename of verkleinen) voor de redox sensor wordt gebruikt. Het doel is het identificeren van een dosis waartegen de reactie van een sensor kan worden opgespoord, maar is niet overweldigd door openlijke manipulatie van de sensor of andere niet-specifieke gevolgen van de compound. Directe adductie of schade aan de sensor kan zich manifesteren als atypische veranderingen in fluorescentie bij beide excitatie golflengte (488 of 404 nm). In situaties waar beide sensor consequent ongepast reageren op de toevoeging van een veroorzaken over blootstelling is waargenomen, is het raadzaam de onderzoeker dat behandeling van experimentele parameters met betrekking tot dosimetrie, cel levensvatbaarheid, sensor expressie, en/of optische/chromatische afwijkingen van de apparatuur die wordt gebruikt voor het observeren van de reacties.
Zoals met elke toxicologische uitlezing, de verkregen gegevens zijn meestal meer relevant als de waargenomen reacties zijn onderzocht of gevalideerd met behulp van een mechanistische benadering, en de experimentele beperkingen worden beschouwd. Te dien einde kunnen verschillende experimentele parameters gecombineerd met de inherente eigenschappen van de sensor worden gebruikt voor het genereren van robuuste redox evaluaties. Onderzoeken die specifiek zijn voor het gebruik van de roGFP2-sensor betreffen uiteindelijk de redox-estafette via welke roGFP2 zintuigen EGSH (Figuur 1). De estafette omvat intracellulaire enzymen, waaronder glutaredoxin (Grx), glutathionreductase (GR) en glutathion peroxidase (GPx). Verschillen in endogene Grx over zowel cellulaire compartimenten en celtypes kunnen invloed hebben op metingen van EGSH en leveren van vergelijkingen tussen experimenten moeilijk43. Om aan te pakken dit probleem, een reeks van "fusion sondes" gesynthetiseerd, die het relevante enzym een rechtstreekse koppeling naar de roGFP2-sensor. Meest recent, menselijke Grx-1 was gekoppeld aan de roGFP2 door Gutscher en collega's32 te vormen Grx1-roGFP2. Naast het hebben van een groter dynamisch bereik dan roGFP1 en pH ongevoelig, kunt Grx1-roGFP2 controleren EGSH in soorten cellen of compartimenten in welke Grx activiteit anders zou worden beperkt. Verschillen in NADPH over celtypes of zelfs tussen de cellen in de dezelfde schotel kunnen ook bijdragen tot de variabiliteit in roGFP2 reacties. NADPH is vervaardigd uit glucose via de pentose fosfaat pathway en kan worden gebruikt door glutathionreductase (GR) om GSSG terug naar GSH (Figuur 1). Als cellen in hetzelfde veld het experiment met verschillende reducerend capaciteiten begint, hun EGSH veranderingen en resulterende roGFP2 reacties op een stimulans mogen geen uniform. Dit probleem kan worden overwonnen door een periode van glucose honger voorafgaand aan het experiment, dat put cellulaire NADPH voorraden en harmoniseert roGFP2 reacties. Een verminderde capaciteit voor EGSH herstel kan ook worden gezien in de 25 µM H2O2 dosis in cellen die waren uitgehongerd van glucose in vergelijking met cellen aangevuld met normale glucose concentraties (figuren 3 en 4). Thusly, kan manipulatie van NADPH niveaus door glucose honger dienen als een middel om te controleren de betrokkenheid van verschillende estafette onderdelen in transducing het effect van een xenobiotische belichting op de sensor. Een ander probleem bij het gebruik van roGFP2 in een toxicologische context is het potentieel voor de xenobioticum om te communiceren rechtstreeks in de oxidatie van de sensor, in plaats van via de redox-estafette te wijzigen EGSH. Directe oxidatie van roGFP2 kan worden bepaald door elk punt van de redox-estafette indringende en beoordeling van het effect daarvan op het signaal van de roGFP2. Een voorbeeld van deze techniek met behulp van ozon als een stimulans wordt geïllustreerd in de studie van Gibbs-Flournoy et al. 35.
Voor experimenten met de H2O2 sensor zijn de bovengenoemde problemen niet zo relevant, als het domein van de OxyR1 van HyPer H2O2 rechtstreeks zintuigen in plaats van via een redox-estafette. Echter, in tegenstelling tot roGFP2, H2O2 sensor is gevoelig voor veranderingen in de pH, die leiden veranderingen in de fluorescentie die niet kunnen worden toegeschreven aan H2O2 tijdens een experiment tot kan. Om deze reden, het gebruik van goed gebufferde media, een milieu kamer om de gewenste temperatuur, en het gebruik van voertuig besturingselementen zijn essentieel voor een experiment met behulp van de H2O2 sensor. Bovendien, zijn fluorogenic sensoren ontwikkeld om specifiek monitor pH, zoals pHRed, die straalt van fluorescentie in het rode kanaal en in cellen ook uiten HyPer45mede uitgedrukt kan worden. De ideale pH-control voor de H2O2 sensor is SypHer, dat een versie van de H2O2 sensor die heeft een enkel punt mutatie waardoor zij geen zin H2O2 is, behoudt nog dichter bij pH 46. men heeft ook opgemerkt dat cellen uiten H2O2 sensor een langere periode van de basislijn vereisen aan equilibreer, met name na het op de site van analyse, gedurende welke zij ervaren van een incubator worden vervoerd lichte veranderingen in de media temperatuur en pH. Het is aanbevolen om ten minste 5 gegevenspunten krijgen nadat de basislijn gestabiliseerd voordat u begint elke blootstelling.
De sensoren behandeld in deze methode, roGFP2 en HyPer, zijn twee van de vele sensoren van de fluorogenic die een scala aan nieuwe toepassingen op het gebied van de toxicologie hebben. Dit omvat sensoren die zijn ontworpen voor het opsporen van niet alleen EGSH en H2O2, maar peroxynitriet47, stikstofmonoxide48,49, en zelfs ozon50. Deze sensoren kunnen worden gebruikt in live-cel imaging studies specifiek en gevoelig controleren de oxidatieve soorten van belang. Met vooruitgang in technieken zoals spectrale randverwijdering, het is ook mogelijk mede wil twee sensoren met gelijkaardige spectrale karakteristieken (binnen 5 nm van elkaar) in dezelfde cel en scheiden van het aandeel van de fluorescentie die wordt uitgestoten door elke sensor51 . Deze techniek is van bijzonder belang voor roGFP2 en HyPer, aangezien zij excitaties en emissie bij dezelfde golflengten impliceren. Zoals kort vermeld hier, kunnen bepaalde sensoren worden op gericht specifieke intracellulaire compartimenten, zoals de mitochondriën, oxidatieve evenementen van belang acht te nemen. Terwijl deze opkomende sensoren en technieken buiten het bestek van deze methode zijn, wordt de lezer verwezen naar verschillende recente publicaties over het onderwerp van intracellulaire redox sensoren, zoals de herziening door de lonen en collega's52. Het gebruik van genetisch-gecodeerde fluorogenic sensoren met live-cel beeldvorming is een robuust hulpmiddel voor de monitoring van oxidatieve reacties tijdens de toxicologische beoordeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Het onderzoek beschreven in dit artikel is herzien door de nationale gezondheid en milieu effecten Research Laboratory, US Environmental Protection Agency, en goedgekeurd voor publicatie. De inhoud van dit artikel mag niet worden uitgelegd te vertegenwoordigen Agentschap beleid, noch vermelding van handelsnamen of commerciële producten vormt geen goedkeuring of aanbeveling voor gebruik.
Acknowledgments
De auteurs bedank Katelyn Lavrich voor hulp bij de proefopzet en manuscript bewerkingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
| HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |
References
- Cross, C. E., et al. Environmental oxidant pollutant effects on biologic systems: a focus on micronutrient antioxidant-oxidant interactions. Am J Respir Crit Care Med. 166, 44-50 (2002).
- Kobzik, L. Environmental particulate-mediated cytokine production in lung epithelial cells (A549): role of preexisting inflammation and oxidant stress. J Toxicol Environ Health. 55, 31-44 (1998).
- Jaeschke, H., McGill, M. R., Ramachandran, A. Oxidant stress, mitochondria, and cell death mechanisms in drug-induced liver injury: lessons learned from acetaminophen hepatotoxicity. Drug Metab Reviews. 44, 88-106 (2012).
- Wolf, M. B., Baynes, J. W. The anti-cancer drug, doxorubicin, causes oxidant stress-induced endothelial dysfunction. Biochim Biophys Acta. 1760, 267-271 (2006).
- Kumagai, Y., Shinkai, Y., Miura, T., Cho, A. K. The chemical biology of naphthoquinones and its environmental implications. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 52, 221-247 (2012).
- Pham, H. T., Maccarone, A. T., Campbell, J. L., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Ozone-induced dissociation of conjugated lipids reveals significant reaction rate enhancements and characteristic odd-electron product ions. J Am Soc Mass Spectrom. 24, 286-296 (2013).
- Abdel-Malek, Z. A., Kadekaro, A. L., Swope, V. B. Stepping up melanocytes to the challenge of UV exposure. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 171-186 (2010).
- Berisha, H., Pakbaz, H., Absood, A., Foda, H., Said, S. Nitric oxide mediates oxidant tissue injury caused by paraquat and xanthine oxidase. Ann N Y Acad Sci. 723, 422-425 (1994).
- Gao, X., et al. Mitochondrial dysfunction may explain the cardiomyopathy of chronic iron overload. Free Radic Bio Med. 49, 401-407 (2010).
- Shukla, A., et al. Asbestos induces mitochondrial DNA damage and dysfunction linked to the development of apoptosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 285, 1018-1025 (2003).
- Charles, R., Jayawardhana, T., Eaton, P.
- Thornalley, P. J., Rabbani, N. Detection of oxidized and glycated proteins in clinical samples using mass spectrometry-a user's perspective. Biochim Biophys Acta. 1840, 818-829 (2014).
- Arato, S., Ito, H., Miyashita, K., Hayakawa, K., Itabashi, Y. A facile method for the detection of aldehydes in oxidized lipids using solid-phase microextraction fiber and gas chromatograph equipped with a septum-free injector. J Oleo Sci. 58, 17-22 (2009).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840, 794-800 (2014).
- Churg, A., Keeling, B., Gilks, B., Porter, S., Olive, P. Rat mesothelial and tracheal epithelial cells show equal DNA sensitivity to hydrogen peroxide-induced oxidant injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 268, 832-838 (1995).
- Fraga, C. G., Oteiza, P. I., Galleano, M. In vitro measurements and interpretation of total antioxidant capacity. Biochim Biophys Acta. 1840, 931-934 (2014).
- Niki, E., Noguchi, N. Evaluation of antioxidant capacity: what capacity is being measured by which method. IUBMB Life. 50, 323-329 (2000).
- Pharikal, K., Das, P., Dey, C., Dasgupta, S. Tissue ascorbate as a metabolic marker in cadmium toxicity. Int J Vitam Nut Res. 58, 306-311 (1987).
- Tabata, M., Totani, M., Murachi, T. A chemiluminometric method for NADPH and NADH using a two-enzyme bioreactor and its application to the determination of magnesium in serum. Biomed Chrom. 4, 123-127 (1990).
- Ballatori, N., et al. Glutathione dysregulation and the etiology and progression of human diseases. Biol Chem. 390, 191-214 (2009).
- Nauseef, W. M. Detection of superoxide anion and hydrogen peroxide production by cellular NADPH oxidases. Biochim Biophys Acta. 1840, 757-767 (2014).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection and characterisation of radicals in biological materials using EPR methodology. Biochim Biophys Acta. 1840, 708-721 (2014).
- Kettle, A. J., et al. Measuring chlorine bleach in biology and medicine. Biochim Biophys Acta. 1840, 781-793 (2014).
- Carballal, S., Bartesaghi, S., Radi, R. Kinetic and mechanistic considerations to assess the biological fate of peroxynitrite. Biochim Biophys Acta. 1840, 768-780 (2014).
- Meyer, A. J., Dick, T. P.
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J Biol Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Malinouski, M., Zhou, Y., Belousov, V. V., Hatfield, D. L., Gladyshev, V. N. Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PloS One. 6, 14564 (2011).
- Guzman, J. N., et al. Oxidant stress evoked by pacemaking in dopaminergic neurons is attenuated by DJ-1. Nature. 468, 696-700 (2010).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nat Med. 20, 555-560 (2014).
- Wolf, A. M., Nishimaki, K., Kamimura, N., Ohta, S. Real-time monitoring of oxidative stress in live mouse skin. J Invest Dermatol. 134, 1701-1709 (2014).
- Mishina, N. M., et al. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally. Antioxid Redox Signal. , (2011).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nat Methods. 5, 553-559 (2008).
- Lohman, J. R., Remington, S. J. Development of a family of redox-sensitive green fluorescent protein indicators for use in relatively oxidizing subcellular environments. Biochem. 47, 8678-8688 (2008).
- Schafer, F. Q., Buettner, G. R. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic Bio Med. 30, 1191-1212 (2001).
- Gibbs-Flournoy, E. A., Simmons, S. O., Bromberg, P. A., Dick, T. P., Samet, J. M. Monitoring intracellular redox changes in ozone-exposed airway epithelial cells. Environ Health Perspect. 121, 312 (2013).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wood, Z. A., Poole, L. B., Karplus, P. A. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science. 300, 650-653 (2003).
- Sies, H. Role of Metabolic H2O2 Generation REDOX SIGNALING AND OXIDATIVE STRESS. J Biol Chem. 289, 8735-8741 (2014).
- Cheng, W. -Y., et al. Linking oxidative events to inflammatory and adaptive gene expression induced by exposure to an organic particulate matter component. Environ Health Perspect. 120, 267 (2012).
- Cheng, W. -Y., et al. An integrated imaging approach to the study of oxidative stress generation by mitochondrial dysfunction in living cells. Environ Health Perspect. , 902-908 (2010).
- Wages, P. A., et al. Role of H 2 O 2 in the oxidative effects of zinc exposure in human airway epithelial cells. Redox Biol. 3, 47-55 (2014).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E GSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radic Bio Med. 51, 1943-1951 (2011).
- Schwarzländer, M., Dick, T. P., Meyer, A. J., Morgan, B. Dissecting redox biology using fluorescent protein sensors. Antiox Redox Signal. 24, 680-712 (2016).
- Wang, L., Atkinson, R., Arey, J. Formation of 9, 10-phenanthrenequinone by atmospheric gas-phase reactions of phenanthrene. Atmos Environ. 41, 2025-2035 (2007).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: applications in neuroscience and regenerative biology. Biochim Biophys Acta. 1850, 2318-2328 (2015).
- Hou, J. -T., et al. A highly selective water-soluble optical probe for endogenous peroxynitrite. Chem Commun. 50, 9947-9950 (2014).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Gabe, Y., Ueno, T., Urano, Y., Kojima, H., Nagano, T. Tunable design strategy for fluorescence probes based on 4-substituted BODIPY chromophore: improvement of highly sensitive fluorescence probe for nitric oxide. Anal Bioanal Chem. 386, 621-626 (2006).
- Garner, A. L., et al. Specific fluorogenic probes for ozone in biological and atmospheric samples. Nat Chem. 1, 316-321 (2009).
- Cheng, W. -Y., Larson, J. M., Samet, J. M. Monitoring intracellular oxidative events using dynamic spectral unmixing microscopy. Methods. 66, 345-352 (2014).
- Wages, P. A., Cheng, W. -Y., Gibbs-Flournoy, E., Samet, J. M. Live-cell imaging approaches for the investigation of xenobiotic-induced oxidant stress. Biochim Biophys Acta. 1860, 2802-2815 (2016).
