Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Genetik olarak kodlanmış Fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin Değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme

Published: February 7, 2018 doi: 10.3791/56945
Automatic Translation
1, 2, 2,3
1Department of Environmental Sciences and Engineering, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Environmental Public Health Division, National Health and Environmental Effects Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education

Summary

Bu el yazması oksidatif stres xenobiotic kaynaklı incelenmesi için genetik olarak kodlanmış fluorogenic gazetecilere canlı hücre görüntüleme bir uygulamada kullanımını açıklar. Bu deneysel yaklaşım eşsiz kronolojik zamanmekansal çözünürlük, duyarlılık ve özgüllük eksiklikleri toksikolojik oksidatif stres tespiti için kullanılan geleneksel yöntemlerden birçoğu kaçınırken sunmaktadır.

Abstract

Oksidatif stres sık atıf toksikolojik mekanizması olmakla birlikte, eksiklikleri, örnek, potansiyel eserler getirilmesi ve özgüllük reaktif için eksikliği de dahil olmak üzere bir dizi üzerinde çalışmak için geleneksel yöntemler muzdarip türler dahil. Böylece, gözlemlemek ve hücre içi Redoks tedirginlikler, daha yaygın olarak anılacaktır oksidatif stresi ölçmek için kullanılan non-yıkıcı, hassas ve belirli yöntemleri için toksikoloji alanında geçerli bir ihtiyaç vardır. Burada, iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörleri, roGFP2 ve HyPer canlı hücre görüntüleme çalışmaları xenobiotic kaynaklı oksidatif yanıt-e doğru gözlemek için kullanılmak üzere, kullanımlar için bir yöntem mevcut. roGFP2 Sakinleştiği glutatyon Redoks ile potansiyel (EGSH), HyPer doğrudan hidrojen peroksit (H2O2) algılar. Her iki sensörleri çeşitli hücre tiplerinin transfection veya iletim yoluyla içine ifade ve belirli hücresel kompartmanlarda hedeflenebilir. En önemlisi, bu sensörler kullanarak live-cep mikroskobu geleneksel yöntemlerle mümkün değildir yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük sunar. Floresan yoğunluğu göstergesi için sırayla 404 tarafından heyecanlı zaman her iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörler olarak 510 nm hizmet izlenen değişiklikleri nm ve 488 nm ışık. Bu özellik her iki sensörler ratiometric, ortak mikroskobu eserler ortadan kaldırmak ve sensör ifade hücreleri arasındaki farklılıkları için düzeltme yapar. Bu metodoloji Fluorometrik platformlarda confocal görüntüleme sistemleri, geleneksel geniş alanlı mikroskobu ve plaka ile kullanıma uygun yapım o reçete dalga boylarında, heyecan verici ve toplama emisyonlarının yetenekli genelinde uygulanabilir okuyucular. Her iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörleri hücre tipleri ve toksikolojik çalışmalar çeşitli hücresel EGSH ve H2O2 nesil gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılır. Burada özetlenen Fluorometrik platformları için roGFP2 ve HyPer uygulama live-hücre toksikolojik Değerlendirmeler oksidatif stres ve hücre tipleri arasında yaygın olarak uyarlanabilir standart bir yöntemdir.

Introduction

"Oksidatif stres" sık sık toksikoloji, bir mekanizma olarak gösterildi henüz nadiren terimdir bu terimi özellikle açıklanmıştır. Oksidatif stres Reaktif oksijen türleri, antioksidan moleküllerin oksidasyonu serbest radikallerin neden olduğu hasar nesil de dahil olmak üzere birkaç hücre içi işlemler için başvuruda bulunabilir ve belirli sinyal bile aktif basamaklandırır. Oksidatif stres ya da doğrudan eylem tarafından xenobiotic tesisin5 ikna etmek için belgelenen çevre kirletici1,2 ve ilaç ajanlar3,4 geniş bir yelpazesi ,6 veya ikincil olarak hücresel yanıt7,8,9,10parçası olarak oksidan türlerin üretimi. Bu nedenle doğru gözlemlemek ve olumsuz sonuçlara yol önde gelen oksidatif süreçleri karakterize toksikoloji büyük ilgi. Oksidatif stres ölçme geleneksel yöntemlerle oksitlenmiş biomolecules11,12,13,14,15 veya antioksidan16 kimliği içerir ,17,18,19,20veya reaktif türler kendilerini21,22,23, doğrudan ölçümü 24. Ancak, bu yöntemler genellikle kez örnek tüketir, Uzaysal çözünürlük ortadan kaldırır ve potansiyel olarak eserler25tanıştırmak hücresel bozulma, gerektirir. Oksidan türler tespiti ve oksidatif stres işaretleri için daha hassas ve belirli yöntem geliştirme genel olarak xenobiotic maruz kalma yan etkilerinin incelenmesi için geçerlidir.

Yeni nesil fluorogenic genetik olarak kodlanmış sensörleri kullanarak live-cep mikroskobu canlı hücreler hücre içi Redoks durumunun izlenmesi için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu sensörler genellikle bir vektör transfection veya iletim yöntemleri ile tanıtılan bir viral organizatörü kontrol altında kullanarak ifade edilir. Floresan sensör ifade hücreleri kolayca görsel olarak tanımlanabilir beri yüksek ifade verimliliği gerekli değildir. Toksikolojik değerlendirmeler için gerçek zamanlı olarak xenobiotic bileşikler maruz Floresans mikroskobu kullanılarak bu sensörler ifade hücreleri görülebilir. Bu deneysel tasarım aynı hücrede tekrarlanan ölçümler her hücrenin kurulan temel kendi kontrolü hareket etmeye izin verir. Canlı hücre görüntüleme tarafından tanınan yüksek zamansal çözünürlük oksidatif olaylar, özellikle de mütevazı büyüklüğü veya geçici doğada algılanması için çok uygundur. Hassas ve belirli hedef molekülleri olmasının yanı sıra, bazı bu sensörler Floresans iki dalga boylarında ışık kullanarak heyecanlı. Bu olay bu sensör ifade, hücre kalınlığı, lamba değişimleri gibi eserler nedeniyle gelen otantik sensör yanıtları ile ilişkili sinyal değişiklikleri muhakeme izin veren bir oranı olarak ifade edilecek floresan emisyon izin verir. yoğunluğu, photobleaching ve duyarlılık Floresans dedektörü26. Fluorogenic sensörleri kullanımı bir diğer avantajı onlar için geleneksel yöntemler25,26,27tarafından eşsizdir Uzaysal çözünürlük düzeyi oluşturulmasını belirli hücresel kompartmanlarda yönlendirilebilir değil.

Yeşil flüoresan protein (GFP) göre genetik olarak kodlanmış sensörler büyük bir ailenin geliştirilmiş ve fizyolojik işaretleri, pH, sıcaklık, kalsiyum konsantrasyonu ve ATP/ADP oranı25 de dahil olmak üzere geniş bir çeşitlilik üzerindeki raporunda karakterize ,28,29,30,31. Bunlar arasında glutatyon Redoks potansiyeli (EGSH) ve hidrojen peroksit (H2O2) sensörler bulunmaktadır. Bu sensörler Redoks Biyoloji ve Tıp uygulamaları için geliştirilen iken, onlar da oksidatif stres xenobiotic kaynaklı çalışmaya adapte olmuştur. Özellikle, burada özetlenen Protokolü EGSH sensör roGFP2 ve H2O2 sensör HyPer kullanımını açıklar.

roGFP2 hücre içi azaltılmış ve okside glutatyon (GSH/GSSG) glutatyon peroksidaz (GPx), glutaredoxin (Grx) ve glutatyon redüktaz ilgili bir Redoks röle aracılığıyla Redoks potansiyeli (GR) (Resim 1)25, raporlar 32 , 33. glutatyon baskın hücresel antioksidan moleküldür ve öncelikle haliyle azaltılmış (GSH) sitozol25,34millimolar konsantrasyonlarda bulunur. EGSH işlev herhangi bir sonuca bağlı olmayan ise, hücre içi oksidatif durumu34önemli bir göstergesi olarak kabul edilmektedir. GSSG konsantrasyonu nispeten küçük bir artış roGFP2 tarafından tespit EGSH artış sonuçlanır. Aynı derecede önemli, EGSH izleme xenobiotic pozlama sırasında roGFP2 kullanarak potansiyel olarak çok Redoks röle birkaç noktada etki mekanizması hakkında ortaya çıkarabilir ve Pentoz fosfat gibi ilişkili yollar (Resim 1 şönt )35. Burada tartışılan ikinci sensör, HyPer, bu sarı floresan protein (YFP) ekleme bakteriyel H2O2düzenleyici etki alanına türetilmiş hücre içi bir H2O2 sonda-hassas transkripsiyon OxyR136faktör. Her ne kadar bu daha önce zarar verici bir Reaktif oksijen ara olarak kabul edilmiştir, H2O2 giderek önemli bir hücre içi sinyal molekülü fizyolojik şartlarda37, altında olarak tanınır H2O2 için tanınmayan rolleri toksikoloji de bulunduğunu öne 38. Örneğin, aşırı H2O2 xenobiotic bir poz tarafından indüklenen hücresel sinyal veya bioenergetics bir kayma bozukluk habercisi olabilir.

Her iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörleri insan epidermoid Karsinomu hücre kültürünü A431 ve BEAS-2B EGSH ve H2 değişiklikleri gözlemlemek için insan bronş epitel hücre satırı da dahil olmak üzere birçok kurulan hücre hatlarında ifade edilmiştir O2 toksikolojik Etkilenmeler çeşitli yanıt olarak. Bunlar gaz halinde olan yakıtlar kirleticiler (ozon35), Partiküler madde (1,2 naphthoquinone39,40 ve çinko41) ve nikel nano tanecikleri (yayınlanmamış veri) çözünür bileşenler içerir. Bu çalışmalar bu iki sensörler olası uygulamaları yalnızca küçük bir bölümünün temsil eder. Teorik olarak, alma ve DNA'sı bu sensörler geleneksel moleküler biyoloji teknikleri ile ifade etme özelliği olan herhangi bir hücre tipi hücresel oksidatif durumu değiştirmek için şüpheli xenobiotics etkilerini değerlendirmek için yararlı olabilir. Bugüne kadar bir veya daha fazla bu sensörlerin ifade çeşitli prokaryot ve Ökaryotlar, dahil birçok memeli, bitki, bakteri ve Maya hücre türleri25,26,36,42edilmiştir. Göstergesi EGSH ve H2O2 sensörleri için 510 yayılan floresan yoğunluğu bir değişimdir nm uyarma ile 488 ve 404 nm ışık üzerine. Bu yöntem mikroskobu (confocal ve geniş alanlı) ve plaka okuyucu türleri dahil olmak üzere Fluorometrik platformda yaygın olarak adapte olur. Burada sunulan yöntemi duyarlı ve spesifik hücre içi EGSH ve H2müşahede vitro toksikolojik sistemlerinde O2 sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hücre hazırlanması

Not: Bu yordam bir ölümsüzleştirdi hücre hattı (BEAS-2B; lentiviral iletim açıklar. İstenen muhabir (roGFP2 veya HyPer) ifade etmek için ATCC, Manassas, VA). Onlar gazeteci ifade görüş alanı (genellikle 5-10 hücreleri) başına sensör ifade hücreleri yeterli sayıda görselleştirmek yeterli bir düzeyde neden olduğu sürece diğer hücre hatları/tipleri ve/veya gen transferi, transfection, dahil yöntemleri kullanılabilir. Eğer transfection yöntemleri kullanarak, yordam sonuçta analiz yöntemi için kullanılan çanak uygulanmalıdır (örneğin, transfect için mikroskop-ecek var armağan aynı çanak hücreleri). Aşağıda açıklanan adımları bir 6-şey hücre kültür tabağına gerçekleştirilecek hücre transductions hazırlamak için ayrıntılı bilgi sağlar. Bu biçimi istediğiniz uygulama için uygun bir boyut yoksa, diğer gemilerin yedek olabilir.

  1. Yaklaşık % 40-60 izdiham normal büyüme medya için hücreleri büyümek.
    Not: Bu çalışmada insan bronş epitel hücre kültürünü, BEAS-2B, keratinosit büyüme orta (KGM) yetiştirilen kullanılmaktadır.
  2. İletim önce ile 500 µL serum-Ücretsiz medya virüs, formül tarafından hesaplanan olarak uygun miktarda içeren hücrelerde büyüme ortamı değiştirin:
    Equation 1
    1. İçin iletim BEAS-2B hücre serum-Alerjik keratinosit Bazal orta (KBM) sırasında viral incubations KGM büyüme ortamı değiştirmek için kullanın.
      Not: Bir şey hücre bir 6-iyi biçimde tek bir iletim için yukarıdaki bir hesaplamasıdır. Gerekirse, transductions birkaç gerçekleştirmek wells gerçekleştirilen bir çarpma transduced için kuyu sayısına göre formülle ayarlayarak. Lentiviral transductions için enfeksiyon (MOI) 5 ile 20 arasında bir çeşitlilik kullanın. Adenoviral transductions için 100 ile 500 arasında bir MOI kullanın.
  3. Hücreler için 4 tabak kısa bir sallanan ile her 30-60 dk içinde viral parçacıkların yeniden dağıtma veya hareket dönen h, 37 ° C'de viral karışımı ile kuluçkaya.
  4. Yemek için tam büyüme ortamının 1 mL ekleyin ve bir ek 4-16 h 37 ° C'de kuluçkaya.
  5. Tüm medyayı çıkarın ve taze tam büyüme ortamı ile değiştirin.
  6. Devam büyümek ve hücreleri geçiş gerektiği gibi genişletin.
    Not: Kayda değer içinde 12-48 h sensör ifade hücreleri başlamak. Lentiviral bir vektör iletim için kullanıldıysa, istenen sensörün istikrarlı ifade arasında geçişler devam etmelidir.
  7. Mikroskopi temelli değerlendirmeler için tohum hücreleri cam içine mikroskop yemekleri altlı ve istenen izdiham (≥70 - %80) görüntüleme önce büyümeye.
    Not: yoğunluk tohum çanak, büyüme oranı kullanılan hücre satırının ve tohum aşağıdaki değerlendirme zaman boyutuna bağlıdır. Örneğin, tohum 300.000 BEAS-2B hücreler büyüme 1 gün sonra yaklaşık % 70-80 izdiham vermeye bir 35 mm çanak içine.

2. mikroskobu Set-up

Not: aşağıda açıklanan protokol 404 ve 488 nm lazer çizgilere sahip confocal mikroskop kullanılarak gerçekleştirilir. Bu iletişim kuralı, onların reçete uyarilmalar/emisyon içinde açıklanan sensörlerin Fluorometrik değerlendirmesi yapmak diğer araçlarla da uygun veri verim. Önemlisi, ekipman ayarları büyük tipi, yaş ve kullanılan araç durumunu bağlı olarak değişiklik gösterebilir; Böylece, herhangi bir enstrüman değerlerini belirtilen diğer laboratuvarlarda kullanılan ekipman için belirli olmayabilir.

  1. Çevresel kontroller uygun bir sıcaklık (örneğin, 37 ° C), nem korumak için tüm görüntüleme analizi gerçekleştirmek (genellikle > % 95 bağıl nem), ve/veya gaz konsantrasyonu (örneğin, % 5 CO2) hücreler için uygun deneme süresi.
  2. Bağıl nem oranı yüksek değerlerini kullanarak, oksijen ortamla temasta gelebilir herhangi bir yüzey tutmak (örn., mikroskop objektif) ya da üzerinde biraz sıcaklık, nem yoğunlaşma önlemek için oluşturulur. Bu objektif bir ısıtıcı ve/veya teyp ve uygun Kalorifer Kumanda Isıtma kullanımı ile gerçekleştirilebilir.
  3. Tüm mikroskop bileşenleri turn ve emisyon, 510 ile 488 ve 404 nm, sıralı uyarma için gerekli tüm ekipman kurmak nm. Optik yapılandırmasının tüm bileşenleri uygun gerçek zamanlı satın alma için ayarlanır emin olun.
  4. 37 ° c, % 5 CO2 atmosfer, sabit sıcaklık korumak için bir sahne-üst çevre odasını ayarla ve > % 95 nem. Resim alma başlatmadan önce en az 10 dk için çevre odası tüm çevresel kontroller ilk kurulum sonra equilibrate.
    Not: Çevre koşulları ortadan veya deneme uzunluğu, hücre tipi ve kullanılan pozlama bağlı olarak ayarlanır.
  5. Çevre odası içinde sahne üst hücre (Adım 1.7) çanak yerleştirin.
  6. İstenen objektif lens ile odak düzlemi mercek ve beyaz ışık kullanarak hücre bulun ve normal morfoloji olun.
    Not: Bir 1.4 NA 60 X Menekşe-düzeltilir, hangi confocal sisteminin optik çözünürlük en üst düzeye çıkarma sırasında hücre içi bölmeleri tanımlaması verir petrol dalmış objektif lens yaygın olarak kullanılır.
  7. Görüş alanı hücrelerde Floresans ifade denetleyin. Bunu hücreleri geniş alanlı floresan aydınlatma floresein isothiocyanate (FITC) gibi bir uygun filtre set altında görüntülenmesi sırasında. Bu noktada, çalışma hücrelerinin bir alanı seçmek için çanak taşımak daha kolay olduğu için mercek ile seyir daha uygun olmakla birlikte geniş alanlı aydınlatma kullanarak. Genel olarak, yeşil Floresans tarafından belirtildiği gibi sensör ifade eden en az 5-10 hücreleri içeren bir görüş alanı seçin.
    1. Alternatif olarak, confocally ifade sensör ile en uyumlu bir dalga boyu, lazer uyarma kullanarak bu değerlendirmesi gerçekleştir (488 nm genellikle en iyi çalışır).
      Not: içsel floresan özellikleri nedeniyle, bu her iki FITC kullanarak HyPer daha bu ifade roGFP2 ifade hücreleri görselleştirmek daha zor olacak veya 488 nm. Ancak, hala zayıf hücreleri görmek mümkün olmalıdır.
  8. Görüntülemek istediğiniz bir alanı bulunduğunda, çevre odası kapatın.
    Not: odak bakımını yapma özelliği, üzerinde gelişmiş mikroskop duruyor, genellikle sağlanan çalışma boyunca istikrarlı bir odak düzlemi bakımını kolaylaştırmak için kullanın.
  9. İstenen pozlama süresi ilgi sensörün en iyi değerlendirme sağlamak için edinme parametreleri ayarlayın. Öneriler ve yaklaşımlar için confocal düşsel duyumsal tepkilerin aşağıdadır:
    1. Lazer güç 488 nm, uyarma ve 510, emisyon için ayarlamak nm. Görselleştirme hücrelerin veren bir lazer güç düzeyi ve bu örnekleri ya da Çoğalt yemekleri arasında sabit tutmak.
      Not: Bu çalışma için % 12 ve % 1.5 lazer gücü 488 ve 404 nm lazer hatları için sırasıyla kullanılmıştır.
    2. Seçilen odak düzlemi maksimal Floresans emisyon yoğunluğu (z ekseni) hücrelerin ortasındaki için 488 tarama tarafından getirilmiş olduğunu emin olmak için satın alma yazılım confocal denetimleri kullanın z-uçak ayarlama süre nm. Bu en aşırı maruz hücrelerde sonuçları z-uçak için arama sırasında yüksek kazanç ayarı kullanarak daha kolay yapılır. Uygun odak düzlemi bulunca kazanç varlık dikkat etmek piksel oversaturating olmadan kullanılan muhabir floresan için en uygun bir değere döndürür.
      Not: bulmak ve hücreleri deneme sırasında gözlemlemek için uygun lazer ve kazanç ayarları kullanılmaktadır confocal sistemde tamamen bağımlı. Görüş alanı hücreleri bulduktan sonra genel olarak, bu en az miktarda lazer güç olması önerilir (≤20%), aşırı yüksek güçlü lazer ışığı kullanarak hücreleri tarama oksidatif değişiklikler tespit algılayıcı tarafından neden olabilir gibi kullanılır.
    3. Kazanç temel Floresans ince ayar yapmak için kullanın. Bu hücreler EGSH arttığında 488 nm uyarma tarafından indüklenen 510 nm Floresans kaybetmek gibi roGFP2 ile üst sınırı (≈ % 90 bağıl yoğunluğu) olmadan aşırı doygunluk, enstrümanın yakınındaki taban çizgisi oluşturun. Buna ek olarak, floresan yoğunluğu ile 488 nm uyarma olmalıdır düşük (≈ % 10 göreli yoğunluğu) temel HyPer H2O2 algılandığında bu hücreler 510 nm Floresans yoğunluk kazanacaktır gibi hücreleri, ifade etmek için.
    4. 2.9.2 ve 2.9.3 404 nm, uyarma ve emisyon, 510 nm. 404 nm uyarma dalga boyları için kazanç ayarlarıdır 488 nm uyarma ile her sensör için kullanılan ters (404, yani, floresan (≈ % 10 göreli yoğunluğu) düşük temel nm roGFP2, yüksek taban çizgisi floresan (≈ % 90 bağıl yoğunluğu)2 H için için O2 sensör).
      Not: genel olarak, 404 nm uyarma, floresan (510 emisyon) hücrelerdeki 488 nm uyarma ile elde edilebilecek roGFP2 ve HyPer, 404 nm pik olarak ifade görece küçük uyarma bunların her ikisi için en fazla olduğunu önemli ölçüde daha düşük olamaz sensörler.

3. veri toplama

  1. Sırayla iki uyarma dalga boylarında heyecanlandırmak için satın alma yazılımı kurar (ilk 488 nm ve sonra 404 nm) ve toplamak emisyonları için her ikisi vasıl 510 nm deneme istenen uzunluğu boyunca önceden belirlenen zaman aralığında (örneğin yakalama her 60 görüntüler s 60 dk için).
    1. Alternatif olarak, test edilen xenobiotic için değişiklikleri EGSH veya H2O2 yaklaşık zamanlaması biliniyorsa görüntüleri önce ve sonra Etkilenmeler el ile alın. Ancak, bu geçici çözümü kaybına yol açabilir.
  2. Gerçek zamanlı değerlendirme deneysel parametreleri için alanında en az 5-10 sensör ifade hücreleri seçin ve onları bölgeleri ("ROIs") deneme sırasında Floresans değişikliklerini izlemek için ilgi olarak kurmak.
    Not: Bu adım isteğe bağlıdır ve gerçek zamanlı olarak doğrudan gözlem istenmeyen veya yazılım sınırlamalarına sürekli izlenmesi önlemek deneyden sonra gerçekleştirilebilir. Hücre nüfus bağlı olarak hücre ROIs olarak ifade sensör seçimi hücreler boyunca ifade düzeyleri bir dizi temsil edebilir.
    1. Bu çalışmalar için bir dakika 5 temel süre sonra çevre yaydıkları 9,10-phenanthrenequinone (9,10-PQ) veya hidrojen peroksit (H2O2) ekleyin.
    2. Bu iletişim kuralı daha sonra kullanmak için tüm reaktifler hazırlayın.  9,10-PQ Dimetil sülfoksit (DMSO) 15 mM bir konsantrasyon içinde dağıtılması ve µM çalışan 250 bir çözüm vermeye Bazal Hücre medyada oranında seyreltin.  Ayrıca, hidrojen peroksit enjeksiyon üzerine 1 mM son bir konsantrasyon verecektir suda çalışan bir çözüm hazır olun.
  3. Deneysel parametreleri tanımladıktan sonra saat ders alma başlar. Temel süre en az 5 dk (ya da 5 veri puan) xenobiotic Etkilenmeler başlatmadan önce kurmak.
  4. Toxicant hücrelere maruz vitro dozaj için geleneksel yaklaşımları kullanarak araştırılıyor. Su veya diğer uygun çözücü çözünen bileşikler hazırlamak ve doğrudan medya içine enjekte.
    1. Organik çözücüler (Dimetil sülfoksit veya etanol gibi) gerekiyorsa, son çözelti konsantrasyonu veya % 0,1 altında tutmak. Çözücü EGSH veya H2O2 üretim hücreleri ayrı bir fincan bir araç denetimi üzerinde bir etkisi üretmek olmadığını doğrulayın.
    2. Daha düşük çözünürlük ile bileşikler için enjeksiyon yapıldıktan sonra bir micropipette protokolü kullanarak karıştırma bir adım ekleyin. Gaz halinde olan yakıtlar pozlama uygun taşıyıcı gaz karışımı kullanarak çevre odasına doğrudan pompa.
  5. Floresans pozlama süresi boyunca yapılan değişiklikleri izlemek. Sonraki enjeksiyon gerektiği gibi gerçekleştirin. Böylece aynı hücreler aynı odak düzlemi içinde yansıma süre süre boyunca ders boyunca takip enjeksiyon sırasında çanak değiştirme yapmamam için çok dikkat edin.
  6. Deney sonunda, uygun denetimlere hücreleri göstermek. Her iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörleri için okside ve onların ratiometric yanıt sivri bir gösteri bu sensörler azaltmak için bilinen bileşikler belirli konsantrasyonları ekleyin. H2O2 ve dithiothreitol (DTT) okside ve her iki sensörler azaltmak için uygun denetimleri hizmet vermektedir. Tipik olarak, 1-5 mM dithiothreitol (DTT), ardından 100-1000 µM H2O2, son bir konsantrasyon tam okside ve bu sensörler azaltmak düzenlemesine olanak sağlar.
    1. Bu çalışmalar için 1 mM H2O2 5 mM DTT tarafından takip en yüksek sensör yanıt belirlemek için kullanın.
    2. Sensör yanıt vermek izin vermek için en az 5 dakika bekleyin ve DTT Senyor azaltmak ve floresan veya kurulmuş çizgisidir yakınındaki bir seviyeye dönmek için gibi bir indirgeyici enjekte et.
      Not: Bu adımda denetimlerini normalleştirme için çok önemlidir ve her hücrede sensörün dinamik aralığını belirlemek için her deney sonunda yapılmalıdır. RoGFP2 için aldrithiol deneme sonunda eklenebilir. Aldrithiol sensör doğrudan okside roGFP2 Redoks geçiş atlar. Bu sensör fonksiyonu xenobiotic pozlama takip değerlendirmek yararlıdır.

4. veri analizi

  1. Zaten kurulan ROIs çözümlenmesi için hücrelerin etrafında çizin. Her yatırım Getirisi her dalga boyu saat ders boyunca, Floresans yoğunluğunu ölçmek için uygun yazılımı kullanın. Hücreleri kımıldamadı veya plaka çalışması sırasında değiştirme yapmamam emin olun.
    Not: ROIs kurulması en kolay floresan ifade her hücrenin uyar kapalı bir bölge çizerek gerçekleştirilir. Daha fazla bu işlemine yardımcı olmak için iletilen ışık (veya aydınlık alan) görüntü kurulan görüş alanı içindeki hücreleri floresan görüntü üzerine hücre kenarlıklarını tanımlamak için çabalarında overlaid. Ancak, iletilen bir ışık görüntü kullanımı deneme seyri boyunca ek bir kanal (görüntü kümesi) yakalamak kullanıcı gerektirir. Alternatif olarak, bazı üreticileri yoğunluğu eşikler gibi belirli parametreleri ROIs daha nicel, daha az öznel bir yöntem kurmak için kullanmak onların görüntüleme yazılımı içine algoritmalar dahil.
  2. Verileri istediğiniz analiz yazılımı (örneğin, elektronik tablo) verin.
  3. Ratiometric sensör yanıt her yatırım Getirisi, her zaman bir noktada formülleri kullanarak hesaplamak:
    Equation 2
    Equation 3
  4. Her zaman noktası için tüm ROIs hesaplanan ratiometric değerleri ortalama.
  5. Veri (örneğin, ilk beş kez puan) xenobiotic toplamadan önce toplanan önceden hesaplanmış ratiometric değerleri (Adım 4.4) sayı ortalaması alınarak normalize etmek kullanılan temel değeri hesaplar.
  6. Adım 4.4 ratiometric değerlerinden her değeri 4.5 içinde hesaplanan temel değere göre bölerek normalize. Normalleştirilmiş oranları olacak merkez etrafında temel, 1 değeri, EGSH veya H2O2 artışlar ise aşağıdaki enjeksiyon oranı artmaya neden olur. Oksidatif değişiklikler neden xenobiotic ilişkin Değerlendirmeler 3 - 6 kez temel değerin bir aralıktaki değerlerin verim eğilimindedir.
  7. Yanıt-e doğru içinde ve deneyler arasında karşılaştırma yardımcı olmak için % 100 olarak yanıt-e doğru kontrol oksidan (örneğin, 1 mM H2O2) tanımlayarak normalleştirilmiş verileri maksimal sensör yanıt yüzdesi olarak ifade.
    Not: veri maksimal sensör yanıt yüzdesi olarak ifade varsa, bu denetim oksidan aynı yoğunlukta deneyler arasında tutarlı bir şekilde kullanıldığından emin olmak için önemlidir. Canlı hücre görüntüleme analizinden alınan tüm verileri mükellef araştırmacı takdirine seçilecek geleneksel pair-wise ve group-wise istatistiksel analiz için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İçinde değişiklikleri EGSH ve hücre içi H2O2 ' hafiye roGFP2 ve HyPer kullanımı iyi olmuştur25,36,42,43 daha önce açıklanan ve burada gösterilmiştir. Confocal görüntüleri roGFP2 temel ve H2O2 ve DTT aşağıdaki ek ifade hücre Şekil 2' de gösterilmiştir. Veriler deney boyunca toplanan görüntülerden sonra verilebilir ve Protokolü'nün 4 bölümde açıklandığı gibi analiz. Gösterildiği gibi eksojen H2O2 ek pozitif kontrol olarak tekrarlanabilir yanıt-e doğru verileri onların anılan sıraya göre taban çizgisine normalleştirilmiş ve tanımlanmış bir Dinamik Aralık bilinen eksojen ilavesi ile kurulan üretir oksidan/reductants (yani, H2O2 ve DTT) (3, 4 ve 5 rakamlar).

Toksikolojik uyaranlara yanıt genellikle daha fazla değişken bu denetimler tarafından indüklenen vardır. Xenobiotic bileşikleri için hücre içi proteinlerin dıştan Bisiklete binme Redoks arasında değişen hücrelerde, pleiotropic etkileri olabilir gibi beklenebilir, bu. Örnek roGFP2 ve hiper yanıt yaydıkları 9,10 PQ, phenanthrene44, atmosferik reaksiyonlar tarafından kurulan bir oksitleyici hava kirletici maruz indüklenen rakamlar 6 ve 7sunulmaktadır. Bu rakamlar grafiklerde Protokolü'nün 4 bölümde özetlenen veri analizi dahil her adım ilerlemesini tasvir. Gösterildiği gibi her hücre kendi temel ve pozitif kontrol (şekil 6B), normalleştirme ham veri (şekil 6A) sensör yanıtından büyüklüğü hücreler arası değişkenliği azaltır. Hücresel yanıt varyans ilgi nerede durumlarda veri normalleştirme şu ana kadar tek tek hücreler kendi satırlarında grafik tarafından temsil ile yapılabilir. Büyüklüğü veya Kinetik aynı çanak hücreleri arasında tepkilerin varyasyon örneğin hücre döngüsü farklılıkları yansıtmak önemli mekanik anlayışlar ortaya çıkarabilir. Alternatif olarak, tabak içinde hücrelerin ortalama yanıt standart sapma (şekil 6C) ile birlikte sunulabilir. Çoğaltır ayrı deney görüntülenirse, aksi halde veri normalleştirilmiş göreli Floresans yoğunluk değerleri veya denetim oksidan tarafından (3, 4, 5 ve 6 D rakamlar), indüklenen en büyük yanıt yüzdesi olarak sunulabilir Standart hata ortalamaya tarafından eşlik tüm çoğaltır ortalamasını gösteren. Ortam havası kirletici 9,10-güçlü Redoks cycler olduğu bilinen, hangi biz broşürüne hidrojen peroksit üretim HyPer (Şekil 7) tarafından algılanan döngüsel doruklarına sorumludur ve kademeli EGSH artırır PQ tespit roGFP2 () tarafından Şekil 6 D).

Figure 1
Resim 1 . RoGFP2 glutatyon Redoks geçiş. Hidrojen peroksit (H2O2) yanıt olarak GSSG için azaltılmış glutatyon (GSH) okside glutatyon peroxidases (GPx), böylece glutatyon Redoks potansiyeli (EGSH) artan. Fluorogenic sensörü roGFP2 ne zaman glutaredoxin (Grx) tarafından okside hücre içi EGSH ile Sakinleştiği. İndirgeyici yol Grx GSSG düzeyleri azaltmak ve GSH normal düzeyde NADPH pahasına glutatyon redüktaz (GR) tarafından yeniden roGFP2 deglutathionylation aracılığıyla azalma tromboksan. NADPH Pentoz fosfat yolu (PPP) üzerinden glikoz tarafından sağlanır. Gibbs-Flournoy ve ark35uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . İnsan bronş epitel hücre confocal mikroskobu görüntüleri satır BEAS-2B sitozolik roGFP2 ifade. Hücreleri 488 aydınlatılmış nm (A-D), 404 tarafından takip nm (E-H). Resimleri göster 510 yayılan Floresans nm aşağıdaki koşullar: temel (A, E), 100 µM H2O2(B, F), 1 mM H2O2 (C, G)ve 5 mM DTT (D, H). 60 X planı Apo VC amaç. Ölçek çubukları temsil 25 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Doz bağımlı değişiklikleri H2O2 BEAS-2B hücrelerdeki tarafından indüklenen roGFP2. Hücreler için 30 dk içinde fenol kırmızısı ücretsiz keratinosit Bazal medya (KBM) pozlama önce equilibrated. 5 dk. roGFP2 floresan 510 yayılan bir temel süre sonra H2O2 tüm eklemeler oluştu nm toplanan 525/30 nm bant geçiren kullanarak filtre lazer uyarma 404 ve 488 nm, ardından. Hücresel yanıt-e doğru onların ilgili temel ve en fazla sensör yanıt 1 mM H2O2eklenmesi aşağıdaki normalleştirilmiş. Değerleri ortalama ± standart hata, n sunulmaktadır = 3, burada n ortalama 5-10 bağımsız hücre oluşur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . Yanıt glikoz roGFP2 çeşitli H2O2doz için ifade BEAS-2B hücreleri açlıktan. Hücreler için 2 saat sonra Etkilenmeler önce glikoz içeren en az bir tuz orta equilibrated. 5 dk. roGFP2 floresan 510 yayılan bir temel süre sonra H2O2 tüm eklemeler oluştu nm toplanan 525/30 nm bant geçiren kullanarak filtre lazer uyarma 404 ve 488 nm, ardından. Hücresel yanıt-e doğru onların ilgili temel ve en fazla sensör yanıt 1 mM H2O2eklenmesi aşağıdaki normalleştirilmiş. Değerleri ortalama ± standart hata, n sunulmaktadır = 3, burada n ortalama 5-10 ayrı hücre oluşur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5. Yanıt BEAS-2B hücre HyPer H çeşitli doz için ifade 2 O 2 . Hücreler için 30 dk içinde fenol kırmızısı ücretsiz KBM pozlama önce equilibrated. 5 dk. Floresans 510 yayılan bir temel süre sonra H2O2 tüm eklemeler oluştu nm toplanan 525/30 nm bant geçiren kullanarak filtre lazer uyarma 404 ve 488 nm, ardından. Hücresel yanıt-e doğru onların ilgili temel ve en fazla sensör yanıt 1 mM H2O2eklenmesi aşağıdaki normalleştirilmiş. Değerleri ortalama ± standart hata, n sunulmaktadır = 3, burada n ortalama 5-10 ayrı hücre oluşur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6. RoGFP2 ifade BEAS-2B hücrelerinin yanıt-e doğru 9,10 PQ bağlı. Hücreler için 30 dk içinde fenol kırmızısı ücretsiz KBM pozlama önce equilibrated. 5 dk az 25 µM 9,10 PQ karıştırma ile eklenmesi oluştu buna ek olarak 1 mM H2tarafından takip O2 20 dk ve 5 mM DTT 24 dk. Panel A çanak, her hücre ayrı bir çizgiyle temsil tek tek hücreleri ham roGFP2 oranı gösteriyor. Panel B normalleştirme, onun temel sensör floresan için tek tek her hücre değerlerini gösterir ve ortalama ve standart sapma bu verilerin panelinde Cbireysel normalleştirilmiş oranları tarihinde eklenmiş. Maksimal sensör yanıt tüm hücreler arasında ortalama yüzdesini Dpanelinde tasvir edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7 . HyPer ifade BEAS-2B hücrelerinin yanıt-e doğru 9,10 PQ bağlı. Hücreler için 30 dk içinde fenol kırmızısı ücretsiz KBM pozlama önce equilibrated. 25 µM ilavesi O2 20 dk ve 5 mM DTT 25 dk. 510 yayılan Floresan, buna ek olarak 1 mM H2tarafından takip karıştırma ile 9,10-PQ 5 dk az oluştu nm toplanan 525/30 nm bant geçiren kullanarak filtre lazer uyarma 404 ve 488 nm, ardından. Hücresel yanıt-e doğru onların ilgili temel ve en fazla sensör yanıt 1 mM H2O2eklenmesi aşağıdaki normalleştirilmiş. Değerleri 5-10 ayrı hücreleri ortalaması sunulmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İçinde hafiye değişiklikler hücre içi EGSH ve H2O2, sırasıyla, roGFP2 ve HyPer kullanımı önceki fizyolojik ve toksikolojik çalışmalar 25,35,36 iyi tarif olmuştur ,39,40,41,42,43. Burada özetlenen Protokolü xenobiotic kaynaklı tedirginlikler hücre içi Redoks Homeostazı, değerlendirmek için tasarlanmış sivri toksikolojik çalışmalarda bu genetik olarak kodlanmış Redoks sensörler uygulamak için etkili bir şekilde bildirir. En önemlisi, bu sensörler doğru kullanımı sonuçta özgüllük ile pek çok geleneksel oksidatif stres yaklaşım eksikliği açıkladığınız bir belirli Redoks çifti veya ROS (EGSH veya H2O2), gözlenen değişiklikleri bağlar. İçinde bu sensörler, bazı koşulların oluşturulan verilerin kalitesini deneyler tasarlarken dikkate alınmalıdır temin ve veri analiz/yorumlama. Onlar şunlardır: 1) ve kullanımı uygun denetimleri, 2) uygun sensör yanıtları doğrulanması ve 3) deneysel parametreleri mekanizmaları aydınlatmak için manipülasyon. Bunlar ayrıca eksojen H2O2 ve DTT denetimleri olarak gözlem döneminin sonunda birden çok amaca hizmet eder. İlk olarak, bu toksik maksimum ve minimum sinyalleri ulaşılabilir göre yanıt algılayıcıdan büyüklüğü değerlendirmek için bir fırsat tanıyor. Bu yanıt deneyler arasında karşılaştırmalar için normalleştirme en yararlı olur. Buna ek olarak, güçlü eksojen oksidan ve indirgeyici uyaranlara eklenmesi ile deneme biten sensör/röle bütünlük önceki pozlama etkisini değerlendirebilirsiniz. Ayrıca, aldrithiol röle atlayıp doğrudan maruz kalma fluorophore kendisi uyguluyor potansiyel hasar için sensör işlevselliğini sınamak için Çalıştır sonunda eklenebilir.

Toksikolojik sonuçları belirli incelenmesi için bu yöntemi uygularken sadece diğer teknikleri olduğu gibi, yapılan gözlemler nitel Değerlendirmeler doğruluğu ile ilgili yapmak önemlidir. Ne zaman roGFP2 veya HyPer herhangi bir yeni xenobiotic ile kullanan ilk bu her uyarma dalga boyu üzerinden floresan yoğunluğu (510 nm emisyon) sağlarken dozlarda, bir dizi test önemlidir (404 nm ve 488 nm) uygun şekilde değiştirir (Yani artış veya azaltmak) için kullanılan Redoks bayım. Amaç hangi bir sensör tepki algılanabilir ama sensör aleni manipülasyon veya diğer non-spesifik etkiler bahçedeki tarafından boğulmuş değil bir doz belirlemektir. Doğrudan yaklaştırma veya hasar sensör atipik değişiklikler her iki uyarma dalga boyu (488 veya 404 nm), floresan tezahür. Nerede her iki sensör gözlenen sürekli uygunsuz bir toxicant ek olarak Etkilenmeler yanıt vermek için durumlarda bu araştırmacı incelenmesi ile ilgili olarak dosimetry, deneysel parametreleri dikkate önerilir hücre canlılığı, sensör ifade/veya yanıt-e doğru gözlemek için kullanılan araçları optik/Kromatik anormallikleri.

Toksikolojik herhangi bir okuma ile alınan veri genellikle daha fazla olduğu gözlenen yanıt muayene veya doğrulanacağını zaman anlamlı mekanik bir yaklaşım ve deneysel kısıtlamaları kullanarak olarak kabul edilir. Bu amaçla, sensör doğal özellikleri ile birlikte çeşitli deneysel parametreleri sağlam Redoks Değerlendirmeler oluşturmak için yararlı olabilir. Araştırmalar kullanmak için belirli roGFP2 sensörünün sonuçta hangi roGFP2 duyular EGSH (şekil 1) aracılığıyla Redoks geçiş endişe. Röle glutaredoxin (Grx), glutatyon redüktaz (GR) ve glutatyon peroksidaz (GPx) de dahil olmak üzere hücre içi enzimler içerir. Grx endojen düzeyleri hücresel kompartmanlarda ve hücre tipleri arasında farklılıkları EGSH ölçümleri etkilemeye ve deneyler zor43arasında karşılaştırmalar yapmak. Bu sorunla ilgili olarak, "füzyon probları" bir dizi sentez, hangi doğrudan roGFP2 sensör ilgili enzim link. Son olarak, insan Grx-1 roGFP2 için Gutscher ve meslektaşları32 forma Grx1-roGFP2 tarafından bağlıydı. RoGFP1 daha büyük bir dinamik aralık ve pH duyarsız olmak sahip ek olarak, Grx1-roGFP2 EGSH hücre tipleri veya hangi Grx aksi takdirde etkinlik sınırlama bölmeleri izleyebilirsiniz. NADPH seviyeleri hücre türleri arasında veya aynı çanak hücreleri arasında bile farklılıkları da değişkenlik roGFP2 yanıt-e doğru katkıda bulunabilir. NADPH Pentoz fosfat yolu ile glikoz elde edilir ve glutatyon redüktaz (GSSG azaltmak için GR)-ebilmek var olmak kullanmak geri GSH (şekil 1). Hücreleri aynı alanda farklı azalan bakiyeli kapasiteleri ile deneme başlarsanız, onların EGSH değişiklikleri ve elde edilen roGFP2 yanıt için bir uyarıcı tek tip olabilir. Bu sorun glukoz açlık hücresel NADPH stokları tüketir ve roGFP2 yanıt bütünleşir deneme önce bir süre boyunca surmounted. Azalmış kapasite EGSH kurtarma için de 25 µM H2O2 doz glikoz hücreleri normal glikoz konsantrasyonu (şekil 3 ve 4) takıma göre açlıktan hücrelerdeki görülebilir. Thusly, glukoz açlık seviyelerde NADPH manipülasyon sensör xenobiotic bir pozlama etkisini transducing içinde birden çok geçiş bileşen katılımı kontrol etmek için bir araç olarak hizmet verebilir. RoGFP2 toksikolojik bir bağlamda kullanırken başka bir endişe EGSHdeğiştirmek için doğrudan Redoks röle hareket yerine, sensör oksitleyici etkileşim xenobiotic için potansiyel mevcuttur. Doğrudan roGFP2 oksidasyonunu her noktası Redoks röle sondalama ve roGFP2 sinyal üzerindeki etkisini değerlendirmek tarafından belirlenebilir. Ozon bir uyarıcı kullanarak bu tekniğin bir örnek çalışma odasında Gibbs-Flournoy ve ark 35tarafından gösterilmiştir.

H2O2 sensör ile deneyler için bir Redoks röle üzerinden değil değil gibi ilgili, HyPer OxyR1 etki alanını H2O2 doğrudan duyu olarak yukarıdaki endişeleri vardır. Ancak, roGFP2 farklı olarak, H2O2 sensör değişiklikleri floresan H2O2 ' ye değil atfedilebilecek bir deney sırasında neden olabilir pH değişikliklerine duyarlıdır. Bu nedenle, düzgün tamponlu medya kullanımı istenilen sıcaklık ve araç denetimlerini korumak için çevre bir odası H2O2 sensör kullanan herhangi bir deneme için çok önemli. Ayrıca, fluorogenic sensörler özellikle monitör pH, pHRed, kırmızı kanal Floresans yayar ve ayrıca hiper45ifade hücrelerinde ortak ifade olabilir gibi geliştirilmiştir. SypHer, bu anlamda H2O2için işleme tek bir nokta mutasyon vardır, henüz pH kavramaları korur H2O2 sensör sürümüdür ideal pH denetimidir H2O2 sensör için 46. H2O2 sensör ifade hücreleri equilibrate, özellikle bir kuluçka sırasında yaşadıkları analizi, siteye taşınmaları sonra için daha uzun bir temel süre gerektiren Ayrıca gözlenmiştir ortam sıcaklığı ve pH hafif değişiklikler. Bu temelde herhangi bir pozlama başlamadan önce stabilize sonra en az 5 veri noktaları elde etmek için tavsiye edilir.

Bu yöntem, roGFP2 ve HyPer, tartışılan sensörler toksikoloji alanında ortaya çıkan uygulamalar çeşitli sahip birçok fluorogenic sensörleri ikisidir. Bu sensörler sadece EGSH ve H2O2ama peroxynitrite47, algılamak için tasarlanmış içerir nitrik oksit48,49ve hatta ozon50. Bu sensörler içinde yaşamak-hücre görüntüleme çalışmaları için özellikle yararlı olabilir ve hassas faiz oksidatif türlerin izlemek. Spektral unmixing gibi teknikleri gelişmeler ile ayrıca iki sensörleri benzer spektral özellikleri ile birlikte ifade etmek mümkündür (5 içinde birbirlerinin nm) aynı hücre ve her sensör51 tarafından yayılan Floresans oranı ayrı . Onlar uyarilmalar ve aynı dalga boyları, emisyon dahil bu teknik roGFP2 ve HyPer, belirli ilgi gibidir. Kısaca belirtildiği gibi burada, bazı sensörler için ilgi oksidatif olayları gözlemlemek için mitokondri gibi belirli hücre içi bölmeleri yönlendirilebilir. Ortaya çıkan bu sensörler ve teknikler bu yöntem kapsamı dışında olmakla birlikte, ücret ve iş arkadaşları52tarafından gözden geçirme gibi hücre içi Redoks sensörlerin konu hakkında çeşitli son yayınlar için okuyucu denir. Genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörleri canlı hücre görüntüleme ile oksidatif yanıtları toksikolojik Değerlendirmeler sırasında izlenmesi için güçlü bir araç kullanmaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu makalede açıklanan Araştırma Ulusal Sağlık ve çevre etkileri Araştırma Laboratuvarı, ABD Çevre Koruma Ajansı tarafından gözden geçirilmiş ve yayın için onaylanmış. Bu makalenin içeriğini ajansı ilke temsil etmek üzere alınmamalıdır, ne de ticari adlar veya ticari ürünler söz ciro veya kullanım için tavsiye teşkil etmez.

Acknowledgments

Yazarlar deneysel tasarım ve el yazması düzenlemeleri konusunda yardım almak için Katelyn Lavrich teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
roGFP2 Plasmid University of Oregon N/A Generous gift of S.J. Remington
HyPer Plasmid Evrogen FP941
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009
Dithiothreitol Sigma Aldrich 10708984001
9,10-Phenanthrenequinone Sigma Aldrich 156507
Black Wall Glass Bottomed Dishes Ted Pella 14029-20
BEAS-2B cell line American Type Culture Collection CRL-9609
Keratinocyte Basal Medium Lonza 192151
Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Excel  Microsoft Office Suite N/A
NIS-Elements AR Imaging Software Nikon N/A
Nikon C1si Confocal Imaging System Nikon N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cross, C. E., et al. Environmental oxidant pollutant effects on biologic systems: a focus on micronutrient antioxidant-oxidant interactions. Am J Respir Crit Care Med. 166, 44-50 (2002).
  2. Kobzik, L. Environmental particulate-mediated cytokine production in lung epithelial cells (A549): role of preexisting inflammation and oxidant stress. J Toxicol Environ Health. 55, 31-44 (1998).
  3. Jaeschke, H., McGill, M. R., Ramachandran, A. Oxidant stress, mitochondria, and cell death mechanisms in drug-induced liver injury: lessons learned from acetaminophen hepatotoxicity. Drug Metab Reviews. 44, 88-106 (2012).
  4. Wolf, M. B., Baynes, J. W. The anti-cancer drug, doxorubicin, causes oxidant stress-induced endothelial dysfunction. Biochim Biophys Acta. 1760, 267-271 (2006).
  5. Kumagai, Y., Shinkai, Y., Miura, T., Cho, A. K. The chemical biology of naphthoquinones and its environmental implications. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 52, 221-247 (2012).
  6. Pham, H. T., Maccarone, A. T., Campbell, J. L., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Ozone-induced dissociation of conjugated lipids reveals significant reaction rate enhancements and characteristic odd-electron product ions. J Am Soc Mass Spectrom. 24, 286-296 (2013).
  7. Abdel-Malek, Z. A., Kadekaro, A. L., Swope, V. B. Stepping up melanocytes to the challenge of UV exposure. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 171-186 (2010).
  8. Berisha, H., Pakbaz, H., Absood, A., Foda, H., Said, S. Nitric oxide mediates oxidant tissue injury caused by paraquat and xanthine oxidase. Ann N Y Acad Sci. 723, 422-425 (1994).
  9. Gao, X., et al. Mitochondrial dysfunction may explain the cardiomyopathy of chronic iron overload. Free Radic Bio Med. 49, 401-407 (2010).
  10. Shukla, A., et al. Asbestos induces mitochondrial DNA damage and dysfunction linked to the development of apoptosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 285, 1018-1025 (2003).
  11. Charles, R., Jayawardhana, T., Eaton, P. Gel-based methods in redox proteomics. Biochim Biophys Acta. 1840, 830-837 (2014).
  12. Thornalley, P. J., Rabbani, N. Detection of oxidized and glycated proteins in clinical samples using mass spectrometry-a user's perspective. Biochim Biophys Acta. 1840, 818-829 (2014).
  13. Arato, S., Ito, H., Miyashita, K., Hayakawa, K., Itabashi, Y. A facile method for the detection of aldehydes in oxidized lipids using solid-phase microextraction fiber and gas chromatograph equipped with a septum-free injector. J Oleo Sci. 58, 17-22 (2009).
  14. Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840, 794-800 (2014).
  15. Churg, A., Keeling, B., Gilks, B., Porter, S., Olive, P. Rat mesothelial and tracheal epithelial cells show equal DNA sensitivity to hydrogen peroxide-induced oxidant injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 268, 832-838 (1995).
  16. Fraga, C. G., Oteiza, P. I., Galleano, M. In vitro measurements and interpretation of total antioxidant capacity. Biochim Biophys Acta. 1840, 931-934 (2014).
  17. Niki, E., Noguchi, N. Evaluation of antioxidant capacity: what capacity is being measured by which method. IUBMB Life. 50, 323-329 (2000).
  18. Pharikal, K., Das, P., Dey, C., Dasgupta, S. Tissue ascorbate as a metabolic marker in cadmium toxicity. Int J Vitam Nut Res. 58, 306-311 (1987).
  19. Tabata, M., Totani, M., Murachi, T. A chemiluminometric method for NADPH and NADH using a two-enzyme bioreactor and its application to the determination of magnesium in serum. Biomed Chrom. 4, 123-127 (1990).
  20. Ballatori, N., et al. Glutathione dysregulation and the etiology and progression of human diseases. Biol Chem. 390, 191-214 (2009).
  21. Nauseef, W. M. Detection of superoxide anion and hydrogen peroxide production by cellular NADPH oxidases. Biochim Biophys Acta. 1840, 757-767 (2014).
  22. Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection and characterisation of radicals in biological materials using EPR methodology. Biochim Biophys Acta. 1840, 708-721 (2014).
  23. Kettle, A. J., et al. Measuring chlorine bleach in biology and medicine. Biochim Biophys Acta. 1840, 781-793 (2014).
  24. Carballal, S., Bartesaghi, S., Radi, R. Kinetic and mechanistic considerations to assess the biological fate of peroxynitrite. Biochim Biophys Acta. 1840, 768-780 (2014).
  25. Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxid Redox Signal. 13, 621-650 (2010).
  26. Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J Biol Chem. 279, 22284-22293 (2004).
  27. Malinouski, M., Zhou, Y., Belousov, V. V., Hatfield, D. L., Gladyshev, V. N. Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PloS One. 6, 14564 (2011).
  28. Guzman, J. N., et al. Oxidant stress evoked by pacemaking in dopaminergic neurons is attenuated by DJ-1. Nature. 468, 696-700 (2010).
  29. Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nat Med. 20, 555-560 (2014).
  30. Wolf, A. M., Nishimaki, K., Kamimura, N., Ohta, S. Real-time monitoring of oxidative stress in live mouse skin. J Invest Dermatol. 134, 1701-1709 (2014).
  31. Mishina, N. M., et al. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally. Antioxid Redox Signal. , (2011).
  32. Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nat Methods. 5, 553-559 (2008).
  33. Lohman, J. R., Remington, S. J. Development of a family of redox-sensitive green fluorescent protein indicators for use in relatively oxidizing subcellular environments. Biochem. 47, 8678-8688 (2008).
  34. Schafer, F. Q., Buettner, G. R. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic Bio Med. 30, 1191-1212 (2001).
  35. Gibbs-Flournoy, E. A., Simmons, S. O., Bromberg, P. A., Dick, T. P., Samet, J. M. Monitoring intracellular redox changes in ozone-exposed airway epithelial cells. Environ Health Perspect. 121, 312 (2013).
  36. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
  37. Wood, Z. A., Poole, L. B., Karplus, P. A. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science. 300, 650-653 (2003).
  38. Sies, H. Role of Metabolic H2O2 Generation REDOX SIGNALING AND OXIDATIVE STRESS. J Biol Chem. 289, 8735-8741 (2014).
  39. Cheng, W. -Y., et al. Linking oxidative events to inflammatory and adaptive gene expression induced by exposure to an organic particulate matter component. Environ Health Perspect. 120, 267 (2012).
  40. Cheng, W. -Y., et al. An integrated imaging approach to the study of oxidative stress generation by mitochondrial dysfunction in living cells. Environ Health Perspect. , 902-908 (2010).
  41. Wages, P. A., et al. Role of H 2 O 2 in the oxidative effects of zinc exposure in human airway epithelial cells. Redox Biol. 3, 47-55 (2014).
  42. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E GSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radic Bio Med. 51, 1943-1951 (2011).
  43. Schwarzländer, M., Dick, T. P., Meyer, A. J., Morgan, B. Dissecting redox biology using fluorescent protein sensors. Antiox Redox Signal. 24, 680-712 (2016).
  44. Wang, L., Atkinson, R., Arey, J. Formation of 9, 10-phenanthrenequinone by atmospheric gas-phase reactions of phenanthrene. Atmos Environ. 41, 2025-2035 (2007).
  45. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
  46. Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: applications in neuroscience and regenerative biology. Biochim Biophys Acta. 1850, 2318-2328 (2015).
  47. Hou, J. -T., et al. A highly selective water-soluble optical probe for endogenous peroxynitrite. Chem Commun. 50, 9947-9950 (2014).
  48. Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
  49. Gabe, Y., Ueno, T., Urano, Y., Kojima, H., Nagano, T. Tunable design strategy for fluorescence probes based on 4-substituted BODIPY chromophore: improvement of highly sensitive fluorescence probe for nitric oxide. Anal Bioanal Chem. 386, 621-626 (2006).
  50. Garner, A. L., et al. Specific fluorogenic probes for ozone in biological and atmospheric samples. Nat Chem. 1, 316-321 (2009).
  51. Cheng, W. -Y., Larson, J. M., Samet, J. M. Monitoring intracellular oxidative events using dynamic spectral unmixing microscopy. Methods. 66, 345-352 (2014).
  52. Wages, P. A., Cheng, W. -Y., Gibbs-Flournoy, E., Samet, J. M. Live-cell imaging approaches for the investigation of xenobiotic-induced oxidant stress. Biochim Biophys Acta. 1860, 2802-2815 (2016).

Tags

Imaging kanser araştırmaları sayı: 132 oksidatif stres toksikoloji Floresan Live-hücre peroksit glutatyon hidrojen
Genetik olarak kodlanmış Fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin Değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Corteselli, E. M., Samet, J. M.,… More

Corteselli, E. M., Samet, J. M., Gibbs-Flournoy, E. A. Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors. J. Vis. Exp. (132), e56945, doi:10.3791/56945 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter