Name: Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Aprenda a refoldar e purificar o domínio de ligação do quimiorreceptor Tlp3 de corpos de inclusão de Campylobacter jejuni. Este método recupera miligramas de proteína funcional para estudos estruturais e de triagem de ligantes.

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Agradecemos seus primeiros trabalhos sobre a produção de Tlp3-LBD-Yu C. Liu. Mayra A. Machuca está em dívida com o Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS para uma bolsa de doutorado.

1. a expressão de seu6-Tlp3-LBD em e. coli
<ol><li>Inocular a 150 mL de caldo de Luria-Bertani (LB) estéril contendo 50 µ g ampicilina de-1 de mL com BL21-códon-Plus (DE3) - células RIPL transformadas com o vetor de pET151/D-TOPO para expressão de seu6- Tlp3-LBD (resíduos de aminoácidos 42-291), e -incube a 37 ° C em um shaker (diâmetro da órbita, 25mm) com 200 rpm durante a noite.</li>
	<li>Prepare-se seis Erlenmeyers de 2L contendo 800 mL de caldo estéril de LB e 50 µ g ampicilina de-1 mL. Inocule cada frasco com 20 mL de cultura durante a noite, Obtida de passo 1.1. -Incube a 37 ° C, com agitação contínua a 200 rpm até a densidade óptica em 600 nm atinge 0,6.</li>
	<li>Tomar um mL 1 alíquota de um dos frascos (amostra de controle uninduced), pelota utilizando uma centrífuga de bancada (13.000 x g, 4 ° C, 10 min) e descartar o sobrenadante. Armazene a pelota bacteriana a-20 ° C para posterior análise de SDS-PAGE.</li>
	<li>Induzi a expressão de proteínas adicionando 1 mM de isopropil-β-D-thiogalactoside (IPTG) para cada balão com cultura. Continue incubando os frascos a 37 ° C em uma coqueteleira a 200 rpm para um adicional 4 h.</li>
	<li>Recolher as células por centrifugação a 5.000 x g, durante 15 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Nota: neste ponto, o procedimento pode ser pausado, colocando o centrifugado em um freezer-80 ° C para armazenamento.</li>
</ol>2. isolamento e desnaturação de corpos de inclusão
<ol><li>Transferir todas as pelotas de célula obtidas na etapa de 1,5 para um copo de 250 mL e adicionar 100 mL de tampão A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl). Permitir que as células descongelar completamente (se congelado) e resuspenda o pellet. Manter a amostra em gelo, salvo indicação em contrário.</li>
	<li>Passe as ressuspensa células através de um homogeneizador de alta pressão três vezes para lisar as células e assegurar a completa distorção do DNA genômico.</li>
	<li>Centrifugue o lisado a 10.000 x g, durante 15 min a 4 ° C. Recolher uma amostra de 1 mL do sobrenadante (fração solúvel) e armazená-lo a-20 ° C para posterior análise de SDS-PAGE. Descartar o resto do líquido sobrenadante e colocar a pelota no gelo. Nota: Esta pelota é na cor branca (facilmente distinguíveis de células contínua, que são as tonalidades de marrom na cor) e contém corpos de inclusão.</li>
	<li>Resuspenda o pellet de corpos de inclusão completamente em 20 mL de tampão gelada B (pH 10 mM Tris-HCl 8.0, fluoreto de phenylmethanesulfonyl de 0,2 mM (PMSF), 1% Triton X-100). Isto facilita a solubilização da membrana e proteínas da membrana. Vórtice para 1-2 min a ressuspensão de auxílio.</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 10.000 x g, durante 15 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 20 mL de tampão gelada B vortexing o tubo para o 1-2 min.. Certifique-se de que a pelota é quebrada em pedaços pequenos. Pipetar o exemplo acima e para baixo para ajudar a ressuspensão de sedimento. Nota: É importante resuspenda o pellet cuidadosamente, para se obter corpos de inclusão livres de impurezas.</li>
	<li>Repita a etapa 2.5. Se o sobrenadante está nublado ou coloridos, repita os passos de 2.6 e 2.5 (nessa ordem) até que o sobrenadante é clara e incolor.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 20 mL de tampão gelada C (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,2 mM PMSF) pela utilização do Vortex o tubo para o 1-2 min.</li>
	<li>Repita a etapa 2.5.</li>
	<li>Adicione 25 mL de tampão de desnaturação gelada D (pH 8.0, ureia de 8 M, 10 mM ditiotreitol (DTT), 0,2 mM PMSF de 10 mM Tris-HCl) para dissolver a pelota de corpos de inclusão. Resuspenda completamente vortexing para 1-2 min, ou até a pelota é quebrada em pedaços pequenos.</li>
	<li>Misture a suspensão por rotação axial com uma taxa de rotação de 30 rpm para 30 a 120 min a 4 ° C.</li>
	<li>Esclarecer a solução da proteína desnaturada por centrifugação a 30.000 x g, 4 ° C por 30 min, coloque o sobrenadante no gelo e descartar a pelota.</li>
	<li>Medir a concentração de proteína usando o ensaio de Bradford. 24 tomar uma alíquota para análise do gel de SDS e colocá-lo a-20 ° C. Nota: neste ponto, o procedimento pode ser pausado por snap-congelamento em nitrogênio líquido a amostra aliquotada e mantê-lo a-80 ° C para armazenamento.</li>
</ol>3. proteína dobrar
<ol><li>Preparar 250 mL de tampão E (3M ureia, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,4 M monocloridrato de L-arginina, 20 milímetros reduzida L-glutationa, 2 L-glutationa oxidada milímetros) em um copo de 500 mL e arrefecer o buffer até 4 ° C.</li>
	<li>Adicionar 60 mg de mistura de proteína desnaturada contendo seu6-Tlp3-LBD obtido na etapa 2.13 a 250 mL de tampão E, agitando o buffer a 500 rpm. Incube a mistura redobramento em 4 ° C, com agitação contínua a 500 rpm por 24-48 h. A concentração de proteína final nesta etapa é 0,2 mg mL-1.</li>
	<li>Preparar 7 L de tampão A um balde de 8-10 L e resfriá-lo até 4 ° C, em preparação para o próximo passo (3.4) que terá lugar em 24-48 h (Veja o fluxograma na Figura 1).</li>
	<li>Mergulhe um pedaço de ~ 50 cm de tubo de diálise de diâmetro inflado de 28 mm, com peso molecular de corte em 12-14 kDa em 200 mL de sal de ácido dissódico 10mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA-at2) e aqueça-o em uma chama de gás até ferver. Lavar a membrana de diálise com 200 mL de DDQ2O.</li>
	<li>Prenda uma extremidade da membrana com um fechamento do tubo de diálise diálise e transferir a 250 mL de dobrar a mistura obtida na etapa 3.2 dentro do tubo de diálise. Feche a extremidade aberta com outra pinça. Verificar a integridade da membrana para garantir que não existem fugas.</li>
	<li>Coloque o tubo de diálise em um balde de diálise com o pre-cooled 7 L do tampão A preparada no passo 3.3. Coloque uma agitação magnética bar, garantindo que ele não vai tocar, agitando o tubo de diálise.</li>
	<li>Dialize a amostra a 4 ° C, com continua agitando a 500 rpm e alterar o buffer de pelo menos quatro vezes durante um período de 12 h. Após a última alteração de reserva, deixe a amostra para Dialize durante a noite. Nota: Durante a diálise, o excesso de ureia (~ 3M) gradualmente é removido da solução proteína desnaturada, que permite que a proteína a redobrar. Precipitação de proteínas pesado pode ser observada no final da diálise.</li>
	<li>Retire o tubo de diálise do balde e transferir seu conteúdo para um copo de 500 mL. Manter a solução de proteína no gelo, salvo indicação em contrário.</li>
	<li>Filtre a solução da proteína através de uma membrana de tamanho de poro de 0.43 µm em um frasco de vidro de 500 mL para remover qualquer proteína precipitada.</li>
</ol>4. purificação de seu6-com a tag proteína usando cromatografia de afinidade do íon do Metal imobilizado
<ol><li>
Cobrar e equilibrar uma coluna de quelantes pré-embalados de 5 mL.
	<ol>
<li>Conectar-se a coluna a uma bomba peristáltica, assegurando que não haja nenhum ar preso na tubulação de conexão.</li>
		<li>Lavar a coluna passando através de 25-50 mL de DDQ2O.</li>
		<li>Cobrar a coluna carregando 3 mL de 0.1 M NiCl2 e então passando através de 25 mL de DDQ2O.</li>
		<li>Equilibrar a coluna com 25 mL de tampão F (amortecedor do carregamento, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, NaCl, imidazol de 20 mM a 500 mM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajuste a amostra de proteína reabertos obtida na etapa 3,9 para a composição do buffer F adicionando 2,5 mL de 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL de 5 M NaCl e 2,5 mL das soluções estoque de 2m imidazol.</li>
	<li>Carrega a amostra para a coluna em uma taxa igual ou inferior a 5 mL/min e descarte o escoamento (as proteínas unbound).</li>
	<li>Lave a coluna com 50-100 mL de buffer F para remover as proteínas não especificamente ligadas e descartar o escoamento.</li>
	<li>Eluir a6-Tlp3-LBD com 25 mL de tampão G (tampão de eluição, 20 mM Tris-HCl, NaCl, imidazol 500 mM a 500 mM) e pool de escoamento frações que contêm a proteína (conforme determinado pelo usando o reagente de Bradford).</li>
	<li>Medir a concentração de proteína na amostra em pool usando o ensaio de Bradford. Pegue uma pequena alíquota para análise de SDS-PAGE e lugar a-20 ° C.</li>
</ol>5. seu6-marca remoção usando TEV Protease (opcional)
<ol><li>Prepare-se e esfriar até 4 ° C, 4L de H de buffer (buffer de clivagem TEV, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM de NaCl, 1% (v/v) glicerol, 2 mM DTT).</li>
	<li>Corte aproximadamente 5-7 cm de tubo de diálise (diâmetro de 2-3 cm) e mergulhe-a em 200 mL de DDQ2O.</li>
	<li>Adicionar seu6-com a tag protease do PEV para a sua6-proteína marca preparado na etapa 4.5 para uma relação molar final 1 TEV: proteína 8.</li>
	<li>Fixe uma extremidade do tubo com um fechamento do tubo de diálise e encha-o com a mistura de protease de proteína/TEV. Feche a outra extremidade e garantir que não existem fugas.</li>
	<li>Lugar a diálise do tubo para o pre-cooled 4 L de tampão H (da etapa 5.1) e incube-a 4 ° C, com contínua mexendo por 2 h. alterar o buffer e continuar a diálise durante a noite para permitir que a reação de clivagem mediada por TEV completar.</li>
	<li>Enquanto isso, prepare-se e legal (4 ° C) 4 L de tampão eu (pH 8.0, 150 mM de NaCl, 1% (v/v) glicerol de 10 mM Tris-HCl) em preparação para o dia seguinte.</li>
	<li>Após a diálise durante a noite, trocar o buffer para buffer que preparei na etapa 5.6 e Dialize para um mais 1-2 h a 4 ° C.</li>
	<li>Retire o tubo do balde a diálise, solte uma das extremidades do tubo e transferir a solução da proteína para um tubo Falcon de 50ml. Filtrar a solução através de um filtro de seringa de tamanho de poro de 0.43 µm e mantê-lo no gelo, salvo indicação em contrário.</li>
	<li>Medir o volume da amostra e ajustar a concentração de Tris, NaCl e imidazol para a composição do buffer F (por exemplo, para 25 mL de solução de proteína no buffer J adicionar 0,25 mL de 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL de 5 M NaCl e 0,25 mL de imidazol 2 M).</li>
	<li>Prepare uma coluna HiTrap quelantes HP de 5 mL, conforme descrito na etapa 4.1.</li>
	<li>Carregar a amostra na coluna (vazão: 5 mL/min) e coletar o escoamento, que contém a formatação Tlp3-LBD (resíduos 42-291). Proteína uncleaved, o clivada seu6-tag e seu6- PEV são retidos pela coluna.</li>
	<li>Lave a coluna com 5 mL de tampão F (tampão de carregamento) para permitir que todas as proteínas não marcas fluir e recolher o eluato.</li>
	<li>Piscina o eluato obtido nas etapas 5.11 e 5.12 e mede a concentração de proteína. Pegue uma pequena alíquota e armazená-lo a-20 ° C para análise de SDS-PAGE.</li>
</ol>6. tamanho-exclusão cromatografia (Gel filtração) de Tlp3-LBD
<ol><li>Preparar 1 L de tampão A (pH 8.0, 150 mM NaCl de 10 mM Tris-HCl) e filtrá-la usando uma membrana de 0.43 µm.</li>
	<li>Equilibrar uma coluna de tamanho-exclusão 26/60 com tampão A um débito de 4 mL/min.</li>
	<li>Concentre a amostra de proteína obtida na etapa 5.13 a um volume de 3-4 mL usando concentrador de centrífuga de 15 mL com um corte de kDa 10 (4 ° C, 4.000 x g).</li>
	<li>Esclarecer a solução da proteína por centrifugação a 13.000 x g, 4 ° C por 30 min remover qualquer proteína precipitada.</li>
	<li>Carrega a amostra para a coluna de filtração de gel de 26/60 pre-equilibrado. Realize a cromatografia em tampão A um débito de 4 mL/min. Monitor o rastreamento de UV. Tlp3-LBD elutes em um volume de retenção de 210-220 mL. As frações de pico da piscina.</li>
	<li>Medir a concentração de proteína. Pegue uma pequena alíquota para análise de SDS-PAGE.</li>
</ol>7. SDS-PAGE de análise das amostras coletadas em vários estágios de purificação de proteínas
<ol><li>Preparar 1 L de buffer de execução de SDS-PAGE (tampão J), contendo 25 mM Tris, 250mm glicina pH 8.3 e 0,1% (p/v) de sódio Dodecil sulfato (SDS).</li>
	<li>Prepare-se 10 mL de 5 x amortecedor do carregamento SDS-PAGE (tampão de K), contendo 0,25 M Tris-HCl pH 6,8, SDS 10% (p/v), 50% (v/v) glicerol, 1 milímetro DTT e 0,05% bromofenol azul.</li>
	<li>Permitir que as alíquotas recolhidas durante as diferentes etapas da purificação (etapas 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) para descongelar.</li>
	<li>Para cada amostra, misturar o volume correspondente a 15 µ g de proteína total com 2 µ l de 5x SDS-PAGE de carregamento do buffer e ajuste o volume para 10 µ l com DDQ2O.</li>
	<li>Aquecer as amostras a 95 ° C por 5-10 min, girá-los a 10.000 x g, durante 30 s e transferência das amostras em um tubo limpo.</li>
	<li>Preparar um gel de SDS-PAGE, usando 15% de poliacrilamida separando o gel (para 30% (p/v) de 5 mL: 2,5 mL bis-acrilamida, 1,2 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8.8, 1,2 mL ddH2O, 50 µ l 10% (p/v) SDS, 50 µ l 20% (p/v) de amônio persulfato (APS), 3 µ l tempted (TEMED) e poliacrilamida 5% gel de empilhamento (para 2 mL: 340 µ l 30% (p/v) bis-acrilamida, 250 µ l 1m pH do Tris 6,8, 1,37 mL ddH2O, 20 µ l 10% (p/v) SDS, 20 µ l 20% (p/v) APS, 2 µ l TEMED).</li>
	<li>Montar o aparelho de eletroforese e preenchê-lo com 1x SDS Página executando o buffer de acordo com a recomendação do fabricante.</li>
	<li>Carrega um marcador de peso molecular de proteínas e as amostras preparadas na etapa de 7,5. Realizar a eletroforese em uma corrente constante de 25 mA.</li>
	<li>Transferir o gel em um recipiente e lave-o com DDQ2O. Adicionar 150 mL de solução contendo isopropanol de 25% (v/v), ácido acético a 10% (v/v) e 0,03% (p/v) R-250 azul brilhante de coloração o azul de Coomassie. Coloque o recipiente sobre uma plataforma horizontal de rotação por 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave o gel com O ddH2e coloque na descoloração solução contendo 5% (v/v) de metanol e 7% (v/v) de ácido acético. Destain enquanto mistura usando uma plataforma de rotação horizontal por 1h.</li>
	<li>O gel de imagem e analisar.</li>
</ol>8. circular Dicroísmo (CD) espectroscopia análise da estrutura secundária da proteína pura reabertos
<ol><li>Transferência de 0,5 - 1 mg de proteína reaberta obtida na etapa 6.6 em um tubo de diálise e coloque-o em um balde de diálise contendo 5 L de tampão L (50mm de sódio fosfato pH 7,4), pré-resfriado a 4 ° C. Dialize a amostra a 4 ° C, com agitação contínua e realizar alterações de reserva de pelo menos 3-4 mais 2-4 h antes de deixar a amostra para Dialize durante a noite.</li>
	<li>Concentre a solução de dialysed de proteína para 0,06 mg mL-1 , usando um concentrador centrífugo de corte 10 kDa.</li>
	<li>Esclarecer a solução por centrifugação a 13.000 x g, 4 ° C por 30 min.</li>
	<li>Grave CD espectro UV distante da amostra a 25 ° C em um intervalo de comprimento de onda de 200-260 nm, utilizando um spectropolarimeter com uma taxa de varredura de 20 nm min-1. Use o buffer de diálise como um controle em branco. Repetir a gravação em triplicado e gerar o espectro em média.</li>
	<li>Calcular o teor de estrutura secundária por deconvoluting o CD usando o programa CDSSTR do DichroWeb de espectros cortar25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).</li>
</ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Um procedimento simples para a expressão e dobrar de corpos de inclusão do LBD periplasmático da chemoreceptor bacteriana Tlp3 é apresentado. Preparação da proteína pura envolve sobre-expressão do gene do animal de estimação-plasmídeo-codificado em e. coli, purificação e solubilização de corpos de inclusão, dobrar de proteína desnaturada e sua purificação por afinidade a consecutivos e etapas da cromatografia de exclusão de tamanho. A desnaturação de ureia-facilitado e diluição/diálise-mediada dobrar são os pass...

Quimiotaxia e a motilidade foram mostrados para desempenhar um papel importante na patogênese de Campylobacter jejuni , promovendo a colonização bacteriana e a invasão do hospedeiro1,2,3. Quimiotaxia permite que as bactérias para avançar para um ambiente ideal para o crescimento, como guiado por sinais químicos. Esse processo envolve o reconhecimento de sugestões químicas intracelulares e ambientais por um conjunto de proteínas denominadas quimiorreceptor ou transdutor, como proteínas (TIPS). A maioria dos quimiorreceptores são proteínas de membrana-incorporado com um extracytoplasmic ligand binding domain (LBD), um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático de sinalização, o último dos quais interage com as proteínas de sinalização citosólica que transmitem o sinal o flagelar motores4,5,6,,7.
Foram identificados onze quimiorreceptor diferentes do genoma de c. jejuni 4,8. Até à data, apenas alguns destes quimiorreceptores têm sido caracterizados e a especificidade de ligante de Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712e Tlp1113 é conhecida. Identificação de ligantes naturais dos restantes quimiorreceptor nesta espécie e numerosos quimiorreceptor em outras bactérias, pode ser facilitada pela produção de dobrada e altamente puro recombinante chemoreceptor LBDs14, 15 , 16. no entanto, as tentativas de heterologously express LBDs periplasmático de quimiorreceptores bacterianas em Escherichia coli muitas vezes resultam em seu direcionamento em corpos de inclusão17,18,19 . No entanto, este fenómeno pode facilitar fácil isolamento e recuperação da proteína na mão. Aqui, um método é apresentado para recuperação de proteína de corpos de inclusão, dobrar e purificação, usando o LBD periplasmático do c. jejuni chemoreceptor Tlp3 como exemplo. Este exemplo foi escolhido porque Tlp3-LBD pertence a família dCACHE20 de sensoriamento domínios que são encontrados abundantemente em dois-componente histidina quinases e quimiorreceptores em procariontes20,21, 22 , 23.
Nesta abordagem, a construção de expressão, com base em um vetor TOPO-pET151/D, foi projetada para incorporar um N-terminal dele6-etiqueta, seguido de um tabaco etch local de clivagem do protease do vírus (TEV), para marca subsequente remoção19. O protocolo descreve a superexpressão da proteína em e. coli, isolamento e solubilização de ureia-mediada de corpos de inclusão e proteína dobrar pela depleção de ureia. Após dobrar, a amostra é purificada por cromatografia de afinidade, com cromatografia de remoção e tamanho-exclusão opcional marca. O estado dobrado da proteína purificada é confirmado usando espectroscopia de Dicroísmo circular. Esta é uma versão modificada do método que foi desenvolvido anteriormente para recuperar e purificar o LBD de um chemoreceptor diferente, Helicobacter pylori TlpC19. Este procedimento, resumido na Figura 1, produz 10 a 20 mg de puro, sem marcas de formatação Tlp3-LBD por 1 L de cultura bacteriana, com uma pureza de proteína de > 90%, como estimado por SDS-PAGE.

<table><tbody><tr><td>Base Tris</td><td>AMRESCO</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>MERK MILLIPORE</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>G-BIOSCIENCES</td><td>A051-B</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF)</td><td>MERCK</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-tiogalactosídeo (IPTG)</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> AST0487 <tr><td>Ureia</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0568</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td>C-1029</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de L-arginina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5131</td><td></td></tr><tr><td>L-glutationa reduzida</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>L-glutationa oxidada</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético desidratado (EDTA)</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC20302.260</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> BIOGB0232 <tr><td>Cloreto de níquel (NiCl2)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0167</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Escada de proteína não corada, larga Faixa (10-250 kDa)</td><td>NEW ENGLAND BIOLABS</td><td>P7703</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultracel centrífugo concentrador (Millipore)</td><td>MERCK</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo</td><td>Falcon</td><td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálise</td><td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td><td></td> Diálise <td></td></tr><tr><td>Tubo de diálise de pele de cobra</td><td>THERMO SCIENTIFIC&trade;</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Coluna Quelante HP HiTrap Pré-embalada</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>17-0408-01</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C5 homogeneizador de alta pressão</td><td>AVESTIN</td><td>EmulsiFlex&trade; -</td> Bomba Peristáltica C5 <td></td></tr><tr><td>P-1</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>18-1110-91</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HiLoad 26/60 coluna de exclusão de tamanho&nbsp;</td><td>GE HEALTHCARE CIÊNCIAS DA VIDA</td><td></td><td></td></tr> 28989336 <tr><td>JASCO J-815 espectropolarímetro</td><td>JASCO</td><td>J-815</td><td></td></tr></tbody></table>

método para dobrar eficiente e purificação do chemoreceptor ligand binding domain

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identificação de ligantes naturais de quimiorreceptores e estudos estruturais destinados a elucidação da base molecular da especificidade ligante pode ser facilitada pela produção de quantidades de miligrama de domínios de ligação do ligante puro, dobrado. As tentativas de heterologously express domínios de ligação ligante periplasmático de quimiorreceptores bacterianas em Escherichia coli (e. coli) muitas vezes resultam em seu direcionamento em corpos de inclusão. Aqui, um método é apresentado para recuperação de proteína de corpos de inclusão, dobrar e purificação, usando o domínio de ligação do ligante dCACHE periplasmático de Campylobacter jejuni (c. jejuni) chemoreceptor Tlp3 como exemplo. A abordagem envolve a expressão da proteína de interesse com um cleavable seu6-tag, isolamento e solubilização mediada por ureia, de corpos de inclusão, proteína dobrar pela depleção de ureia e purificação através de cromatografia de afinidade, seguido por cromatografia de tamanho-exclusão e remoção de marca. A espectroscopia de Dicroísmo circular é usada para confirmar o estado dobrado da proteína pura. Foi demonstrado que este protocolo é geralmente útil para produção de quantidades de miligrama de domínios de ligação ligante periplasmático dCACHE de outros quimiorreceptor bacteriana na forma solúvel e crystallisable.

Expressão recombinante de seu6-Tlp3-LBD em e. coli resultou na deposição de proteína em corpos de inclusão. O expressão rendimento de 1 L de cultura bacteriana, calculada na etapa 2.13 foi aproximadamente 100 mg de seu6-Tlp3-LBD depositado em corpos de inclusão. O procedimento de isolamento de proteína, aqui descrito e ilustrado na Figura 1, consiste a solubilização de corpos de inclusão, proteína dobrar e purificação, através d...

Um procedimento é apresentado para o dobrar do domínio de ligação do ligante periplasmático dCACHE de Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 de corpos de inclusão e a purificação para produzir quantidades de miligrama de proteína.

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

O objetivo geral deste procedimento é redobrar um domínio de ligação ao ligante quimiorreceptor de corpos de inclusão e purificá-lo para uso em estudos estruturais e funcionais. Para estabelecer quais sinais um quimiorreceptor bacteriano envia e como, pode-se usar os domínios de ligação de ligantes isolados para rastrear bibliotecas de pequenas moléculas ou para determinar a estrutura com e sem ligante. A supressão do domínio de ligação ao ligante extracelular em E.coli geralmente resulta na deposição em corpos de inclusão.Aqui, mostramos como a quantidade de miligramas de proteína funcional pode ser recuperada dos corpos de inclusão. Para começar, inocule 150 mL de caldo LB estéril contendo 50 microgramas por mL de ampicilina com células BL21-CodonPlus RIPL transformadas com o vetor pET151 D-TOPO para expressão de hexa-histidina TIp3-LBD. Incube a cultura a 200 RPM e 37 graus Celsius durante a noite.Prepare seis frascos de Erlenmeyer de 2L contendo 800 mL de caldo LB estéril e 50 microgramas por mL de ampicilina. Inocular cada balão com 20 ml da cultura durante a noite. Incubar os frascos a 37 graus Celsius com agitação contínua a 200 RPM até que o OD600 atinja 0,6.Neste ponto, in

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Descrevemos a implementação da estratégia REPLACE para direcionar as interações proteína-proteína. REPLACE é uma estratégia iterativa envolvendo abordagens sintéticas e computacionais para a conversão de inibidores peptídicos otimizados em moléculas semelhantes a drogas.

Desenvolvimento de inibidores de interacções proteína-proteína através REPLACE: Aplicação para a concepção e desenvolvimento não-ATP inibidores de CDK Competitiva

Aqui, descrevemos métodos que comumente empregamos em laboratório para determinar como a natureza da interação entre o receptor de células T e os antígenos tumorais, apresentada por antígenos leucocitários humanos, governa a funcionalidade das células T; esses métodos incluem produção de proteínas, cristalografia de raios-X, biofísica e experimentos funcionais de células T.

Usando cristalografia de raios X, Biofísica, e os ensaios funcionais para determinar a célula T mecanismos que regem o reconhecimento do receptor de Câncer Antígenos

Um protocolo para experiências FRET de alta precisão no nível de molécula única é apresentado aqui. Adicionalmente, esta metodologia pode ser utilizada para identificar três estados conformacionais no domínio de ligação ao ligando do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar distâncias precisas é o primeiro passo para construir modelos estruturais baseados em experimentos FRET.

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

Criar sistemas quimicamente induzidos da dimerização da proteína com afinidade e especificidade desejadas para toda a ligand pequena da molécula dada teria muitas aplicações biológicas da detecção e do atuação. Aqui, descrevemos um método eficiente e generalizável para a engenharia de novo de sistemas de dimerização quimicamente induzidos através da seleção manada de uma biblioteca de anticorpos combinatorial de domínio combinatório exibida por fago.

Criando sistemas de dimerização de proteínas quimicamente induzidas altamente específicos pela seleção de fagos de uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatorial

Este estudo apresenta um procedimento detalhado para realizar experimentos de transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) em receptores acoplados à proteína G (GPCRs) usando marcação site-specific via incorporação de aminoácidos não naturais (UAA). O protocolo fornece um guia passo a passo para a preparação de amostras smFET, experimentos e análise de dados.

Visualizando a dinâmica conformacional de receptores de membrana usando FRET de molécula única

Este protocolo apresenta as ferramentas disponíveis para modelar ligantes de moléculas pequenas em mapas crioEM de macromoléculas.

Modelagem de ligantes em mapas derivados da criomicroscopia eletrônica

Descrevemos uma metodologia baseada na diversificação de sequências para estimar as preferências de aminoácidos de sítios de ligação multiespecíficos em interações proteína-proteína (PPIs). Nessa estratégia, milhares de potenciais ligantes peptídicos são gerados e rastreados in silico, superando assim algumas limitações dos métodos experimentais disponíveis.

Predição computacional de preferências de aminoácidos de domínios de ligação peptídica potencialmente multiespecíficos envolvidos em interações proteína-proteína

Aqui, apresentamos um protocolo para o desenho guiado por estrutura da interação de ligação proteína-ligante entre Sangliferina A e Ciclofilina A/Ganoderiol-F, essencial para a descoberta de novos medicamentos. A estabilidade do complexo ligante-receptor foi avaliada por meio de simulação de dinâmica molecular.

Design e Desenvolvimento Guiados por Estrutura de Novos Inibidores da Ciclofilina A e Derivados do Ganoderiol-F: Uma Abordagem In-Silico

Um protocolo para sintetizar peptóides com funcionalidade catiônica mista na mesma sequência é apresentado (monômeros do tipo lisina e arginina). Testes subsequentes desses compostos contra Leishmania mexicana, os protozoários parasitas causadores da leishmaniose cutânea, também são descritos.

Um método eficiente para a Síntese de Peptóides com Monómeros Mixed tipo de lisina / arginina-tipo e avaliação da sua actividade anti-leishmaniose

Conseguimos estabelecer um método para isolamento de RNA de sementes de plantas contendo grandes quantidades de óleos, proteínas e polifenóis, que têm efeitos inibitórios no isolamento de RNA de alta pureza. Nosso método é adequado para monitorar a expressão de genes com transcritos de baixo nível em sementes.

Um método eficiente para o isolamento de ARN altamente purificada a partir de sementes para Utilização em Análise Quantitativa do transcriptoma

Aprenda a refoldar e purificar o domínio de ligação do quimiorreceptor Tlp3 de corpos de inclusão de Campylobacter jejuni. Este método recupera miligramas de proteína funcional para estudos estruturais e de triagem de ligantes.

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

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