Name: Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Aprenda a refoldar e purificar o domínio de ligação do quimiorreceptor Tlp3 de corpos de inclusão de Campylobacter jejuni. Este método recupera miligramas de proteína funcional para estudos estruturais e de triagem de ligantes.

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Agradecemos seus primeiros trabalhos sobre a produção de Tlp3-LBD-Yu C. Liu. Mayra A. Machuca está em dívida com o Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS para uma bolsa de doutorado.

1. a expressão de seu6-Tlp3-LBD em e. coli
<ol><li>Inocular a 150 mL de caldo de Luria-Bertani (LB) estéril contendo 50 µ g ampicilina de-1 de mL com BL21-códon-Plus (DE3) - células RIPL transformadas com o vetor de pET151/D-TOPO para expressão de seu6- Tlp3-LBD (resíduos de aminoácidos 42-291), e -incube a 37 ° C em um shaker (diâmetro da órbita, 25mm) com 200 rpm durante a noite.</li>
	<li>Prepare-se seis Erlenmeyers de 2L contendo 800 mL de caldo estéril de LB e 50 µ g ampicilina de-1 mL. Inocule cada frasco com 20 mL de cultura durante a noite, Obtida de passo 1.1. -Incube a 37 ° C, com agitação contínua a 200 rpm até a densidade óptica em 600 nm atinge 0,6.</li>
	<li>Tomar um mL 1 alíquota de um dos frascos (amostra de controle uninduced), pelota utilizando uma centrífuga de bancada (13.000 x g, 4 ° C, 10 min) e descartar o sobrenadante. Armazene a pelota bacteriana a-20 ° C para posterior análise de SDS-PAGE.</li>
	<li>Induzi a expressão de proteínas adicionando 1 mM de isopropil-β-D-thiogalactoside (IPTG) para cada balão com cultura. Continue incubando os frascos a 37 ° C em uma coqueteleira a 200 rpm para um adicional 4 h.</li>
	<li>Recolher as células por centrifugação a 5.000 x g, durante 15 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Nota: neste ponto, o procedimento pode ser pausado, colocando o centrifugado em um freezer-80 ° C para armazenamento.</li>
</ol>2. isolamento e desnaturação de corpos de inclusão
<ol><li>Transferir todas as pelotas de célula obtidas na etapa de 1,5 para um copo de 250 mL e adicionar 100 mL de tampão A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl). Permitir que as células descongelar completamente (se congelado) e resuspenda o pellet. Manter a amostra em gelo, salvo indicação em contrário.</li>
	<li>Passe as ressuspensa células através de um homogeneizador de alta pressão três vezes para lisar as células e assegurar a completa distorção do DNA genômico.</li>
	<li>Centrifugue o lisado a 10.000 x g, durante 15 min a 4 ° C. Recolher uma amostra de 1 mL do sobrenadante (fração solúvel) e armazená-lo a-20 ° C para posterior análise de SDS-PAGE. Descartar o resto do líquido sobrenadante e colocar a pelota no gelo. Nota: Esta pelota é na cor branca (facilmente distinguíveis de células contínua, que são as tonalidades de marrom na cor) e contém corpos de inclusão.</li>
	<li>Resuspenda o pellet de corpos de inclusão completamente em 20 mL de tampão gelada B (pH 10 mM Tris-HCl 8.0, fluoreto de phenylmethanesulfonyl de 0,2 mM (PMSF), 1% Triton X-100). Isto facilita a solubilização da membrana e proteínas da membrana. Vórtice para 1-2 min a ressuspensão de auxílio.</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 10.000 x g, durante 15 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 20 mL de tampão gelada B vortexing o tubo para o 1-2 min.. Certifique-se de que a pelota é quebrada em pedaços pequenos. Pipetar o exemplo acima e para baixo para ajudar a ressuspensão de sedimento. Nota: É importante resuspenda o pellet cuidadosamente, para se obter corpos de inclusão livres de impurezas.</li>
	<li>Repita a etapa 2.5. Se o sobrenadante está nublado ou coloridos, repita os passos de 2.6 e 2.5 (nessa ordem) até que o sobrenadante é clara e incolor.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 20 mL de tampão gelada C (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,2 mM PMSF) pela utilização do Vortex o tubo para o 1-2 min.</li>
	<li>Repita a etapa 2.5.</li>
	<li>Adicione 25 mL de tampão de desnaturação gelada D (pH 8.0, ureia de 8 M, 10 mM ditiotreitol (DTT), 0,2 mM PMSF de 10 mM Tris-HCl) para dissolver a pelota de corpos de inclusão. Resuspenda completamente vortexing para 1-2 min, ou até a pelota é quebrada em pedaços pequenos.</li>
	<li>Misture a suspensão por rotação axial com uma taxa de rotação de 30 rpm para 30 a 120 min a 4 ° C.</li>
	<li>Esclarecer a solução da proteína desnaturada por centrifugação a 30.000 x g, 4 ° C por 30 min, coloque o sobrenadante no gelo e descartar a pelota.</li>
	<li>Medir a concentração de proteína usando o ensaio de Bradford. 24 tomar uma alíquota para análise do gel de SDS e colocá-lo a-20 ° C. Nota: neste ponto, o procedimento pode ser pausado por snap-congelamento em nitrogênio líquido a amostra aliquotada e mantê-lo a-80 ° C para armazenamento.</li>
</ol>3. proteína dobrar
<ol><li>Preparar 250 mL de tampão E (3M ureia, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,4 M monocloridrato de L-arginina, 20 milímetros reduzida L-glutationa, 2 L-glutationa oxidada milímetros) em um copo de 500 mL e arrefecer o buffer até 4 ° C.</li>
	<li>Adicionar 60 mg de mistura de proteína desnaturada contendo seu6-Tlp3-LBD obtido na etapa 2.13 a 250 mL de tampão E, agitando o buffer a 500 rpm. Incube a mistura redobramento em 4 ° C, com agitação contínua a 500 rpm por 24-48 h. A concentração de proteína final nesta etapa é 0,2 mg mL-1.</li>
	<li>Preparar 7 L de tampão A um balde de 8-10 L e resfriá-lo até 4 ° C, em preparação para o próximo passo (3.4) que terá lugar em 24-48 h (Veja o fluxograma na Figura 1).</li>
	<li>Mergulhe um pedaço de ~ 50 cm de tubo de diálise de diâmetro inflado de 28 mm, com peso molecular de corte em 12-14 kDa em 200 mL de sal de ácido dissódico 10mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA-at2) e aqueça-o em uma chama de gás até ferver. Lavar a membrana de diálise com 200 mL de DDQ2O.</li>
	<li>Prenda uma extremidade da membrana com um fechamento do tubo de diálise diálise e transferir a 250 mL de dobrar a mistura obtida na etapa 3.2 dentro do tubo de diálise. Feche a extremidade aberta com outra pinça. Verificar a integridade da membrana para garantir que não existem fugas.</li>
	<li>Coloque o tubo de diálise em um balde de diálise com o pre-cooled 7 L do tampão A preparada no passo 3.3. Coloque uma agitação magnética bar, garantindo que ele não vai tocar, agitando o tubo de diálise.</li>
	<li>Dialize a amostra a 4 ° C, com continua agitando a 500 rpm e alterar o buffer de pelo menos quatro vezes durante um período de 12 h. Após a última alteração de reserva, deixe a amostra para Dialize durante a noite. Nota: Durante a diálise, o excesso de ureia (~ 3M) gradualmente é removido da solução proteína desnaturada, que permite que a proteína a redobrar. Precipitação de proteínas pesado pode ser observada no final da diálise.</li>
	<li>Retire o tubo de diálise do balde e transferir seu conteúdo para um copo de 500 mL. Manter a solução de proteína no gelo, salvo indicação em contrário.</li>
	<li>Filtre a solução da proteína através de uma membrana de tamanho de poro de 0.43 µm em um frasco de vidro de 500 mL para remover qualquer proteína precipitada.</li>
</ol>4. purificação de seu6-com a tag proteína usando cromatografia de afinidade do íon do Metal imobilizado
<ol><li>
Cobrar e equilibrar uma coluna de quelantes pré-embalados de 5 mL.
	<ol>
<li>Conectar-se a coluna a uma bomba peristáltica, assegurando que não haja nenhum ar preso na tubulação de conexão.</li>
		<li>Lavar a coluna passando através de 25-50 mL de DDQ2O.</li>
		<li>Cobrar a coluna carregando 3 mL de 0.1 M NiCl2 e então passando através de 25 mL de DDQ2O.</li>
		<li>Equilibrar a coluna com 25 mL de tampão F (amortecedor do carregamento, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, NaCl, imidazol de 20 mM a 500 mM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajuste a amostra de proteína reabertos obtida na etapa 3,9 para a composição do buffer F adicionando 2,5 mL de 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL de 5 M NaCl e 2,5 mL das soluções estoque de 2m imidazol.</li>
	<li>Carrega a amostra para a coluna em uma taxa igual ou inferior a 5 mL/min e descarte o escoamento (as proteínas unbound).</li>
	<li>Lave a coluna com 50-100 mL de buffer F para remover as proteínas não especificamente ligadas e descartar o escoamento.</li>
	<li>Eluir a6-Tlp3-LBD com 25 mL de tampão G (tampão de eluição, 20 mM Tris-HCl, NaCl, imidazol 500 mM a 500 mM) e pool de escoamento frações que contêm a proteína (conforme determinado pelo usando o reagente de Bradford).</li>
	<li>Medir a concentração de proteína na amostra em pool usando o ensaio de Bradford. Pegue uma pequena alíquota para análise de SDS-PAGE e lugar a-20 ° C.</li>
</ol>5. seu6-marca remoção usando TEV Protease (opcional)
<ol><li>Prepare-se e esfriar até 4 ° C, 4L de H de buffer (buffer de clivagem TEV, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM de NaCl, 1% (v/v) glicerol, 2 mM DTT).</li>
	<li>Corte aproximadamente 5-7 cm de tubo de diálise (diâmetro de 2-3 cm) e mergulhe-a em 200 mL de DDQ2O.</li>
	<li>Adicionar seu6-com a tag protease do PEV para a sua6-proteína marca preparado na etapa 4.5 para uma relação molar final 1 TEV: proteína 8.</li>
	<li>Fixe uma extremidade do tubo com um fechamento do tubo de diálise e encha-o com a mistura de protease de proteína/TEV. Feche a outra extremidade e garantir que não existem fugas.</li>
	<li>Lugar a diálise do tubo para o pre-cooled 4 L de tampão H (da etapa 5.1) e incube-a 4 ° C, com contínua mexendo por 2 h. alterar o buffer e continuar a diálise durante a noite para permitir que a reação de clivagem mediada por TEV completar.</li>
	<li>Enquanto isso, prepare-se e legal (4 ° C) 4 L de tampão eu (pH 8.0, 150 mM de NaCl, 1% (v/v) glicerol de 10 mM Tris-HCl) em preparação para o dia seguinte.</li>
	<li>Após a diálise durante a noite, trocar o buffer para buffer que preparei na etapa 5.6 e Dialize para um mais 1-2 h a 4 ° C.</li>
	<li>Retire o tubo do balde a diálise, solte uma das extremidades do tubo e transferir a solução da proteína para um tubo Falcon de 50ml. Filtrar a solução através de um filtro de seringa de tamanho de poro de 0.43 µm e mantê-lo no gelo, salvo indicação em contrário.</li>
	<li>Medir o volume da amostra e ajustar a concentração de Tris, NaCl e imidazol para a composição do buffer F (por exemplo, para 25 mL de solução de proteína no buffer J adicionar 0,25 mL de 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL de 5 M NaCl e 0,25 mL de imidazol 2 M).</li>
	<li>Prepare uma coluna HiTrap quelantes HP de 5 mL, conforme descrito na etapa 4.1.</li>
	<li>Carregar a amostra na coluna (vazão: 5 mL/min) e coletar o escoamento, que contém a formatação Tlp3-LBD (resíduos 42-291). Proteína uncleaved, o clivada seu6-tag e seu6- PEV são retidos pela coluna.</li>
	<li>Lave a coluna com 5 mL de tampão F (tampão de carregamento) para permitir que todas as proteínas não marcas fluir e recolher o eluato.</li>
	<li>Piscina o eluato obtido nas etapas 5.11 e 5.12 e mede a concentração de proteína. Pegue uma pequena alíquota e armazená-lo a-20 ° C para análise de SDS-PAGE.</li>
</ol>6. tamanho-exclusão cromatografia (Gel filtração) de Tlp3-LBD
<ol><li>Preparar 1 L de tampão A (pH 8.0, 150 mM NaCl de 10 mM Tris-HCl) e filtrá-la usando uma membrana de 0.43 µm.</li>
	<li>Equilibrar uma coluna de tamanho-exclusão 26/60 com tampão A um débito de 4 mL/min.</li>
	<li>Concentre a amostra de proteína obtida na etapa 5.13 a um volume de 3-4 mL usando concentrador de centrífuga de 15 mL com um corte de kDa 10 (4 ° C, 4.000 x g).</li>
	<li>Esclarecer a solução da proteína por centrifugação a 13.000 x g, 4 ° C por 30 min remover qualquer proteína precipitada.</li>
	<li>Carrega a amostra para a coluna de filtração de gel de 26/60 pre-equilibrado. Realize a cromatografia em tampão A um débito de 4 mL/min. Monitor o rastreamento de UV. Tlp3-LBD elutes em um volume de retenção de 210-220 mL. As frações de pico da piscina.</li>
	<li>Medir a concentração de proteína. Pegue uma pequena alíquota para análise de SDS-PAGE.</li>
</ol>7. SDS-PAGE de análise das amostras coletadas em vários estágios de purificação de proteínas
<ol><li>Preparar 1 L de buffer de execução de SDS-PAGE (tampão J), contendo 25 mM Tris, 250mm glicina pH 8.3 e 0,1% (p/v) de sódio Dodecil sulfato (SDS).</li>
	<li>Prepare-se 10 mL de 5 x amortecedor do carregamento SDS-PAGE (tampão de K), contendo 0,25 M Tris-HCl pH 6,8, SDS 10% (p/v), 50% (v/v) glicerol, 1 milímetro DTT e 0,05% bromofenol azul.</li>
	<li>Permitir que as alíquotas recolhidas durante as diferentes etapas da purificação (etapas 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) para descongelar.</li>
	<li>Para cada amostra, misturar o volume correspondente a 15 µ g de proteína total com 2 µ l de 5x SDS-PAGE de carregamento do buffer e ajuste o volume para 10 µ l com DDQ2O.</li>
	<li>Aquecer as amostras a 95 ° C por 5-10 min, girá-los a 10.000 x g, durante 30 s e transferência das amostras em um tubo limpo.</li>
	<li>Preparar um gel de SDS-PAGE, usando 15% de poliacrilamida separando o gel (para 30% (p/v) de 5 mL: 2,5 mL bis-acrilamida, 1,2 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8.8, 1,2 mL ddH2O, 50 µ l 10% (p/v) SDS, 50 µ l 20% (p/v) de amônio persulfato (APS), 3 µ l tempted (TEMED) e poliacrilamida 5% gel de empilhamento (para 2 mL: 340 µ l 30% (p/v) bis-acrilamida, 250 µ l 1m pH do Tris 6,8, 1,37 mL ddH2O, 20 µ l 10% (p/v) SDS, 20 µ l 20% (p/v) APS, 2 µ l TEMED).</li>
	<li>Montar o aparelho de eletroforese e preenchê-lo com 1x SDS Página executando o buffer de acordo com a recomendação do fabricante.</li>
	<li>Carrega um marcador de peso molecular de proteínas e as amostras preparadas na etapa de 7,5. Realizar a eletroforese em uma corrente constante de 25 mA.</li>
	<li>Transferir o gel em um recipiente e lave-o com DDQ2O. Adicionar 150 mL de solução contendo isopropanol de 25% (v/v), ácido acético a 10% (v/v) e 0,03% (p/v) R-250 azul brilhante de coloração o azul de Coomassie. Coloque o recipiente sobre uma plataforma horizontal de rotação por 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave o gel com O ddH2e coloque na descoloração solução contendo 5% (v/v) de metanol e 7% (v/v) de ácido acético. Destain enquanto mistura usando uma plataforma de rotação horizontal por 1h.</li>
	<li>O gel de imagem e analisar.</li>
</ol>8. circular Dicroísmo (CD) espectroscopia análise da estrutura secundária da proteína pura reabertos
<ol><li>Transferência de 0,5 - 1 mg de proteína reaberta obtida na etapa 6.6 em um tubo de diálise e coloque-o em um balde de diálise contendo 5 L de tampão L (50mm de sódio fosfato pH 7,4), pré-resfriado a 4 ° C. Dialize a amostra a 4 ° C, com agitação contínua e realizar alterações de reserva de pelo menos 3-4 mais 2-4 h antes de deixar a amostra para Dialize durante a noite.</li>
	<li>Concentre a solução de dialysed de proteína para 0,06 mg mL-1 , usando um concentrador centrífugo de corte 10 kDa.</li>
	<li>Esclarecer a solução por centrifugação a 13.000 x g, 4 ° C por 30 min.</li>
	<li>Grave CD espectro UV distante da amostra a 25 ° C em um intervalo de comprimento de onda de 200-260 nm, utilizando um spectropolarimeter com uma taxa de varredura de 20 nm min-1. Use o buffer de diálise como um controle em branco. Repetir a gravação em triplicado e gerar o espectro em média.</li>
	<li>Calcular o teor de estrutura secundária por deconvoluting o CD usando o programa CDSSTR do DichroWeb de espectros cortar25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).</li>
</ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Um procedimento simples para a expressão e dobrar de corpos de inclusão do LBD periplasmático da chemoreceptor bacteriana Tlp3 é apresentado. Preparação da proteína pura envolve sobre-expressão do gene do animal de estimação-plasmídeo-codificado em e. coli, purificação e solubilização de corpos de inclusão, dobrar de proteína desnaturada e sua purificação por afinidade a consecutivos e etapas da cromatografia de exclusão de tamanho. A desnaturação de ureia-facilitado e diluição/diálise-mediada dobrar são os pass...

Quimiotaxia e a motilidade foram mostrados para desempenhar um papel importante na patogênese de Campylobacter jejuni , promovendo a colonização bacteriana e a invasão do hospedeiro1,2,3. Quimiotaxia permite que as bactérias para avançar para um ambiente ideal para o crescimento, como guiado por sinais químicos. Esse processo envolve o reconhecimento de sugestões químicas intracelulares e ambientais por um conjunto de proteínas denominadas quimiorreceptor ou transdutor, como proteínas (TIPS). A maioria dos quimiorreceptores são proteínas de membrana-incorporado com um extracytoplasmic ligand binding domain (LBD), um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático de sinalização, o último dos quais interage com as proteínas de sinalização citosólica que transmitem o sinal o flagelar motores4,5,6,,7.
Foram identificados onze quimiorreceptor diferentes do genoma de c. jejuni 4,8. Até à data, apenas alguns destes quimiorreceptores têm sido caracterizados e a especificidade de ligante de Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712e Tlp1113 é conhecida. Identificação de ligantes naturais dos restantes quimiorreceptor nesta espécie e numerosos quimiorreceptor em outras bactérias, pode ser facilitada pela produção de dobrada e altamente puro recombinante chemoreceptor LBDs14, 15 , 16. no entanto, as tentativas de heterologously express LBDs periplasmático de quimiorreceptores bacterianas em Escherichia coli muitas vezes resultam em seu direcionamento em corpos de inclusão17,18,19 . No entanto, este fenómeno pode facilitar fácil isolamento e recuperação da proteína na mão. Aqui, um método é apresentado para recuperação de proteína de corpos de inclusão, dobrar e purificação, usando o LBD periplasmático do c. jejuni chemoreceptor Tlp3 como exemplo. Este exemplo foi escolhido porque Tlp3-LBD pertence a família dCACHE20 de sensoriamento domínios que são encontrados abundantemente em dois-componente histidina quinases e quimiorreceptores em procariontes20,21, 22 , 23.
Nesta abordagem, a construção de expressão, com base em um vetor TOPO-pET151/D, foi projetada para incorporar um N-terminal dele6-etiqueta, seguido de um tabaco etch local de clivagem do protease do vírus (TEV), para marca subsequente remoção19. O protocolo descreve a superexpressão da proteína em e. coli, isolamento e solubilização de ureia-mediada de corpos de inclusão e proteína dobrar pela depleção de ureia. Após dobrar, a amostra é purificada por cromatografia de afinidade, com cromatografia de remoção e tamanho-exclusão opcional marca. O estado dobrado da proteína purificada é confirmado usando espectroscopia de Dicroísmo circular. Esta é uma versão modificada do método que foi desenvolvido anteriormente para recuperar e purificar o LBD de um chemoreceptor diferente, Helicobacter pylori TlpC19. Este procedimento, resumido na Figura 1, produz 10 a 20 mg de puro, sem marcas de formatação Tlp3-LBD por 1 L de cultura bacteriana, com uma pureza de proteína de > 90%, como estimado por SDS-PAGE.

<table><tbody><tr><td>Base Tris</td><td>AMRESCO</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>MERK MILLIPORE</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>G-BIOSCIENCES</td><td>A051-B</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF)</td><td>MERCK</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-tiogalactosídeo (IPTG)</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> AST0487 <tr><td>Ureia</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0568</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td>C-1029</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de L-arginina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5131</td><td></td></tr><tr><td>L-glutationa reduzida</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>L-glutationa oxidada</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético desidratado (EDTA)</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC20302.260</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td></td><td></td></tr> BIOGB0232 <tr><td>Cloreto de níquel (NiCl2)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0167</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Escada de proteína não corada, larga Faixa (10-250 kDa)</td><td>NEW ENGLAND BIOLABS</td><td>P7703</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultracel centrífugo concentrador (Millipore)</td><td>MERCK</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo</td><td>Falcon</td><td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálise</td><td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td><td></td> Diálise <td></td></tr><tr><td>Tubo de diálise de pele de cobra</td><td>THERMO SCIENTIFIC&trade;</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Coluna Quelante HP HiTrap Pré-embalada</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>17-0408-01</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C5 homogeneizador de alta pressão</td><td>AVESTIN</td><td>EmulsiFlex&trade; -</td> Bomba Peristáltica C5 <td></td></tr><tr><td>P-1</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>18-1110-91</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HiLoad 26/60 coluna de exclusão de tamanho&nbsp;</td><td>GE HEALTHCARE CIÊNCIAS DA VIDA</td><td></td><td></td></tr> 28989336 <tr><td>JASCO J-815 espectropolarímetro</td><td>JASCO</td><td>J-815</td><td></td></tr></tbody></table>

método para dobrar eficiente e purificação do chemoreceptor ligand binding domain

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identificação de ligantes naturais de quimiorreceptores e estudos estruturais destinados a elucidação da base molecular da especificidade ligante pode ser facilitada pela produção de quantidades de miligrama de domínios de ligação do ligante puro, dobrado. As tentativas de heterologously express domínios de ligação ligante periplasmático de quimiorreceptores bacterianas em Escherichia coli (e. coli) muitas vezes resultam em seu direcionamento em corpos de inclusão. Aqui, um método é apresentado para recuperação de proteína de corpos de inclusão, dobrar e purificação, usando o domínio de ligação do ligante dCACHE periplasmático de Campylobacter jejuni (c. jejuni) chemoreceptor Tlp3 como exemplo. A abordagem envolve a expressão da proteína de interesse com um cleavable seu6-tag, isolamento e solubilização mediada por ureia, de corpos de inclusão, proteína dobrar pela depleção de ureia e purificação através de cromatografia de afinidade, seguido por cromatografia de tamanho-exclusão e remoção de marca. A espectroscopia de Dicroísmo circular é usada para confirmar o estado dobrado da proteína pura. Foi demonstrado que este protocolo é geralmente útil para produção de quantidades de miligrama de domínios de ligação ligante periplasmático dCACHE de outros quimiorreceptor bacteriana na forma solúvel e crystallisable.

Expressão recombinante de seu6-Tlp3-LBD em e. coli resultou na deposição de proteína em corpos de inclusão. O expressão rendimento de 1 L de cultura bacteriana, calculada na etapa 2.13 foi aproximadamente 100 mg de seu6-Tlp3-LBD depositado em corpos de inclusão. O procedimento de isolamento de proteína, aqui descrito e ilustrado na Figura 1, consiste a solubilização de corpos de inclusão, proteína dobrar e purificação, através d...

Um procedimento é apresentado para o dobrar do domínio de ligação do ligante periplasmático dCACHE de Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 de corpos de inclusão e a purificação para produzir quantidades de miligrama de proteína.

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

O objetivo geral deste procedimento é redobrar um domínio de ligação ao ligante quimiorreceptor de corpos de inclusão e purificá-lo para uso em estudos estruturais e funcionais. Para estabelecer quais sinais um quimiorreceptor bacteriano envia e como, pode-se usar os domínios de ligação de ligantes isolados para rastrear bibliotecas de pequenas moléculas ou para determinar a estrutura com e sem ligante. A supressão do domínio de ligação ao ligante extracelular em E.coli geralmente resulta na deposição em corpos de inclusão.Aqui, mostramos como a quantidade de miligramas de proteína funcional pode ser recuperada dos corpos de inclusão. Para começar, inocule 150 mL de caldo LB estéril contendo 50 microgramas por mL de ampicilina com células BL21-CodonPlus RIPL transformadas com o vetor pET151 D-TOPO para expressão de hexa-histidina TIp3-LBD. Incube a cultura a 200 RPM e 37 graus Celsius durante a noite.Prepare seis frascos de Erlenmeyer de 2L contendo 800 mL de caldo LB estéril e 50 microgramas por mL de ampicilina. Inocular cada balão com 20 ml da cultura durante a noite. Incubar os frascos a 37 graus Celsius com agitação contínua a 200 RPM até que o OD600 atinja 0,6.Neste ponto, induzir a expressão proteica adicionando 1 IPTG milimolar a cada frasco. Continue incubando os frascos a 37 graus Celsius em um agitador a 200 RPM por mais quatro horas. Colha as células por centrifugação a 5000 xg e quatro graus Celsius por 15 minutos.Em seguida, descarte o sobrenadante. Transfira todos os pellets de células para um béquer de 250 mL e adicione 100 mL de Buffer A. Se congelado, deixe as células descongelarem completamente e depois ressuspenda o pellet. Manter a amostra no gelo, salvo indicação em contrário.Em seguida, passe as células ressuspensas por um homogeneizador de alta pressão três vezes para lisar as células e garantir o cisalhamento completo do DNA genômico. Em seguida, centrifugue o lisado a 10.000 xg e quatro graus Celsius por 15 minutos. Colete uma amostra de um mL do sobrenadante e armazene-a a menos 20 graus Celsius para análise subsequente do SDS-PAGE.Em seguida, descarte o restante do sobrenadante e coloque o pellet no gelo. Em seguida, ressuspenda completamente o pellet de corpos de inclusão em 20 mL de Buffer B gelado. Isso facilita a solubilização da membrana e das proteínas da membrana. Vortex a amostra por um a dois minutos para ajudar na ressuspensão.Depois de centrifugar a amostra, ressuspenda completamente o pellet novamente em 20 mL de Buffer B gelado, primeiro enviando uma mensagem de texto no tubo por um a dois minutos. Certifique-se de que o pellet esteja quebrado em pequenos pedaços. Em seguida, pipete a amostra para cima e para baixo para ressuspendê-la.Centrifugar a amostra como antes e rejeitar o sobrenadante. Se o sobrenadante estiver turvo ou colorido, centrifugue novamente a amostra e use o tampão B gelado adicional para ressuspendê-la. Repetir a centrifugação e a ressuspensão até que o sobrenadante esteja límpido e incolor antes de voltar a fazer a peletização.Adicione 20 mL de tampão C gelado ao pellet e ressuspenda-o agitando o tubo por um a dois minutos. Em seguida, depois de girar a amostra, adicione 25 mL de tampão desnaturante gelado D. Ressuspenda completamente o pellet dos corpos de inclusão por vorge no tubo por um a dois minutos ou até que o pellet seja quebrado em pequenos pedaços. Misture a suspensão por rotação axial a 30 RPM e 4 graus Celsius por 30 a 120 minutos.Clarificar a solução proteica desnaturada por centrifugação a 30 000 xg e a quatro graus Celsius durante 30 minutos. Em seguida, coloque o sobrenadante no gelo e descarte o pellet. Enquanto agita 250 mL de tampão E a 500 RPM, adicione 60 miligramas de mistura de proteínas desnaturadas contendo hexahistadina TIp3-LBD.Incube a mistura de redobramento a quatro graus Celsius com agitação contínua a 500 RPM por 24 a 48 horas. A concentração final de proteína é de 0,2 mg por mL. Depois de preparar sete L de tampão A pré-resfriado e tubo de diálise de acordo com o protocolo de texto, use o fechamento do tubo de diálise para prender uma extremidade da membrana de diálise e transferir a mistura de diálise para o tubo.Em seguida, prenda a extremidade aberta e certifique-se de que não haja vazamentos. Coloque o tubo de diálise em um balde de diálise com o tampão pré-resfriado A. Em seguida, adicione uma barra de agitação magnética, garantindo que ela não toque no tubo de diálise durante a agitação. Dialisar a amostra a quatro graus Celsius com agitação contínua a 500 RPM e trocar o tampão pelo menos quatro vezes durante um período de 12 horas.Após a última troca de tampão, deixe a amostra para dialisar durante a noite. Na manhã seguinte, retire o tubo de diálise do balde e transfira o seu conteúdo para um copo de 500 ml. Mantenha a solução proteica no gelo, salvo indicação em contrário.Filtre a solução de proteína através de uma membrana do tamanho de um poro de 0,43 mícron em um frasco de vidro de 500 mL para remover qualquer proteína precipitada. Após lavar, carregar e equilibrar uma coluna quelante de acordo com o protocolo de texto, ajuste a amostra de proteína redobrada obtida à composição do Tampão F adicionando 25 mL de cloreto de sódio 5 M, 2,5 mL de tris-HCl 1 M, pH 8,0 e 2,5 mL de soluções estoque de imidazol 2 M. Carregue a amostra na coluna a uma taxa de 5 mL por minuto ou menos e descarte o fluxo que contém as proteínas não ligadas.Em seguida, lave a coluna com 50 a 100 mL de tampão F para remover proteínas não especificamente ligadas e descarte o fluxo. Eluir a hexahistadina TIp3-LBD com 25 mL de tampão G. Em seguida, agrupe as frações de fluxo contendo a proteína. Depois de preparar o tampão H e o tubo de diálise de acordo com o protocolo de texto, adicione a protease TEV marcada com hexahistadina à proteína marcada com hexahistadina no tubo.Adicione uma proporção molar final de um TEV para oito de proteína. Coloque o tubo de diálise clamped nos quatro L pré-resfriados do tampão H e incube-o a quatro graus Celsius com agitação contínua por duas horas. Em seguida, troque o tampão e continue a diálise durante a noite para permitir que a reação de clivagem mediada por TEV seja concluída.Depois de trocar para o tampão I, filtrar a solução de proteína e ajustar a amostra novamente, carregue a amostra em uma coluna HP quelante HiTrap preparada de cinco mL. A uma taxa de fluxo de cinco mL por minuto, colete o fluxo que contém o TIp3-LBD não marcado. Na proteína clivada, a marca hexahistadina clivada e a hexahistadina TEV são retidas pela coluna.Use cinco mL de tampão F para lavar a coluna para permitir que a proteína não marcada flua e colete o eluato. Em seguida, depois de equilibrar uma coluna de exclusão de tamanho e concentrar e clarificar a amostra de proteína de acordo com o protocolo de texto, carregue a amostra na coluna de filtração de gel 26/60 pré-equilibrada. Aplique o tampão A a uma taxa de fluxo de quatro mL por minuto e monitore o traço UV para eluição de proteínas.TIp3-LBD elui a um volume de retenção de 210 a 220 mL. Finalmente, após a cromatografia, agrupar as frações, medir a concentração de proteínas e realizar SDS-PAGE. O procedimento de isolamento de proteínas demonstrado neste vídeo rendeu 10 a 20 mg de TIp3-LBD puro não marcado por um L de cultura bacteriana.Como visto aqui, a proteína eluída da coluna de filtração em gel tem um pico único e simétrico, correspondente a um volume de retenção de 220 mL com um peso molecular calculado de 29 kDa. Conforme mostrado aqui por SDS-PAGE, os corpos de inclusão continham predominantemente hexahistadina TIp3-LBD com um peso molecular aparente de 28 kDa, que é próximo ao valor calculado a partir da sequência de aminoácidos de 31,8 kDa. A remoção da marca hexahistadina, a cromatografia de afinidade e as etapas de filtração em gel produziram proteína altamente pura.A espectroscopia de CD usando CDSSTR revelou que a estrutura secundária da hexa-histidina TIp3-LBD era composta de 31% de alfa-hélice e 23% de conteúdo de folha beta. Estes também estavam próximos dos valores previstos de 37% e 26%, respectivamente, da análise de sequência usando o servidor JPred 3. Este protocolo requer um mínimo de cinco dias do início ao fim e pode ser pausado, se necessário, em três estágios diferentes.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a ressuspensão completa e completa dos corpos de inclusão no tampão de desnaturação por vórtice ou pipetagem para cima e para baixo é fundamental para toda essa realização. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como redobrar e purificar o domínio de ligação do ligante do quimiorreceptor TIp3. A proteína purificada pode ser usada para ligar ácidos para investigar a especificidade do ligante para esse receptor.Além disso, mostramos anteriormente que a proteína obtida por esse procedimento poderia ser usada para produzir cristais altamente ordenados, e isso abriu caminho para os estudos da base estrutural de sua especificidade de ligante. Este procedimento pode ser geralmente útil para a produção de quantidades de mg de quimiorreceptores de outras bactérias em uma forma cristalizável e solúvel. Usamos este protocolo em sua forma original ou ligeiramente modificada para redobrar e purificar o domínio de ligação ao ligante de outros quimiorreceptores desse tipo para estudos cristalográficos.Lembre-se de que, em cada caso separado, provavelmente será necessária a otimização do protocolo, por exemplo, a composição dos buffers de desnaturação e redobramento e os tempos de incubação.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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