Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

O objetivo geral deste procedimento é redobrar um domínio de ligação ao ligante quimiorreceptor de corpos de inclusão e purificá-lo para uso em estudos estruturais e funcionais. Para estabelecer quais sinais um quimiorreceptor bacteriano envia e como, pode-se usar os domínios de ligação de ligantes isolados para rastrear bibliotecas de pequenas moléculas ou para determinar a estrutura com e sem ligante. A supressão do domínio de ligação ao ligante extracelular em E.coli geralmente resulta na deposição em corpos de inclusão.

Aqui, mostramos como a quantidade de miligramas de proteína funcional pode ser recuperada dos corpos de inclusão. Para começar, inocule 150 mL de caldo LB estéril contendo 50 microgramas por mL de ampicilina com células BL21-CodonPlus RIPL transformadas com o vetor pET151 D-TOPO para expressão de hexa-histidina TIp3-LBD. Incube a cultura a 200 RPM e 37 graus Celsius durante a noite.

Prepare seis frascos de Erlenmeyer de 2L contendo 800 mL de caldo LB estéril e 50 microgramas por mL de ampicilina. Inocular cada balão com 20 ml da cultura durante a noite. Incubar os frascos a 37 graus Celsius com agitação contínua a 200 RPM até que o OD600 atinja 0,6.

Neste ponto, induzir a expressão proteica adicionando 1 IPTG milimolar a cada frasco. Continue incubando os frascos a 37 graus Celsius em um agitador a 200 RPM por mais quatro horas. Colha as células por centrifugação a 5000 xg e quatro graus Celsius por 15 minutos.

Em seguida, descarte o sobrenadante. Transfira todos os pellets de células para um béquer de 250 mL e adicione 100 mL de Buffer A. Se congelado, deixe as células descongelarem completamente e depois ressuspenda o pellet. Manter a amostra no gelo, salvo indicação em contrário.

Em seguida, passe as células ressuspensas por um homogeneizador de alta pressão três vezes para lisar as células e garantir o cisalhamento completo do DNA genômico. Em seguida, centrifugue o lisado a 10.000 xg e quatro graus Celsius por 15 minutos. Colete uma amostra de um mL do sobrenadante e armazene-a a menos 20 graus Celsius para análise subsequente do SDS-PAGE.

Em seguida, descarte o restante do sobrenadante e coloque o pellet no gelo. Em seguida, ressuspenda completamente o pellet de corpos de inclusão em 20 mL de Buffer B gelado. Isso facilita a solubilização da membrana e das proteínas da membrana. Vortex a amostra por um a dois minutos para ajudar na ressuspensão.

Depois de centrifugar a amostra, ressuspenda completamente o pellet novamente em 20 mL de Buffer B gelado, primeiro enviando uma mensagem de texto no tubo por um a dois minutos. Certifique-se de que o pellet esteja quebrado em pequenos pedaços. Em seguida, pipete a amostra para cima e para baixo para ressuspendê-la.

Centrifugar a amostra como antes e rejeitar o sobrenadante. Se o sobrenadante estiver turvo ou colorido, centrifugue novamente a amostra e use o tampão B gelado adicional para ressuspendê-la. Repetir a centrifugação e a ressuspensão até que o sobrenadante esteja límpido e incolor antes de voltar a fazer a peletização.

Adicione 20 mL de tampão C gelado ao pellet e ressuspenda-o agitando o tubo por um a dois minutos. Em seguida, depois de girar a amostra, adicione 25 mL de tampão desnaturante gelado D. Ressuspenda completamente o pellet dos corpos de inclusão por vorge no tubo por um a dois minutos ou até que o pellet seja quebrado em pequenos pedaços. Misture a suspensão por rotação axial a 30 RPM e 4 graus Celsius por 30 a 120 minutos.

Clarificar a solução proteica desnaturada por centrifugação a 30 000 xg e a quatro graus Celsius durante 30 minutos. Em seguida, coloque o sobrenadante no gelo e descarte o pellet. Enquanto agita 250 mL de tampão E a 500 RPM, adicione 60 miligramas de mistura de proteínas desnaturadas contendo hexahistadina TIp3-LBD.

Incube a mistura de redobramento a quatro graus Celsius com agitação contínua a 500 RPM por 24 a 48 horas. A concentração final de proteína é de 0,2 mg por mL. Depois de preparar sete L de tampão A pré-resfriado e tubo de diálise de acordo com o protocolo de texto, use o fechamento do tubo de diálise para prender uma extremidade da membrana de diálise e transferir a mistura de diálise para o tubo.

Em seguida, prenda a extremidade aberta e certifique-se de que não haja vazamentos. Coloque o tubo de diálise em um balde de diálise com o tampão pré-resfriado A. Em seguida, adicione uma barra de agitação magnética, garantindo que ela não toque no tubo de diálise durante a agitação. Dialisar a amostra a quatro graus Celsius com agitação contínua a 500 RPM e trocar o tampão pelo menos quatro vezes durante um período de 12 horas.

Após a última troca de tampão, deixe a amostra para dialisar durante a noite. Na manhã seguinte, retire o tubo de diálise do balde e transfira o seu conteúdo para um copo de 500 ml. Mantenha a solução proteica no gelo, salvo indicação em contrário.

Filtre a solução de proteína através de uma membrana do tamanho de um poro de 0,43 mícron em um frasco de vidro de 500 mL para remover qualquer proteína precipitada. Após lavar, carregar e equilibrar uma coluna quelante de acordo com o protocolo de texto, ajuste a amostra de proteína redobrada obtida à composição do Tampão F adicionando 25 mL de cloreto de sódio 5 M, 2,5 mL de tris-HCl 1 M, pH 8,0 e 2,5 mL de soluções estoque de imidazol 2 M. Carregue a amostra na coluna a uma taxa de 5 mL por minuto ou menos e descarte o fluxo que contém as proteínas não ligadas.

Em seguida, lave a coluna com 50 a 100 mL de tampão F para remover proteínas não especificamente ligadas e descarte o fluxo. Eluir a hexahistadina TIp3-LBD com 25 mL de tampão G. Em seguida, agrupe as frações de fluxo contendo a proteína. Depois de preparar o tampão H e o tubo de diálise de acordo com o protocolo de texto, adicione a protease TEV marcada com hexahistadina à proteína marcada com hexahistadina no tubo.

Adicione uma proporção molar final de um TEV para oito de proteína. Coloque o tubo de diálise clamped nos quatro L pré-resfriados do tampão H e incube-o a quatro graus Celsius com agitação contínua por duas horas. Em seguida, troque o tampão e continue a diálise durante a noite para permitir que a reação de clivagem mediada por TEV seja concluída.

Depois de trocar para o tampão I, filtrar a solução de proteína e ajustar a amostra novamente, carregue a amostra em uma coluna HP quelante HiTrap preparada de cinco mL. A uma taxa de fluxo de cinco mL por minuto, colete o fluxo que contém o TIp3-LBD não marcado. Na proteína clivada, a marca hexahistadina clivada e a hexahistadina TEV são retidas pela coluna.

Use cinco mL de tampão F para lavar a coluna para permitir que a proteína não marcada flua e colete o eluato. Em seguida, depois de equilibrar uma coluna de exclusão de tamanho e concentrar e clarificar a amostra de proteína de acordo com o protocolo de texto, carregue a amostra na coluna de filtração de gel 26/60 pré-equilibrada. Aplique o tampão A a uma taxa de fluxo de quatro mL por minuto e monitore o traço UV para eluição de proteínas.

TIp3-LBD elui a um volume de retenção de 210 a 220 mL. Finalmente, após a cromatografia, agrupar as frações, medir a concentração de proteínas e realizar SDS-PAGE. O procedimento de isolamento de proteínas demonstrado neste vídeo rendeu 10 a 20 mg de TIp3-LBD puro não marcado por um L de cultura bacteriana.

Como visto aqui, a proteína eluída da coluna de filtração em gel tem um pico único e simétrico, correspondente a um volume de retenção de 220 mL com um peso molecular calculado de 29 kDa. Conforme mostrado aqui por SDS-PAGE, os corpos de inclusão continham predominantemente hexahistadina TIp3-LBD com um peso molecular aparente de 28 kDa, que é próximo ao valor calculado a partir da sequência de aminoácidos de 31,8 kDa. A remoção da marca hexahistadina, a cromatografia de afinidade e as etapas de filtração em gel produziram proteína altamente pura.

A espectroscopia de CD usando CDSSTR revelou que a estrutura secundária da hexa-histidina TIp3-LBD era composta de 31% de alfa-hélice e 23% de conteúdo de folha beta. Estes também estavam próximos dos valores previstos de 37% e 26%, respectivamente, da análise de sequência usando o servidor JPred 3. Este protocolo requer um mínimo de cinco dias do início ao fim e pode ser pausado, se necessário, em três estágios diferentes.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a ressuspensão completa e completa dos corpos de inclusão no tampão de desnaturação por vórtice ou pipetagem para cima e para baixo é fundamental para toda essa realização. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como redobrar e purificar o domínio de ligação do ligante do quimiorreceptor TIp3. A proteína purificada pode ser usada para ligar ácidos para investigar a especificidade do ligante para esse receptor.

Além disso, mostramos anteriormente que a proteína obtida por esse procedimento poderia ser usada para produzir cristais altamente ordenados, e isso abriu caminho para os estudos da base estrutural de sua especificidade de ligante. Este procedimento pode ser geralmente útil para a produção de quantidades de mg de quimiorreceptores de outras bactérias em uma forma cristalizável e solúvel. Usamos este protocolo em sua forma original ou ligeiramente modificada para redobrar e purificar o domínio de ligação ao ligante de outros quimiorreceptores desse tipo para estudos cristalográficos.

Lembre-se de que, em cada caso separado, provavelmente será necessária a otimização do protocolo, por exemplo, a composição dos buffers de desnaturação e redobramento e os tempos de incubação.