Summary
هذا البروتوكول يركز على التحليل الكمي لتعقيد أربوريزيشن الجذعية العصبية (نداك) في المورفولوجية، التي يمكن استخدامها لإجراء دراسات ل morphogenesis الجذعية.
Abstract
Dendrites الإسقاطات متفرع من خلية ومورفولوجيا الجذعية يعكس المنظمة متشابك أثناء تطوير النظام العصبي. المورفولوجية اليرقات أربوريزيشن الجذعية العصبية (دا) نموذج مثالي لدراسة morphogenesis dendrites العصبية ووظيفة الجينات في تطوير الجهاز العصبي. وهناك أربع فئات من الخلايا العصبية دا. الفئة الرابعة هي الأكثر تعقيداً مع نمط المتفرعة التي تغطي المنطقة بأكملها تقريبا من الجدار الجسم اليرقات. نحن تميزت سابقا أثر إسكات أورثولوج المورفولوجية ل SOX5 على الدرجة الرابعة أربوريزيشن الجذعية العصبية التعقيد (نداك) باستخدام المعلمات الأربعة: طول dendrites، والمساحة السطحية لتغطية تغصن، إجمالي عدد الفروع، وهيكل التفريع. ويقدم هذا البروتوكول سير العمل من نداك التحليل الكمي، تتألف من تشريح اليرقات والفحص المجهري [كنفوكل]، وإجراءات تحليل الصورة باستخدام البرمجيات إيماجيج. سيتم تحسين الفهم لوظيفة الخلايا العصبية مزيد من التبصر في دا العصبية التنمية وآلياتها الأساسية وتقديم أدلة حول الأسباب الأساسية للجهاز العصبي والاضطرابات النمائية.
Introduction
Dendrites، وهي إسقاطات متفرع من خلية، تغطي الحقل الذي يشمل مدخلات العصبية الحسية ومتشابك من1،الخلايا العصبية الأخرى2. تعد مكوناً هاما لتشكيل المشبك dendrites وتلعب دوراً حاسما في إدماج المدخلات متشابك، فضلا عن الترويج لتحفيز الكهروكيميائية في خلية. أربوريزيشن الجذعية (دا) هي عملية التي تشكل الخلايا العصبية الأشجار الجذعية جديدة وفروع لإنشاء نهايات جديدة. التنمية ومورفولوجيا دا، مثل أنماط التجميع، وكثافة فرع نتيجة الخطوة متعددة العمليات البيولوجية وهي ارتباطاً وثيقا بالوظيفة العصبية. والهدف من هذا البروتوكول توفير وسيلة للتحليل الكمي لتعقيد أربوريزاتيون ديندريتريك الخلايا العصبية في المورفولوجية.
تعقد dendrites يحدد أنواع متشابك والاتصال، ومدخلات من الخلايا العصبية شريك. أنماط التفريع وكثافة dendrites تشارك في معالجة الإشارات التي تتلاقى على3،حقل الجذعية4. Dendrites تتمتع بالمرونة للتكيف في مجال التنمية. على سبيل المثال، يشير متشابك له تأثير على المنظمة تغصن في العصبية somatosensory خلال مرحلة النمو و النضج العصبي5. إنشاء اتصال الخلايا العصبية تعتمد على morphogenesis ونضوج dendrites. تشوه dendrites مقترن تلف في وظيفة الخلايا العصبية. وقد أظهرت الدراسات أن شذوذ morphogenesis العصبية دا قد يسهم في مسببات أمراض الأعصاب متعددة، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD)، ومرض باركنسون (PD)، مرض هنتنغتون (HD)، ولو جيهريج المرض/ التصلب العضلي الجانبي (المرض)6،،من78. تظهر التعديلات متشابك في المرحلة المبكرة من الإعلان، بالتضافر مع انخفاض وضعف العصبية الدالة7،8. بيد أن التفاصيل المتعلقة بكيفية إسهام علم الأمراض تغصن المرضية في هذه الأمراض الأعصاب لا يزال بعيد المنال.
وينظم وضع dendrites الجينات ترميز شبكة معقدة من المنظمين، مثل الأسرة Wnt البروتينات9،10، وعوامل النسخ ويغاندس على مستقبلات سطح الخلية11،12 . المورفولوجية دا الخلايا العصبية تتكون من أربعة فصول (الفصل الأول والثاني الثالث، الرابع)، من الفئة التي الرابع دا الخلايا العصبية الأكثر تعقيداً في أنماط التفريع وقد استخدمت كنظام تجريبي قوية لتحسين فهم morphogenesis13، 14. خلال أوائل morphogenesis، overexpression و/أو [رني] إسكات الجينات في الصف الرابع دا الخلايا العصبية تؤدي إلى تغيرات في أنماط التفريع وتغصن التقليم13. من المهم وضع طريقة عملية للتحليل الكمي من أربوريزيشن الجذعية العصبية.
وقد أظهرنا سابقا أن إسكات أورثولوج المورفولوجية من SOX5، Sox102F، أدى إلى أقصر dendrites من الخلايا العصبية دا وتقليل التعقيد في الصف الرابع دا الخلايا العصبية15. نقدم هنا، إجراء تحليل كمي لمدى تعقيد أربوريزيشن الجذعية العصبية (نداك) في المورفولوجية. يوفر هذا البروتوكول، مقتبس من وصف المنهجية السابقة، أسلوب مختصر للاعتداء تنمية الخلايا العصبية الحسية دا. فإنه يوضح صورة قوية العلامات والعصبية دا في الثالثة الطور اليرقات جدار الجسم16،17،،من1819. هو بروتوكول قيماً للباحثين الذين يرغبون في التحقيق في نداك والفوارق التنموية في فيفو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد التجريبية
- إعداد الكواشف التالية: الفوسفات في دولبيكو مخزنة المالحة (PBS)؛ Triton X-100؛ 0.2 ببست % (برنامج تلفزيوني + 0.2% Triton X-100)؛ 32% بارافورمالدهيد (منهاج عمل بيجين) وتخفيفه إلى نسبة 4 في المائة قبل الاستخدام؛ سيليكون الاستومر قاعدة وعامل المعالجة؛ تركيب أنتيفادي المتوسطة (مثلاً، إطالة الذهب)؛ وظفر البولندية.
- إعداد المعدات التالية: مجهر التشريح، اثنان حادة ملقط ومقص ميكروديسيكشن، عدد من المسامير ميكروديسيكشن، طبق بيتري لصنع طبق التشريح وشرائح المجهر وكوفيرسليبس، مجهر [كنفوكل]، الكمبيوتر مع تركيب البرمجيات ImageJ فيجي.
2. جمع اليرقات
- ورفيقه UAS-Sox102F-[رني] الذباب مع UAS-التجارة والنقل أو ppk-GAL4 ث1118 الذباب نوع البرية، على التوالي. ثقافة الذباب في الظروف القياسية عند 25 درجة مئوية.
- في ~ 5-6 أيام، جمع يرقات الطور الثالث من UAS-Sox102F-[رني]/ppk-GAL4، UAS-التجارة والنقل أو UAS-التجارة والنقل، و ppk-GAL4/+ التحكم بعناية مع الملقط للتشريح.
3-تشريح لليرقات
ملاحظة: يتم تشغيل كافة الإجراءات الموجودة في هذا القسم تحت مجهر ميكروديسيكتيون. التكبير ما يصل إلى المحققين. في محاولة لضبط عرض الأفق الأمثل. ويوصي بالتكبير X ~ 4-6.
- ضع يرقة في طبق تشريح مصنوع من سيليكون الاستومر قاعدة وثقافة الأنسجة طبق بيتري.
- دبوس هوك فم اليرقة للسماح للجانب الظهرية مواجهة، ودبوس ثم ذيل اليرقة. ضع الجانب الظهرية في الوسط إلى أقصى حد ممكن لفضح خط الوسط، الذي سيكون علامة الانفتاح.
- إضافة 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لليرقة للحفاظ على رطوبة الجسم.
- جعل قطع مع زوج من المقص على طول خط الوسط الظهرية بين تراتشيس اثنين، من والذيلية إلى روسترال. قم بقطع صغيرة في كل من الزوايا الأربع من جسم اليرقة.
- ضع رقم pin في كل من الزوايا الأربع للجسم حيث يكمن الجسم مسطح.
- إصلاح الجدار هيئة يرقة في 4% منهاج العمل لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل في ببست لمدة 5 دقيقة كرر مرتين أكثر.
- قم بإزالة المسامير من الأنسجة. ثم نقل الأنسجة إلى شريحة زجاج، وتغطي مع تصاعد أنتيفادي المتوسطة، وجبل كشف الغطاء. الهواء الجاف ح 1 وختم الحواف مع البولندية ظفر.
4-تجهيز التصوير
ملاحظة: تم أخذ صور باستخدام نظام مجهر مقلوب [كنفوكل]. ويمكن تصوير المستخدم العينة باستخدام هدفا X 20 (مستحسن).
- التقاط الصور سلسلة Z. فتح مربع الحوار "التقاط سلسلة Z" في برنامج مجهر [كنفوكل]. تحديد نطاق لالتقاط الصور سلسلة Z.
- انقر فوق الزر "أعلى وأسفل". تحديد أعلى وأسفل بوضع وإدخال القيم إلى "أسفل:" و "أعلى:" مربعات. تعيين "خطوة" في مربع الحوار "التقاط سلسلة Z" ك 0.5 ميكرومتر. ثم انقر فوق الزر "تشغيل الآن" للحصول على صور سلسلة Z.
- حفظ الصور التي تم الحصول عليها كملفات *.tiff أو *.nd2.
- تخزين الشرائح في الظلام حامل في 4 درجات مئوية بعد التصوير.
5-تغصن التقييم
ملاحظة: كان البروتين بروتينات فلورية خضراء overexpressed co في UAS-التجارة والنقل والذباب ppk-GAL4 في الخلايا العصبية دا للأسفار بروتينات فلورية خضراء التصوير التحليل. تم قياس كمية طولها والمتفرعة، وهيكل الخلايا العصبية دا في يرقات الطور الثالث. وتشمل تحليل معلمات طول dendrites (ميكرومتر)، المساحة السطحية (ميكرومتر2)، ومجموع عدد الفروع، وهيكل التفريع (%). ويبين الشكل 1 المعلمات التحليل بالتفصيل.
-
طول Dendrites
ملاحظة: طول dendrites هو مجموع كافة dendrites المسمى الراسم في البرنامج المساعد.- إعداد وتشغيل البرمجيات20 "فيجي إيماجيج" (https://fiji.sc/). ثم تقسيم الصور إلى قنوات منفصلة، إذا كانت هناك عدة قنوات للصور.
ملاحظة: الصورة في هذا البروتوكول إلا على قناة واحدة للتجارة والنقل. - تشغيل "الصورة | مكدسات | المشروع Z "للحصول على إسقاط Z؛ سوف تظهر نافذة جديدة باسم 'Z-الإسقاط.' انقر فوق "كثافة كحد أقصى" لنوع الإسقاط، وتنظيم أرقام بين شريحة بدء وإيقاف الشريحة اعتماداً على التفضيلات الفردية. انقر فوق "موافق". سوف تظهر صورة Z-إسقاط تقديم إسقاطات تغصن الواضح.
- تتبع في نيوريتيس.
- حدد "الإضافات | تجزئة | بسيطة الراسم نيوريتيس "في الإطار تتبع في dendrites. تجد سوما العصبية، ومن ثم انقر فوق نقطة واحدة في تغصن بدءاً من جسم الخلية، وهناك نقطة أخرى في التلميح لهذا تغصن.
ملاحظة: البرنامج سيتم توصيل النقطتين مع خط أزرق. - اضغط على "Y" في إطار المكون الإضافي إذا كان المسار واضح؛ يتم تتبع المسار تغصن حتى النهاية للمسار المحدد في الصور المرئية. انقر فوق "المسار الكامل" في إطار البرنامج المساعد نفسه؛ يتم إكمال الجزء (الشكل 2).
ملاحظة: بعض dendrites انتهت بعيداً عن نقاط الانطلاق، التي قسمت الطريق إلى أجزاء أصغر. كانت مجتمعة في الجزء المتعلق بتوفير مسار كامل للتتبع.
- حدد "الإضافات | تجزئة | بسيطة الراسم نيوريتيس "في الإطار تتبع في dendrites. تجد سوما العصبية، ومن ثم انقر فوق نقطة واحدة في تغصن بدءاً من جسم الخلية، وهناك نقطة أخرى في التلميح لهذا تغصن.
- بعد اكتمال مسار، العودة إلى نقطة جديدة فيها الفروع. المسار الجديد يمكن أن يبني على؛ سوف تظهر مربع نافذة "كافة المسارات" قيم طول جميع المسارات (الشكل 3). حفظ ملف تتبع، ومتابعة آثار لم تنته كما هو مبين في الشكل 2.
- تصدير بيانات الطول تغصن بالنقر فوق، "ملف | تصدير *.cvs "في نافذة' المساعد '. ثم نلخص جميع أطوال المسار، وتصدير البيانات إلى برنامج تحليل/جدول بيانات. (الشكل 3).
- إعداد وتشغيل البرمجيات20 "فيجي إيماجيج" (https://fiji.sc/). ثم تقسيم الصور إلى قنوات منفصلة، إذا كانت هناك عدة قنوات للصور.
-
المساحة السطحية للخلايا العصبية دا
- حدد أداة الرسم اليدوي الحر في إطار '"فيجي إيماجيج"'. تتبع المسار، ثم قم بتوصيل نقاط النهاية. من القائمة 'تحليل'، حدد "تعيين قياسات | المنطقة. " انقر فوق "قياس" من القائمة 'تحليل'. تظهر النتيجة في مربع جديد مع القيمة لمنطقة محددة (الشكل 4). قم بنسخة إلى برنامج تحليل البيانات.
-
إجمالي عدد الفروع وهيكل المتفرع من الخلايا العصبية دا
- حساب إجمالي عدد الفروع بفتح "التحليل"، ثم "تجعل | تحليل مسارات سكيليتونيزيد "في إطار البرنامج المساعد للبحث عن المفقودين (الشكل 5).
ملاحظة: بنية أربور هي مجموع مستويات فروع. تم تعريف المسار بين خلايا الجسم ونصائح تغصن، ويمكن أن يتضمن المسار واحد فروع متعددة، مثل العرش الأولية هي dendrites من جسم الخلية العصبية. العرش الثانوي فروع من المرحلة الابتدائية مع العرش رباعي، وكويناري في التعليم العالي، وهلم جرا. يتم فصل هيكل تغصن التفريع تبعاً لمستويات فروع. على سبيل المثال، % الأساسي هو عدد الفروع مقسمة حسب العدد الإجمالي التفريع، وهلم جرا.
- حساب إجمالي عدد الفروع بفتح "التحليل"، ثم "تجعل | تحليل مسارات سكيليتونيزيد "في إطار البرنامج المساعد للبحث عن المفقودين (الشكل 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كانت تعتبرها dendrites من الخلايا العصبية دا بروتينات فلورية خضراء co overexpressing (UAS-التجارة والنقل؛ ppk-GAL4) في سوما دا العصبية والعرش الجذعية للأسفار بروتينات فلورية خضراء التصوير التحليل. وكان تصويرها مورفولوجية dendrites العصبية دا قبل مجهر مقلوب [كنفوكل] (الشكل 2).
تعود dendrites من الخلايا العصبية دا استخدام البرمجيات ImageJ فيجي. استخدم الملف لتقدير طول تغصن (الشكل 3). تكميم أفواه Sox102F في الخلايا العصبية دا (ن = 21) (UAS-Sox102F-[رني]/ppk-GAL4؛ أواسجفب) أدى إلى انخفاض كبير في عدد dendrites وطول فرع أقصر مع هيكل أبسط مقارنة بعناصر التحكم (N = 20) (UAS-التجارة والنقل؛ و ppk-GAL4/+) في اليرقة الطور الثالث (الشكل 6). على وجه التحديد، الذباب الذي تم إسكات Sox102F أظهرت انخفاضا في تغصن متوسط الطول إلى 127 ميكرومتر µm 249 في عناصر التحكم بالمقارنة مع (p = 0.02)، وكان أصغر من متوسط أربور مساحة 552,476 مكم2 بالمقارنة مع مكم 847,5712 في عناصر التحكم (p = 0.04). وباﻹضافة إلى ذلك، تكميم أفواه Sox102F أدت إلى عدد أقل من الفروع وبنية تفريع أبسط للعرش مع فروع المجموع 17 (± 17.3 6.7)، مقارنة مع 28 (28.4 ± 9.5) في عناصر التحكم (p = 0.04). طالب t-اختبارات أجريت لمقارنة الاختلافات بين المجموعات، وتم تعيين مستوى الأهمية إلى 0.05.
الشكل 1 : الخطط تغصن تحليل معلمات من العصبية دا المورفولوجية . لوحة (أ) هو الصورة الأصلية من خلية دا. (ب) طول تغصن كان متوسط أطوال تغصن جميع في جميع الخلايا العصبية دا المقاسة. (ج) عرف مساحة دا العصبية تغصن يدوياً بواسطة الأداة مرفوعة إيماجيج. (د) هذا التخطيطي يوضح كيفية حساب العدد الإجمالي لفروع وتحليل بنية المتفرعة من خلية دا. 1: أربور الأولية. 2: أربور الثانوية. 3: أربور التعليم العالي. 4: أربور رباعي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : التتبع تمثيلية من dendrites من خلية دا- وكان المصور خلية دا مع نظام مجهر الأسفار [كنفوكل]. (أ) تم إنشاؤه تعقب الأولى مع نقطة بداية من جسم الخلية ونقطة نهاية تغصن باستخدام أداة البرنامج المساعد/تجزئة. ويمثل الخط الأزرق (السهم الأبيض) المسار المحدد. بعد النقر فوق "نعم" (السهم الأحمر)، يتغير الخط اللون من الأزرق إلى الأحمر. (ب) النقر فوق "إنهاء مسار" أنها ستظهر الأرجواني (ج). (أ-ج) يظهر عملية اقتفاء الأثر تغصن واحد؛ (د) تتبع كامل الصورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : قياس مسارات تتبع. الصورة على اليسار يوضح كيفية قياس مسارات تتبع بعد تشغيل "تحليل | قياس مسارات ". تصدير قيم طول المسار إلى ملف جدول بيانات، وحساب مجموع الطول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : مثال لتحديد مساحة السطح تغصن يدوياً. تم الحصول على صورة محددة باستخدام أداة يدوية في القائمة إطار إيماجيج (كما هو موضح بالسهم الأحمر). تعيين القياسات عن طريق تحديد المنطقة. تشغيل الدالة "التدبير" للحصول على مجال هو موضح في المربع الأحمر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : مثال لتحليل المنطق التفريعي. تشغيل "Analysis_Render | تحليل مسارات سكيليتونيزيد "في إطار البرنامج المساعد" تجزئة ". المسارات المقدمة والعدد من الحصول عليها عن طريق تحديد "تقديم كافة مسارات | الحصول على ملخص ". تم تعريف المسار بين خلايا الجسم ونصائح تغصن، ويمكن أن يتضمن المسار أحد فروع متعددة؛ على سبيل المثال، كانت العرش الابتدائي dendrites من جسم الخلية العصبية؛ العرش الثانوية كانت فروع من المرحلة الابتدائية مع العرش رباعي، وكويناري في التعليم العالي، وهلم جرا. تم فصل هيكل تغصن التفريع تبعاً لمستويات فروع. على سبيل المثال، % الابتدائية كان عدد الفروع مقسمة حسب العدد الإجمالي التفريع، وهلم جرا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : نتائج تمثيلية لإسكات Sox102F في الخلايا العصبية دا- تكميم أفواه Sox102F في الخلايا العصبية دا (UAS-Sox102F-[رني]/UAS-التجارة والنقل؛ ppk GAL4) أدى إلى حد كبير تخفيض طول تغصن وأقصر المتفرعة مع هيكل أبسط في اليرقة الطور الثالث بالمقارنة مع عناصر التحكم. الاختلافات بين Sox102F--[رني] الذباب (UAS-Sox102F-[رني]/UAS-التجارة والنقل؛ و ppk-GAL4، ن = 21) والتحكم (UAS-التجارة والنقل؛ ppk-GAL4/+، N = 20) كان الذباب على (أ) تغصن طول (ب) أربور المساحة السطحية (ج) إجمالي عدد الفروع، و (د، ه ) هيكل المتفرعة من الخلايا العصبية دا. وكان الطالب الاختبار T perfomed للتحليل الإحصائي. * يشير إلى دلالة إحصائية (p < 0.05). أشرطة الخطأ هي ± متوسط الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dendrites التي يعصب البشرة مناطق الإدخال من الخلايا العصبية، ومورفولوجيس على تحديد كيفية تلقي المعلومات ومعالجتها بواسطة الخلايا العصبية الفردية. ويعكس التنمية تغصن مورفولوجيا التحوير الجيني للمنظمة تغصن. العصبية دا اليرقات المورفولوجية للجهاز العصبي المحيطي نموذجا هاما لدراسة التنمية تغصن سبب: 1) التشابه الوظيفي مع الثدييات11،12؛ 2) الطبقة أربعة أوجه التمييز استناداً إلى هيكل تغصن11،12؛ و 3) العوامل الوراثية التي تنظم morphogenesis. في هذا البروتوكول، نقدم سير العمل من إعداد يرقات لتحليل الصورة المورفولوجية دا الخلايا العصبية. تصف الأساليب المعلمات الأربعة الهامة لتحليل dendrites في الخلايا العصبية دا بالتفصيل، وهي طول dendrites، المساحة السطحية، والعدد الإجمالي لفروع، وهيكل التفريع. وكان خطوة حاسمة لإزالة العديد من الأنسجة من الجدار هيئة يرقة ممكن لفضح تماما الخلايا العصبية دا للتصوير والتحاليل. قد يكون هناك بعض فروع قصيرة قطع بسبب العدد المحدود من الصور Z-الإسقاط. كما أن هذا الأسلوب هو القياس النسبي لطول dendrites بالمقارنة مع عناصر التحكم، ينبغي عدد كبير من الصور لكل مجموعة من الخلايا العصبية دا لزيادة مجالات التغطية الصور Z-الإسقاط.
وكانت المورفولوجية الفئة الرابعة الخلايا العصبية دا تركيز البحوث المتعلقة تغصن أربور مورفولوجيا15،21،،من2223. قد تعطل morphogenesis التنمية أربور الجذعية بالخسارة أو للحصول على وظيفة الجينات، مما يدل على أن التنمية العصبية دا حساس للتغيرات الوراثية24. الدراسات الجينية، من المهم تحليل مورفولوجيا بدقة من أجل فهم تأثيرها على الخلايا العصبية دا. الفئة الرابع دا الخلايا العصبية معقدة ولكنها لا تزال متاحة للتصوير عالي الجودة لأنها تقع تحت جدار الجسم شبه شفافة وفرع، كلها تقريبا في الفضاء الأبعاد اثنين فقط. الأسفار التجارة والنقل الحيوي يسمى دا الخلايا العصبية (ppk-GAL4؛ أواسجفب) توفر سهولة تصور نموذج للتحقيق في تنمية الخلايا العصبية. يختلف اتجاه التغيير مورفولوجيا، يمكن أن تصبح أوفيربرانتشيد العرش أو المبسطة. هنا، يمكننا تصنيف هذه الخصائص المورفولوجية يتغير بمعلمات البلازمي، مثل طول تغصن والمساحة السطحية، والعدد الإجمالي لفروع وهيكل الخلايا العصبية دا المتفرعة. النتائج تعكس الاستجابة في التعبير Sox102F تنظيم التنمية العصبية، كما هو مبين في هذه الدراسة.
لدينا البروتوكول المستخدم لإظهار التغيرات المورفولوجية للصف الرابع دا الخلايا العصبية في الذباب في التي أورثولوج المورفولوجية من SOX5، Sox102F، كان يتم إسكاته، مشيراً إلى دور وظيفي هام من SOX5 في التنمية تغصن و morphogenesis. البروتينات Wnt هي عائلة من glycoproteins يفرزها التي تورطت في تنظيم مورفوجينيس تغصن. تعزيز Wnt2 و Wnt7b دا وتعقيد العصبية9،10. في مسار الكنسي Wnt، تبعتها هذا التنشيط تنشيط GSK3β، كيناز سيرين-ثريونين، الذي بدوره يقوم بتنشيط بيتا-كاتينين وساطة النسخ10،25. وقد وجدنا سابقا أن إسكات SOX5 في ش-SY5Y نيوروبلاستوما الخلايا البشرية أدى قمع كبير Wnt مما يشير إلى النشاط وتنظم التعبير عن عدد من الجينات Wnt بما في ذلك overexpression GSK3β 15. لقد ارتبطت زيادة التعبير عن GSK3β مع خصائص السمة المميزة للإعلان، بما في ذلك فقدان الذاكرة، وأصاب بيتا-اميلويد، والشاذ هايبرفوسفوريليشن تاو26. تكميم أفواه SOX5 زيادة GSK3β التعبير، مما قد يشير إلى علاقة وظيفية بين SOX5 وبيتا GSK3.
وقد الخلايا العصبية دا "الرابع فئة" dendrites معقدة للغاية معظم جميع الخلايا العصبية الحسية. في هذا البروتوكول، قمنا بتطوير طريقة لتحليل مدى تعقيد أربور وفروع مجردة خصائص الفئة الرابعة دا الخلايا العصبية في المورفولوجية استناداً إلى البرامج والإضافات المتاحة تقليديا. تم تحليل الصور التي تم التقاطها من مجهر [كنفوكل]، وتجزئة البرنامج المساعد الراسم نورت بسيطة أداة مثالية لتتبع تغصن فروع27،28. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب الكمي لتحليل مفصل لتعقيد تغصن بتقديم نسب مختلف مستويات المتفرع من سوما إلى تغصن أكثر بعدا. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحليل فئات أخرى من الخلايا العصبية دا. على سبيل المثال، الفئة الأولى الخلايا العصبية دا تمديد dendrites الثانوية إلى جانب واحد من الجدار الجسم؛ الدرجة الثانية لها فروع بيفوركاتينج شكل متناظر؛ والفئة الثالثة دا الخلايا العصبية قد تعقد أكثر من التشعب والمسامير. وباختصار، قدمنا بروتوكولا لتصوير وتحليل للصف الرابع دا الخلايا العصبية لتحليلات تغصن الخلايا العصبية في المورفولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نود أن أشكر إيمير ألف وليام للتصوير من المساعدة التقنية. هذا العمل كان يدعمها الصندوق "علاج مرض الزهايمر" [أن R.E.T]، "المعهد الوطني للصحة" [R01AG014713 و R01MH60009 إلى R.E.T؛ R03AR063271 و R15EB019704 إلى أ. ل.]، ومؤسسة العلوم الوطنية [NSF1455613 إلى أ. ل.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
References
- Wassle, H., Boycott, B. B.
- MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
- Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons. Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
- Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases. BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).
- Baloyannis, S. J.
- Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease. Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development. Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
- Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Sears, J. C., Broihier, H. T. FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons. Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).
- Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment. Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).
- Misra, M., et al. A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis. G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).
- Emoto, K., et al. Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell. 119 (2), 245-256 (2004).
- Olesnicky, E. C., et al. Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis. G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).
- Copf, T. Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development. Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).
- Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 103 (2013).
- Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3. J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
