Summary
该方案的重点是定量分析嗜德维拉中的神经元树突状树突状树突状树突状的复杂性 (ndac), 可用于树突状形态发生的研究。
Abstract
树突是神经元的分枝投射, 树突形态反映了神经系统发育过程中的突触组织。嗜酸菌幼虫神经元树突树化 (da) 是研究神经系统发育过程中神经树突形态发生和基因功能的理想模型。有四类大神经元。第四类是最复杂的, 有分支图案, 几乎覆盖幼虫体壁的整个区域。我们以前用四个参数描述了sox5的嗜酸性粒正无量表对 iv 类神经元树突树树状树突状树突状树突状复杂性 (ndac) 的影响: 树突长度、树突覆盖的表面积、分支的总数, 和分支结构。该协议介绍了 ndac 定量分析的工作流程, 包括幼虫解剖、共聚焦显微镜和利用 imagej 软件进行图像分析的过程。进一步洞察 da 神经元的发育及其潜在机制将提高对神经元功能的理解, 并提供有关神经和神经发育障碍的根本原因的线索。
Introduction
树突是神经元的分枝突起, 它覆盖的领域包括神经元从其他神经元1,2的感觉和突触输入。树突是突触形成的重要组成部分, 在整合突触输入以及在神经元中传播电化学刺激方面发挥着至关重要的作用。树突状树状树状树状化 (da) 是一个过程, 神经元通过这个过程形成新的树突树和分支, 形成新的突触。da 的发育和形态, 如分支密度和分组模式, 是多步骤生物过程的结果, 与神经元功能高度相关。该方案的目的是为五味子中神经元树突菌的复杂性的定量分析提供一种方法。
树突的复杂性决定了伙伴神经元的突触类型、连通性和输入。分枝模式和树突密度参与处理收敛到树突场 3,4的信号。树突在发展中具有调整的灵活性。例如, 突触信号对发育阶段和成熟神经系统的体感神经元的树突组织有影响.神经元连接的建立依赖于树突的形态发生和成熟。树突畸形与神经元功能受损有关。研究表明, da 神经元形态发生的异常可能会导致多种神经退行性疾病的病因, 包括阿尔茨海默氏症 (ad)、帕金森病 (pd)、亨廷顿病 (hd) 和卢格里格病/肌萎缩侧索硬化症 (als)6,7,8。突触改变出现在 ad 的早期阶段, 与神经元功能7,8的下降和损伤。然而, 枝晶病理学如何促进这些神经退行性疾病的发病机制的具体细节仍然是难以捉摸的。
树突的发育受编码复杂的调节剂网络的基因的调控, 例如 wnt系列的蛋白质 9、10、转录因子和细胞表面受体上的配体11,12.五丁子由四类组成 (i 类、ii 类、iv 类), 其中 iv 类神经元具有最复杂的分支模式, 并已被用作一个强大的实验系统, 以更好地理解形态发生 13, 14岁在早期形态发生过程中, iv 型神经元中基因的过度表达和 rnai 沉默导致分枝模式的改变和13节枝的修剪.开发一种实用的神经元树突状树状树状树状树状树状树状树状树状化定量分析方法具有重要意义。
我们以前已经证明, 沉默的 sox5, sox102f的嗜酸性粒细胞正畸, 导致短树突的 da 神经元和降低复杂性的 iv-da 15 类神经元。在这里, 我们提出了定量分析的程序, 神经树突树树突状树突状的复杂性 (ndac) 在五味子。该协议, 根据前面描述的方法, 提供了一个简短的方法来分析发展的大感觉神经元。它说明了在第三幼虫体壁 16、17、18、19 中的鲁棒图像标记和 da 神经元。这是一个有价值的协议, 研究 ndac 和发展差异的研究人员希望在体内。
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Protocol
1. 实验准备
- 制备以下试剂: dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (pbs);triton x-100;0.2% pbst (pbs + 0.2% triton x-100);32% 的甲醛 (pfa), 稀释成 4%, 使用前;有机硅弹性体基座及固化剂;防褪色安装介质 (例如, prolong gold);和指甲油。
- 准备以下设备: 解剖显微镜、两个锋利的钳子和一把用于显微解剖的剪刀、一些用于显微解剖的针脚、制作解剖盘的培养皿、显微镜幻灯片和覆盖物、共聚焦仪和计算机与斐济 imagej 软件安装。
2. 幼虫采集
- 配合 uas-sox102f-rnai 分别与 uas-gfp、ppk-gal4 或 w1118野生苍蝇飞行。养殖在25°c 的标准条件下飞行。
- 在 ~ 5-6天内, 收集 uas-sox102f-rnai/ppk-gal4、uas-gfp 或 uas-gfp 的第三幼虫, 并小心地使用钳子进行解剖。
3. 幼虫的解剖
注: 本节中的所有程序均在显微解剖显微镜下操作。放大倍率由调查人员决定。尝试调整到最佳的视觉视图。~ 4-6x 放大倍率的建议。
- 将幼虫放在由有机硅弹性体基座和组织培养培养皿制成的解剖盘上。
- 将幼虫口钩固定在一起, 让背侧朝上, 然后将幼虫的尾巴钉住。将背侧尽可能地放在中间, 以暴露中线, 这将是打开的标记。
- 在幼虫中加入200μl 的 pbs, 以保持身体水分。
- 用剪刀剪断两个气管之间的背线, 从尾端到左旋。在幼虫身体的四个角落中的每一个角落做一个小的切割。
- 在身体的四个角落都放一个别针, 这样身体就平了。
- 在室温下, 将幼虫体壁固定在 4% pfa 中25分钟。
- 在 pbst 中清洗 5分钟, 再重复两次。
- 从组织中取出针脚。然后将组织转移到玻璃滑块上, 用防褪色安装介质覆盖, 然后用盖板安装。空气干燥 1小时, 用指甲油密封边缘。
4. 图像处理
注: 图像是使用倒置共聚焦显微镜系统拍摄的。用户可以使用20x 目标 (推荐) 对样品进行拍照。
- 捕获 z 系列图像。打开共聚焦显微镜软件中的 "捕获 z 系列" 对话框。确定捕获 z 系列图像的范围。
- 点击 "顶部和底部" 按钮。确定顶部和底部位置, 并将值输入到 "底部:" 和 "顶部:" 框。将 "捕获 z 系列" 对话框中的 "步骤" 设置为0.5μm。然后点击 "立即运行" 按钮获取 z 系列图像。
- 将获得的图像另存为 *. tiff 或 *. nd2 文件。
- 成像后, 将幻灯片存放在4°c 的深色支架中。
5. 枝晶评价
注: gfp 蛋白在 uas-gfp 和 ppk-gal4 苍蝇中共同过度表达, 用于 gfp 荧光成像分析。对第三龄幼虫的大神经元的长度、分枝和结构进行了量化。分析参数包括树突长度 (μm)、表面积 (μm 2)、分支总数和分枝结构 (%)。图 1详细显示了分析参数。
-
树突的长度
注: 树突的长度是在示踪剂插件中标记的所有树突的总和。- 安装并运行斐济 imagej (https://fiji.sc/)20软件。然后将图像拆分为不同的通道, 如果有多个图像通道。
注: 此协议中的图像只有一个 gfp 通道。 - 运行 "图像"堆栈z 项目 "以获得 z 投影;将出现一个名为 "z 投影" 的新窗口。单击投影类型的 "最大强度", 并根据个人喜好在起始切片和停止切片之间组织数字。点击 "确定"。z 投影图像将清晰地呈现枝晶投影。
- 追踪神经元
- 选择 "插件"分段简单的神经追踪 "在窗口中跟踪树突。找到神经元 soma, 然后单击从细胞体开始的树突上的一个点, 在这个树突顶端的另一个点。
注: 程序将用蓝线连接这两个点。 - 如果路径清晰, 请在插件窗口中按 "y"; 如果路径清晰, 请按插件窗口中的 "y"。对枝晶路径进行跟踪, 直到可见图像中选定路径的终结点。点击同一插件窗口上的 "完整路径";段完成 (图 2)。
注: 一些树突结束更远的起点, 其中路径被划分为较小的段。将这些段组合在一起, 为跟踪器提供完整的路径。
- 选择 "插件"分段简单的神经追踪 "在窗口中跟踪树突。找到神经元 soma, 然后单击从细胞体开始的树突上的一个点, 在这个树突顶端的另一个点。
- 路径完成后, 返回到分支所在的新点。新的道路可以建立在上面;"所有路径" 窗口框将显示所有路径的长度值 (图 3)。保存跟踪文件, 并继续未完成的跟踪, 如图 2所示。
- 通过单击 "文件" 导出枝晶长度数据在 "插件" 窗口中导出为 *. cvs "。然后总结所有路径长度, 并将数据导出到数据分析电子表格软件。(图 3)。
- 安装并运行斐济 imagej (https://fiji.sc/)20软件。然后将图像拆分为不同的通道, 如果有多个图像通道。
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达努隆的表面积
- 在 "斐济影像" 窗口中选择 "手绘绘图" 工具。跟踪路径, 然后连接终结点。从 "分析" 菜单中选择 "设置测量值"面积。点击 "分析" 菜单中的 "测量"。结果将显示在一个新框中, 其中选择了该区域的值 (图 4)。将其复制到数据分析软件。
-
da 神经元的分支和分支结构的总数
- 通过打开 "分析", 然后 "渲染" 来计算分支的总数在跟踪的插件窗口中分析骨架化路径 "(图 5)。
注: 乔木的结构是分支级别的总和。路径是在细胞体和树突尖端之间定义的, 一个路径可以包括多个分支, 例如主要的乔木是神经元细胞体的树突。次生乔木是来自初级的分支, 等等, 与三级, 第四纪, 和二元乔木。树突分枝的结构根据枝条的水平而分离。例如, 主要% 是分支的数量除以分支的总数, 依此类推。
- 通过打开 "分析", 然后 "渲染" 来计算分支的总数在跟踪的插件窗口中分析骨架化路径 "(图 5)。
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Representative Results
在 gfp 荧光成像分析中, 用共过度表达的 gfp (uas-gfp; ppk-gal4) 标记了 da 神经元的树突, 用于 gfp 荧光成像分析。用倒置共聚焦显微镜对达神经元树突的形态进行了成像 (图 2)。
利用斐济 imagej 软件追踪了 da 神经元的树突。该文件用于估计枝晶长度 (图 3)。sox102f在 da 神经元 (nuct21) (uas-sox102f-rnaice/gal4) 中的沉默uas-gfp) 导致树突的数量显著减少, 分支长度较短, 与第三幼虫的对照 (n = 20) (uas-gfp; ppk-gal4/+) 相比, 结构更简单 (图 6)。具体而言, sox102f沉默的苍蝇的平均树突长度从对照中的249微米 (p = 0.02) 相比, 平均枝晶长度减少到127微米, 平均乔木面积较小, 为 552, 477μm, 而在 控制 (p = 0.04)。此外, sox102f 的沉默导致分支数量减少, 乔木分支结构更简单, 总分支为 17 (17.3±6.7), 而对照中为 28个 (28.4±9.5) (p = 0.04)。对学生进行了 t 检验, 比较了两组之间的差异, 显著性水平设置为0.05。
图 1:红子树突分析参数的原理图.面板(a)是一个大神经元的原始图像。(b)在所有测量的 da 神经元中, 枝晶长度是所有枝晶长度的平均值。(c)由 imagej 徒手工具手动定义了 da 神经节枝晶的表面积。(d)本示意图显示了如何计算分支的总数和分析 da 神经元的分支结构。1: 主乔木。2: 辅助乔木。3: 第三系乔木。4: 第四纪乔木。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 有代表性的追踪一个大神经元的树突。用共聚焦荧光显微镜系统对一个神经元进行了成像。(a)第一个跟踪是使用插件/分割工具, 使用从细胞体的起点和树突的终点创建的。蓝线 (白色箭头) 表示定义的路径。单击 "是" (红色箭头) 后, 线条将颜色从蓝色更改为红色。(b)单击 "完成路径", 它将显示为紫色(c)。(A-C)显示跟踪单个枝晶的过程;(d)完整的跟踪图像。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 测量跟踪路径.左侧的图像显示了如何在运行 "分析" 后测量跟踪路径。测量路径。将路径长度值导出到电子表格文件中, 并计算长度之和。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 手动定义枝晶表面积的示例.通过使用 imagej 窗口菜单中的手绘工具 (用红色箭头显示) 获得定义的图像。通过选择 "区域" 设置测量值。运行 "测量" 函数以获取红色框中显示的区域。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 分支分析的示例.运行 "分析 _ 渲染在 "分段" 插件窗口中分析骨架化路径 "。呈现的路径及其编号是通过选择 "渲染所有路径" 获得的获取摘要。在细胞体和树突尖端之间定义了路径, 一个路径可以包括多个分支;例如, 原生乔木是神经元细胞体的树突;次生乔木是从一级等分支, 以三级, 第四纪, 二元乔木。树突分枝的结构根据枝条的水平进行分离。例如, 主要% 是分支的数量除以分支总数, 依此类推。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: sox102f 在da 神经元中沉默的代表性结果.sox102f在 da 神经元中的沉默 (uas-sox102f-rnais-gfp; ppk-gal4) 导致树突长度显著缩短, 在第三亚耳中的结构较简单, 与对照相比, 更简单。sox102f-rnai 苍蝇 (uas-sox102f-rnais-gfp) 的差异; ppk-gal4, n = 21) 和控制 (UAS-GFP;ppk-GAL4/+, n = 20) 苍蝇上 (a) 枝晶长度 (b) 乔木表面积 (c) 分支总数, 和 (d, e) da 神经元的分支结构。学生 t 检验是为了进行统计分析。* 表示统计意义 (p & lt;0.05)。误差条为平均±标准偏差。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
支配表皮的树突是神经元的输入区域, 它们的形态决定了单个神经元如何接收和处理信息。枝晶形态的发展反映了枝晶组织的基因调控。外周神经系统的山龙幼虫是研究树突发育的重要模型, 因为: 1) 与哺乳动物功能相似 11,12;2) 基于枝晶结构11、12 的四个类区别;3) 调节形态发生的遗传因素。在该协议中, 我们提出了从幼虫准备到红景天神经元图像分析的工作流程。这些方法详细描述了分析大神经元树突的四个重要参数, 即树突的长度、表面积、分枝总数和分枝结构。关键的一步是从幼虫体壁中取出尽可能多的组织, 以充分暴露 da 神经元进行成像和分析。由于 z 投影图像的数量有限, 可能会有一些短分支被切断。由于该方法是对树突长度与对照相比的相对测量, 因此应为每一组大神经元拍摄大量图像, 以增加 z 投影图像的覆盖范围。
五形龙舌兰数元 15、21、22、23 一直是研究树突乔木形态的研究热点。树突状乔木发育的形态发生可能会因为基因功能的丧失或增加而中断, 表明达神经元的发育对基因变化很敏感 24.对于遗传研究, 准确地分析形态以了解其对 da 神经元的影响是非常重要的。iv 类神经元是复杂的, 但仍然可以进行高质量的成像, 因为它们位于半透明的身体壁和分支的正下方, 几乎完全位于二维空间中。动态 gfp 荧光标记 da 神经元 (ppk-gal4;uas-gfp) 为研究神经元的发育提供了一个易于可视化的模型。形态的方向变化不同, 乔木可能会变得过度或简化。在这里, 我们通过定量参数对这些形态变化进行了分类,例如枝晶长度、表面积、分枝总数和 da 神经元的分枝结构。研究结果反映了sox102f表达调节神经元发育的反应, 如本研究所示。
我们的协议被用来显示苍蝇中 iv-da 类神经元的形态变化,其中 sox5 的果蝇正学体sox102f 被沉默, 表明sox5在树突状发育中的重要功能作用和形态发生。wnt 蛋白是一个由分泌的糖蛋白组成的家族, 与调节树突形态发生有关。wnt2 和 wnt7b 促进 da 和神经元复杂性9,10。在 wnt 规范途径中, 这种激活之后是 gsk3β的激活, 即血清-苏氨酸激酶, 它又激活β-儿茶素介导的转录 10,25。我们之前发现, sh-sy5y 神经母细胞瘤细胞中sox5的沉默导致了对 wnt 信号活动的显著抑制, 并调节了一些 wnt 基因的表达, 包括gsk3β的过度表达15岁gsk3β的表达增加与 ad 的标志特征有关, 包括记忆力丧失、β-淀粉样物质瘟疫和 tau 26 的高磷酸化异常.sox5的沉默增加了gsk3β表达式, 这可能表明sox5和gsk3β之间存在功能联系。
iv 类神经元具有所有感觉神经元中最复杂的树突。在该协议中, 我们开发了一种方法来分析乔木和分支的复杂性, 以抽象基于传统可用的插件和软件的辖下iv-da 类神经元的性质。分析了从共聚焦显微镜中提取的图像, 简单神经元示踪剂的插件分割为追踪枝晶分支 27、28提供了理想的工具。此外, 这种量化方法允许详细分析枝晶复杂度, 通过提出从 soma 到更远的枝晶的不同分枝的比率。此外, 该方法可用于分析其他类别的 da 神经元。例如, i 类 da 神经元将次生树突延伸到体壁的一侧;二类有对称分叉的分支;iii 类神经元有更多的分支和尖峰的复杂性。总之, 我们提供了一个成像和分析的方案, 为神经节树突分析的嗜德维沙共和国。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢威廉·艾默尔的成像技术援助。这项工作得到了治疗阿尔茨海默氏症基金 [r. e. t]、国家卫生研究所 [r01ag014713 和 r01mh60009 至 r. e. t。r03ar063271 和 r15eb019704 至 a. l.] 和国家科学基金会 [nsf1455613 至 a. l.]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
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