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Artigo de método

Um ensaio de Microarray da proteína para determinação sorológica do antígeno-específicas anticorpo respostas seguintes Clostridium difficile infecção

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DOI:

10.3791/57399

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15 de junho de 2018

 ,  , 
1Breast Surgery Group, Division of Medical Sciences and Graduate Entry Medicine, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham, 2Medical Microbiology and Immunology Department, Faculty of Medicine, Mansoura University, 3Nottingham Digestive Diseases Centre and NIHR Nottingham Digestive Diseases Biomedical Research Centre, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve um método de microarray de proteína simples para perfilação humorais respostas imunes a um painel de 7-plex de altamente purificado antígenos de Clostridium difficile em soros humanos. O protocolo pode ser estendido para a determinação de respostas de anticorpos específicos em preparações de imunoglobulina intravenosa policlonal.

Resumo

Nós fornecemos uma visão detalhada de um ensaio de microarray de romance da elevado-produção de proteínas para a determinação de antiníveis de anticorpos deClostridium difficile em soros humanos e em preparações separadas de polyclonal imunoglobulina intravenosa (IVIg). O protocolo descreve as etapas metodológicas envolvidas na preparação de amostra, impressão de matrizes, procedimento de ensaio e análise de dados. Além disso, este protocolo pode ser desenvolvido para incorporar diversas amostras clínicas incluindo plasma e sobrenadantes. Mostramos como proteína microarray pode ser usado para determinar uma combinação de isotipo (IgG, IgA, IgM), subclasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), e anticorpos específicos de estirpe altamente purificado toda c. difficile toxinas A e B (toxinotype-0, estirpe VPI ribotype 10463, 087), toxina B de uma c. difficile toxina B-somente expressando estirpe (CCUG 20309), uma forma de precursor de um fragmento B da toxina binária, pCDTb, proteínas de toda a superfície da camada de ribotype específicos (SLPs; 001, 002, 027) e controle de proteínas (tétano tetânico e Candida albicans). Durante o experimento, microarrays são analisados com soros de indivíduos com infecção por c. difficile (CDI), os indivíduos com fibrose cística (CF), sem diarreia, controles saudáveis (HC) e de indivíduos pré e post-IVIg terapia para o tratamento de transtorno de imunodeficiência combinada, CDI e polyradiculopathy desmielinizante inflamatória crônica. Encontramos diferenças significativas de eficácias de neutralização de toxina e níveis de anticorpos específicos de multi-isotipo entre grupos de pacientes, preparações comerciais de IVIg e sera antes e após a administração IVIg. Além disso, há uma correlação significativa entre microarray e ensaio imunoenzimático (ELISA) para os níveis de IgG antitoxina em amostras de soro. Estes resultados sugerem que microarray pode se tornar uma ferramenta promissora para o perfilamento respostas de anticorpos para antígenos de c nos seres humanos infectados ou vacinados. Com mais refinamento de painéis de antígeno e uma redução nos custos de produção, prevemos que tecnologia microarray pode ajudar a otimizar e selecione as imunoterapias mais clinicamente útil para c. difficile infecção de forma paciente específico.

Introdução

Este protocolo descreve o desenvolvimento e validação de um ensaio de microarray de proteína romance e personalizado para a deteção e a quantificação semi da estirpe bacteriana e respostas específicas do isotipo do anticorpo aos antígenos de c. difficile . Utilizamos com êxito o nosso c. difficile-ensaio de microarray específico como uma nova ferramenta promissora para a Bioanálise composicional de conteúdo de anticorpos específicos no soro dos doentes1,2, preparações de IVIg3, e identificação das especificidades de anticorpos que correlacionam com resultados pobres em CDI4. Demonstramos como amostras de soro biobanked e preparações comerciais de IVIg podem ser analisadas em slides de microarray, permitindo alta qualidade reprodutível caracterização das respostas de anticorpos específicos do patógeno c. difficile neste ensaio.

Muitas crianças saudáveis e adultos têm anticorpos IgG e IgA detectável soro c. difficile toxinas A e B5,6. Estes são pensados para surgir na sequência de exposição transitória durante a infância e após a exposição a c. difficile na idade adulta. Por esta razão, IVIg policlonal tem sido utilizado off-label para tratar recorrentes e fulminante CDI7,8,9. No entanto, seu papel definitivo e modo de ação ainda não está claro. Vários estudos têm mostrado que a resposta imune humoral a c. difficile toxinas desempenha um papel na apresentação da doença e dos resultados. Especificamente, pacientes assintomáticos mostram uma aumento anti-toxina IgG A concentração sérica comparada aos pacientes que desenvolvem doença sintomática10. Relatou-se uma associação demonstrável para títulos de IgG A anti-toxina medianos e mortalidade 30 dias11. Vários relatórios também revelaram uma associação com uma proteção contra a recorrência e anticorpo respostas a toxina A, B e vários antígenos não-toxina (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD e proteínas da camada superficial (SLPs))12,13 , 14 , 15. estas observações têm estimulado o desenvolvimento da primeira imunoterapia passiva droga alvo c. difficile toxina B (bezlotuxumab), que recentemente foi aprovado pelo Food e Drug Administration e os medicamentos Europeu Agência para a prevenção da recorrente CDI16. Estratégias de vacinação usando toxinas inactivadas ou fragmentos de toxina recombinante também estão atualmente sob desenvolvimento17,18,19. Estas novas abordagens terapêuticas, sem dúvida, irão estimular a exigência de avaliação humorais respostas imunes aos antígenos múltiplos em tamanhos de amostra grande.

Hoje, há uma notável falta de ensaios comercialmente disponíveis de alta produtividade capaz de avaliar simultaneamente a estirpe bacteriana e respostas específicas do isotipo do anticorpo aos antígenos de c. difficile . Há uma necessidade não atendida de desenvolver tais ensaios para facilitar os esforços de investigação futuras e aplicações clínicas. Os microarrays da proteína são um método para imobilizar um grande número de proteínas purificadas individualmente como uma matriz espacialmente organizada de pontos sobre uma superfície com base em slide microscópica por meio de um sistema robótico, que pode ser um contato20 ou um contato não- 21. ferramenta da impressão. As manchas podem representar misturas complexas como lisados celulares, anticorpos, tecido homogenates, proteínas endógenas ou recombinantes ou peptídeos, fluidos corporais ou drogas22,23.

Tecnologia de microarray de proteína oferece vantagens distintas sobre ELISA in-house padrão técnicas, que tem sido tradicionalmente usadas para avaliar as respostas de anticorpos dec. difficile anti. Estes incluem um aumento da capacidade para a detecção de uma gama de multi-específicas do isotipo anticorpos contra um painel mais amplo de alvos de proteína, requisitos de volume reduzido de antígenos, amostras e reagentes e a capacidade avançada de incorporar uma maior número de repetições de técnicas, além de controle de qualidade interno múltiplo (QC) mede1. Microarrays são, portanto, mais sensíveis, precisos e reprodutíveis e têm uma maior gama dinâmica. Esses fatores tornam microarrays uma alternativa mais barata e potencialmente favorável para ELISA para a detecção em larga escala de proteínas conhecidas. No entanto, as desvantagens da tecnologia microarray resultam principalmente os grandes custos adiantados associados com o estabelecimento de um painel de antígenos altamente purificados e criação de plataforma tecnológica.

Os microarrays da proteína têm sido extensivamente usados nas últimas duas décadas como ferramenta de pesquisa básica e diagnóstico em aplicações clínicas. Aplicações específicas incluem a expressão da proteína de perfil, o estudo das relações de enzima-substrato, triagem de biomarcador, análise das interações do anfitrião-micróbio e criação de perfil de anticorpo especificidade23,24, 25de27,,26,28. Muitos novo patógeno/antígeno da proteína microarrays foram estabelecidos, incluindo malária (Plasmodium)29, HIV-130, gripe31, síndrome respiratória aguda grave (SARS)32, febre hemorrágica viral33 , herpesviruses,34e tuberculose35.

O presente protocolo refere-se ao estabelecimento de um fácil funcionamento C. difficile antígeno reativa microarray do ensaio, que permite a quantificação, precisa e específica de multi-isotype e respostas de anticorpos específicos de estirpe de C. difficile antígenos em soros e policlonal IVIg. Neste documento, que incluem resultados representativos referentes a um desempenho aceitável do microarray quando comparado com ELISA, bem como a precisão do ensaio e a reprodutibilidade perfis. Este ensaio poderia ser desenvolvido para o perfil de outras amostras clínicas e define um novo padrão para a investigação sobre a base molecular do CDI.

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Protocolo

1. preparar um prato de Microarray

  1. Diluir a antígenos de c. difficile com um buffer de impressão [PBS-Tween-trealose (50mm)] para a concentração ideal (que foi predefinida antes de executar o paciente sera): toxina um (200 µ g/mL) e toxina B (100 µ g/mL), pCDTb (200 µ g/mL) e purificado nativo SLPs todo derivado ribotypes 001, 002 e 027 (200 µ g/mL).
    Nota: Toxina B foi obtida uma toxina B-expressando estirpe CCUG 20309 (90 µ g/mL).
    1. Dilua os controles positivos, lysates de c. albicanse toxoide tetânico com o buffer de impressão de 100 µ g/mL. Finalmente, dilua a imunoglobulina humana purificada, combinando o isotipo do anticorpo testado em série, começando com 50 µ g/mL em 10 diluições no buffer de impressão para criar uma curva de calibração.
  2. Transferi 10 µ l de diluições no buffer de impressão em uma placa de 384.
  3. Cubra o prato com um selo de placa e centrifugar 300 x g por 5 min.

2. impressão matrizes com um robô contato

  1. Calor o pino de silício usando o queimador de gás portátil 3 x 2 s e enxaguar em água limpa 3 x 3 s cada.
  2. Coloque a placa de microarray dentro do cartucho de carregamento da arrayer.
  3. Coloque as lâminas de aminosilane sobre a bandeja de slide.
    Nota: O tabuleiro de slide pode segurar 27 slides: três linhas de nove slides. Os slides estão dispostos em orientação retrato, a partir do lado esquerdo da linha de fundo e o resto dos espaços são cobertos com slides em branco para garantir que todos os furos da bandeja de slide são cobertos.
    1. Pressione Okey e verifique se um vácuo foi ligado e todos os slides são seguros. Deixe os slides no ambiente úmido pelo menos 1h antes de iniciar a impressão.
      Nota: Os slides aminosilane são fornecidos em uma bolsa selada com dessecante. Uma vez aberto, qualquer slides não utilizadas devem ser imediatamente devolvidos exsicador para armazenamento até a data de validade.
  4. Configure o programa de impressão adequado para imprimir antígenos do Clostridium difficile . Lançamento da suíte de aplicativos de TAS e abra o arquivo de parâmetros de execução necessários cópia do diretório 'My Gridding de pistas'. Selecione o arquivo de Clostridium difficile para imprimir todos os antígenos de Clostridium difficile em quadruplicado.
  5. Após a clicando duas vezes no ícone do MicroArray na janela principal, uma janela com três guias aparecerá chamado 'parâmetros de MicroArraying'.  As três guias são a "Fonte", "Destino" e "Opções". Na guia "Fonte" mostra detalhes do número de amostras utilizadas na placa de microarray. Na guia "Alvo" mostra detalhes de como os slides estão a ser carregado, onde a matriz deve ser impresso no slide e editar o layout do slide (16 subarray formatos). Na guia "Opções" mostra detalhes do protocolo de lavagem e ferramenta a ser usada, por exemplo. lavar depois de cada amostra concluída. Limpe o pino de silício entre amostras para evitar qualquer contaminação cruzada entre amostras diferentes.
  6. As opções de programação estão localizadas em Opções > Preferências executar na barra de ferramentas TAS Application Suite. Existem 9 abas para trabalhar através desta seção e como você uma guia completo mover para o próximo, clicando sobre ela. Clicar o botão "Okey" irá levá-lo fora "Preferências de execução". Na aba "Geral" das preferências do"Run", há um número de caixas de seleção disponíveis sob esta secção relativa à como o instrumento irá se comportar quando um programa é iniciado. Marque a caixa "Banho Prime antes início de execução", todas as estações de lavagem três passará por uma sequência de escorva curto antes do início da execução. Marque a caixa "Lavar no início da corrida", a ferramenta de pin será lavada antes de visitar a primeira fonte. Verifique a caixa de "Lavagem final de execução", a ferramenta de pin será lavada após a última fonte de visita. O usuário pode definir o número de ciclos de lavagem. Na aba "Clima" das preferências do"Run", comece a humidificação. A configuração que usamos são os seguintes: começar a taxa de 55%, execute alvo umidade 60%, umidade mínima de 55%, taxa de 55%. Não comece a correr até que chegou-se a umidade do alvo, caso contrário as manchas serão o tamanho errado e a biblioteca evaporará rapidamente.
  7. Na barra do menu de TAS, clique o botão verde e vá.  Começar a correr e periodicamente observar o arrayer durante a tiragem ser certos tudo é Okey.
    Nota: Isto permite a análise de 15 amostras em paralelo em cada slide como um subarray é usado como um controle negativo. O design de subarrays é determinado pelo número das proteínas (antígenos) impressos e o número do impresso biológico Replica.
    Nota: Após a impressão de cada amostra, a cabeça se move em direção os banhos de lavagem para permitir que múltiplos mergulhando do pino dois banhos de lavagem com água destilada e 0,002% Tween 20 para 1.5 s em cada banho, seguido de enxaguar o pino com água ultra-pura e secagem o pino na a estação de lavagem de 4 s.

3. armazenamento das matrizes

  1. Manter os slides impressos armazenados durante a noite à temperatura ambiente no exsicador.
    Nota: Os slides impressos podem ser armazenados por até uma semana.

4. matriz de sondagem

  1. Coloque cuidadosamente slides impressos em um suporte de corrediça de formato 16 câmaras multi bem.
    Nota: As câmaras, tendo uma profundidade de aproximadamente 7,5 mm, proporcionam uma superfície generosa à relação do volume para facilitar a mistura e etapas de lavagem.
  2. Permitir que todos os reagentes aquecer a temperatura ambiente antes do uso. A menos que especificado de outra forma, execute todas as etapas a seguir à temperatura ambiente.
  3. Adicione 100 µ l de filtrado tween 5% albumina de soro bovino (BSAT; use um filtro de seringa 0,2 µm) para cada bloco, cobrir os slides e incube-os com agitação por 1h.
  4. Lave os slides 5 x 1 min cada em 120 µ l de tampão fosfato salino com Tween 20 (PBST; 0,1% Tween) por alvéolo com agitação. Não deixe os slides dessecar.
  5. Descongelar as amostras de soro no gelo por 20 min e diluir cada amostra com um diluente de anticorpo comercialmente disponível com fundo reduzindo o componente (ver Tabela de materiais).
    1. Otimize a diluição das amostras de soro, de acordo com a imunoglobulina testada conforme mostrado na tabela 2.
  6. Transferir 100 µ l das amostras de soro diluído para todos os blocos, exceto um, que será usado como um controle negativo; a este bairro, adicione 100 µ l de diluente de anticorpo só. Incube as lâminas com agitação suave por 1h.
  7. Lave os slides 5 x 3 min cada em 120 µ l de PBST (0.1% Tween) por alvéolo com agitação.
  8. Adicione 100 µ l de um biotinilado de anti-humano cabra diluído com diluente de anticorpo.
    1. Otimize a diluição do anticorpo secundário de acordo com a imunoglobulina testado conforme descrito na tabela 2. Cobrir os slides e incube-os com agitação suave por 1h.
  9. Lave os slides 5 x 3 min cada em 120 µ l de PBST por alvéolo com agitação.
  10. Adicione 100 µ l de estreptavidina Cy5 para cada bloco diluído a 1: 2000 em 5% BSA. Cobrir os slides com papel alumínio para protegê-los de luz, enquanto a agitação por 15 min com agitação suave.
  11. Lave os slides 5 x 1 min cada em 120 µ l de PBST por alvéolo com agitação, seguido por 2 lavagens de 1 min cada em PBS apenas com agitação.
  12. Gire as lâminas durante 5 min à 300 g x para secá-las.
  13. Mantenha os slides em uma caixa escura para transporte e armazenamento à temperatura ambiente.
  14. Proceda para digitalizar as matrizes imediatamente para garantir a consistência do sinal após a sondagem.
    Nota: No entanto, sondados slides podem ser armazenados no escuro e digitalizados dentro de uma semana de sondagem.

5. as matrizes de digitalização

  1. Ligue o scanner a laser (ver Tabela de materiais) 30 min antes da digitalização para aquecer o laser. Carregar o software do scanner e conectar o computador ao scanner.
  2. Coloque um slide com o lado impresso face para cima no scanner até o jogo de luz fica verde.
  3. Pressione o botão de configurações e ajustar as configurações a seguir ao digitalizar slides da seguinte forma: modo Scan, mediana; Aquisição, 635 Modo de aquisição, Manual; Ganho, 20; Poder, baixo; Tipo de slide, Slide sem rótulo; Foco, foco automático. Desativar a rolagem automática e definir Barcode Reading Pixel tamanho 10 e 35 Scan.
  4. Salve as imagens resultantes como cinza de 16 bits vários formato de imagem TIFF. Pressione o botão de Importação de grade e selecione a lista matriz apropriada.
    Nota: A lista de matriz descreve o tamanho e a posição de subarrays e os nomes das substâncias impressos associados com cada recurso-indicador.
    1. Alinhe a grade para as manchas no slide.
  5. Analise as imagens pressionando o botão de processo de quantificação para medir as intensidades do sinal de fluorescência de cada ponto e salvar os resultados em um formato de texto chamado GenePix resultados (GPR).
    Nota: O arquivo GPR contém as variáveis de localização e identificação dos alvos do antígeno na matriz e também a intensidade da fluorescência mediano e o fundo local que representa a ligação do anticorpo sinal valores de cada ponto.

6. análise de dados

  1. Calcule a mediana para as repetições de cada antigénio após subtracção de fundo usando um software de análise de microarray gratuito chamado analisador de fase reversa proteína matriz (RPPA), um módulo dentro a linguagem estatística R em CRAN36.
  2. Traçar a curva padrão e interpolar os sinais de cada antígeno em relação a curva de imunoglobulina padrão usando gráficos científicos comercial e software de estatísticas (ver Tabela de materiais) para calcular os níveis de anticorpos.

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Resultados

A Figura 1 ilustra um fluxograma descrevendo as etapas principais no protocolo descrito. A Figura 2 mostra testes de correlação de Spearman demonstrando acordo significativo entre microarray e ELISA IgG e IgA antitoxina A e B os níveis no paciente teste sera. A Figura 3 mostra diferencial IgG e IgA de anticorpo-classe respostas de anticorpos específicos para A toxina, toxina B e toxina binária (pCDTb...

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Discussão

Neste protocolo, mostramos que microarray é uma plataforma adequada para definir humorais respostas imunes aos antígenos de proteína c. difficile em soros de doentes (figuras 3 e 6) e preparações comerciais de IVIg (Figura 5). Nós também têm demonstrado que a técnica de microarray executa bem em comparação com o ELISA convencional (Figura 2) e mostra excelente reprodutibilidade, com intra e inter assay variabilities cai...

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Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa Hermes Ola Negm e Tanya Monaghan e através de financiamento separado do centro de doenças digestivas de Nottingham e a NIHR Nottingham digestivo doenças Biomedical Research Centre.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BioRobotics MicroGrid II arrayerDigilab, Malborough, MA, EUAN/AArray de contato usado para detecção automatizada dos antígenos nas lâminas.
Scanner InnoScan 710.InnopsysN/AUm scanner de lâminas de microarray fluorescente com um laser vermelho (Cy5) para ler a reação.
Software MAPIX versão 7.2.0InnopsysN/AMeça as intensidades de sinal dos spots.
Pino de contato de silícioTecnologias de síntese paralelaSMT-P75Imprima as amostras nas lâminas.
Thermo Scientific Nalgene DesseccatorThermo Scientific41102426Para armazenar as lâminas novas e impressas.
Placa de 384 poçosGenetixX7022UNPara preparar os antígenos.
Tampa da placaSigma Aldrich, Reino UnidoCLS6570-100EAPara reduzir a evaporação das amostras.
Lâminas de aminosilanoSchott,  Alemanha1064875A lâmina de escolha para imprimir os antígenos.
Suportes de slidesGraceBio Labs, EUA204862Divida os slides em 16 subarrays idênticos. Estes suportes são reutilizáveis, removíveis, à prova de vazamentos.
Lisado de Candida albicansNIBSCPR-BA117-SControle positivo
Toxoide tetânicoAthens Research and Technology04/150Controle positivo
Imunoglobulina G (IgG), Plasma Humano Normal  Pesquisa de Atenas e  tecnologia   16-16-090707Imunoglobulina G IgG Humana Nativa Purificada, Plasma Humano. 
Imunoglobulina G1 (IgG1), Plasma Humano Normal  Pesquisa de Atenas e  tecnologia   16-16-090707-1Imunoglobulina Humana Nativa Purificada G1 IgG1, Plasma Humano. 
Imunoglobulina G2 (IgG2), Plasma Humano Normal  Pesquisa de Atenas e  tecnologia   16-16-090707-2Imunoglobulina Humana Nativa Purificada G2 IgG2, Plasma Humano. 
Imunoglobulina G3 (IgG3), Plasma Humano Normal  Pesquisa de Atenas e  tecnologia   16-16-090707-3Imunoglobulina Humana Nativa Purificada G3 IgG3, Plasma Humano. 
Imunoglobulina G4 (IgG4), Plasma Humano Normal  Pesquisa de Atenas e  tecnologia   16-16-090707-4Imunoglobulina Humana Nativa Purificada G4 IgG4, Plasma Humano. 
Imunoglobulina A (IgA), Plasma Humano  Pesquisa de Atenas e  tecnologia   16-16-090701Imunoglobulina A (IgA) humana nativa purificada, plasma humano.
Imunoglobulina A1 (IgA1), Mieloma Humano Plasma  Pesquisa de Atenas e  tecnologia   16-16-090701-1MImunoglobulina Humana Nativa Purificada A1 (IgA1), Plasma Humano.
Imunoglobulina A2 (IgA2), Mieloma Humano Plasma  Pesquisa de Atenas e  tecnologia   16-16-090701-2MImunoglobulina Humana Nativa A2 Purificada (IgA2), Plasma Humano.
Imunoglobulina M (IgM), Plasma Humano  Pesquisa de Atenas e  tecnologia   16-16-090713Imunoglobulina M Humana Nativa Purificada (IgM), Plasma Humano.
Anticorpo anti-IgG humano de cabra biotinilado, específico da cadeia gamaVector LabsBA-3080O anticorpo anti-IgG humano de cabra (específico da cadeia gama) de cabra reage especificamente com IgG humana, mas não com outras imunoglobulinas.
Dobradiça IgG1 Anti-Humana para Camundongos-BIOTSouthern Biotec9052-08 O anticorpo de biotina IgG1 humano de cabra reage especificamente com IgG1 humano, mas não com outras imunoglobulinas.
Camundongo Anti-Humano IgG2 Fc-BIOTSouthern Biotec9060-08   O anticorpo IgG2-biotina anti-humano de cabra reage especificamente com IgG 2 humana, mas não com outras imunoglobulinas.
Dobradiça IgG3 Anti-Humana para Camundongos-BIOTSouthern Biotec9210-08     O anticorpo IgG3-biotina humano de cabra reage especificamente com IgG3 humana, mas não com outras imunoglobulinas.
Camundongo Anti-Humano IgG4 pFc'-BIOTSouthern Biotec9190-08   O anticorpo IgG-biotina humana de cabra reage especificamente com IgG humana, mas não com outras imunoglobulinas.
IgA anti-humana, específica da cadeia alfa, feita em cabra - BiotinylatedVector LabsBA-3030O anticorpo anti-IgG humano -biotina de cabra reage especificamente com IgG humano, mas não com outras imunoglobulinas.
Camundongo anti-humano IgA1-BIOTSouthern Biotec9130-08O anticorpo de cabra anti-humano IgG -biotina reage especificamente com IgG humano, mas não com outras imunoglobulinas.
Camundongo Anti-Humano IgA2-BIOTSouthern Biotec9140-08   O anticorpo IgG humano de cabra - biotina reage especificamente com IgG humano, mas não com outras imunoglobulinas.
Camundongo Anti-Humano IgM-BIOTSouthern Biotec9020-08 O anticorpo IgG-biotina humana de cabra reage especificamente com IgG humana, mas não com outras imunoglobulinas.
filtro de seringa de 0,2 mmThermo scientific723-2520Filtre o BSA de 5%.
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma Aldrich, Reino UnidoA7284Use 5% de BSA para bloquear as lâminas.
Diluente de anticorposDako, Reino UnidoS3022Para diluir o soro e o anticorpo secundário.
Estreptavidin Cy5eBioscienceSA1011Detecção da reação imune.
Toxinas inteiras purificadas de C. difficile A e B (toxinotipo 0, cepa VPI 10463, ribotipo 087)Grupo de Toxinas, Saúde Pública InglaterraNA
Toxina B inteira purificada de C. difficile (toxina CCUG 20309 B apenas expressando cepa)Grupo de Toxinas, Saúde Pública InglaterraNA
Forma precursora do fragmento B da toxina binária, pCDTbUniversidade de Bath NAProduzido em E. Coli a partir de uma construção de gene recombinante totalmente sintético. Sequência de aminoácidos baseada na sequência publicada do ribótipo 027 (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Proteínas da camada superficial específica do ribótipo inteiro nativo purificado (001, 002, 027)Dublin City University NA
Vigam (preparação IVIg 1)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Privigen (preparação IVIg 2)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Intratect (preparação IVIg 3)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A

Referências

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