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Immunology and Infection

Une analyse de Microarray de protéine pour détermination sérologique de l’Infection à Clostridium difficile anticorps réponses suivantes spécifiques à l’antigène

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57399
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3
1Breast Surgery Group, Division of Medical Sciences and Graduate Entry Medicine, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham, 2Medical Microbiology and Immunology Department, Faculty of Medicine, Mansoura University, 3Nottingham Digestive Diseases Centre and NIHR Nottingham Digestive Diseases Biomedical Research Centre, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham

Summary

Cet article décrit une méthode de microarray de protéine simple pour profilage immunité humorale à un panel de 7-plex de hautement purifié des antigènes de Clostridium difficile dans les sérums humains. Le protocole peut être prolongé pour la détermination de la production d’anticorps spécifiques dans les préparations d’immunoglobulines par voie intraveineuse polyclonal.

Abstract

Nous fournissons un aperçu détaillé d’un essai de microarray de nouvelle protéine de haut-débit pour la détermination de l’anti -Clostridium difficile taux d’anticorps dans le sérum humain et dans les préparations distinctes de polyclonal immunoglobulines intraveineuses (IgIV). Le protocole décrit les étapes méthodologiques impliqués dans la préparation de l’échantillon, impression de tableaux, mode opératoire et l’analyse des données. En outre, ce protocole pourrait être développé pour intégrer divers échantillons cliniques, y compris le plasma et les surnageants de culture de cellules. Nous montrons comment microarray de protéine peut être utilisée pour déterminer une combinaison d’isotype (IgG, IgA, IgM), de la sous-classe (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) et anticorps spécifiques à la souche hautement purifiée de toute c. difficile les toxines A et B (toxinotype 0, souche VPI 10463, ribotype 087), la toxine B d’une souche exprime c. difficile toxine-B-only (CCUG 20309), une forme de précurseur d’un fragment de B de la toxine binaire, pCDTb, des protéines spécifiques ribotype couche toute la surface (SLPs ; 001, 002, 027) et le contrôle des protéines (tétanos anatoxine tétanique et Candida albicans). Pendant l’expérience, microarrays sont détectés avec des sérums de personnes atteintes d’infection à c. difficile (CDI), personnes atteintes de fibrose kystique (FK) sans diarrhée, témoins sains (HC) et de personnes préalables et post-IVIg thérapie pour la traitement de la CDI, l’immunodéficience combinée trouble et polyradiculopathy démyélinisante inflammatoire chronique. Nous rencontrons en efficacité de neutralisation de la toxine et taux d’anticorps spécifiques multi-isotype des différences significatives entre les groupes de patients, les préparations commerciales d’IgIV et sérums avant et après administration d’IgIV. En outre, il y une corrélation significative entre microarray et immuno enzymatique (ELISA) pour les IgG d’antitoxine dans le sérum. Ces résultats suggèrent que « microarray » pourrait devenir un outil prometteur pour le profilage d’anticorps aux antigènes de C.difficile chez les humains vaccinés ou infectés. Avec plus de raffinement des panneaux de l’antigène et une réduction des coûts de production, nous prévoyons que microréseau technologie peut aider à optimiser et sélectionnez les immunothérapies plus cliniquement utiles pour l’infection à c. difficile d’une manière spécifique au patient.

Introduction

Ce protocole décrit le développement et la validation d’un test de microarray de protéine originale et personnalisée pour la détection et la quantification semi de souche bactérienne et isotype-spécifiques d’anticorps aux antigènes de c. difficile . Nous utilisons avec succès notre c.difficile-dosage spécifique « microarray » comme un nouvel outil prometteur pour la bioanalyse composition du contenu spécifique d’anticorps dans le sérum du patient1,2, préparations d’IgIV3, et identification des spécificités anticorps qui sont en corrélation avec les mauvais résultats en CDI4. Nous démontrons comment fin des échantillons de sérum et de préparations commerciales d’IgIV peuvent être analysées sur lames microarray, permettant qualité reproductible profilage des réponses anticorps pathogène spécifique c. difficile dans cet essai.

Beaucoup de santé des enfants et d’adultes ont des anticorps IgG et IgA sériques détectables toxines de c. difficile A et B5,6. Ceux-ci sont censés survenir suite à l’exposition transitoire au cours de la petite enfance et après une exposition à c. difficile à l’âge adulte. Pour cette raison, polyclonal IgIV a été utilisé hors AMM pour traiter les récurrentes et fulminante CDI7,8,9. Cependant, son rôle définitif et son mode d’action reste peu clair. Plusieurs études ont montré que la réponse immunitaire humorale aux toxines de Clostridium joue un rôle dans la présentation de la maladie et les résultats. Plus particulièrement, les patients asymptomatiques montrent une concentration accrue de sérum anti-toxine A IgG comparée aux patients qui développent une maladie symptomatique10. Une association démontrable a été rapportée pour médian anti-toxines IgG A des titres et11de la mortalité de toutes causes de 30 jours. Plusieurs rapports ont également révélé une liaison avec une protection contre les réponses anticorps et la récurrence à la toxine A, B et plusieurs antigènes non-toxine (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD et protéines de la couche superficielle (SLPs))12,13 , 14 , 15. ces observations ont stimulé le développement de la première Immunothérapie passive drogue ciblage c. la toxine B (bezlotuxumab), qui a récemment été approuvé par la US Food and Drug Administration et l’européenne des médicaments Agence pour la prévention des renouvelables CDI16. Stratégies de vaccination à l’aide de toxines inactivées ou fragments de toxine recombinantes sont également en cours de développement17,18,19. Ces nouvelles approches thérapeutiques stimulera sans doute l’exigence d’évaluation immunité humorale aux antigènes multiples dans vastes échantillons.

Aujourd'hui, il y a un manque notable d’essais disponibles dans le commerce de haut débit capable de mesurer simultanément la souche bactérienne et isotype-spécifiques d’anticorps aux antigènes de c. difficile . Il y a un besoin de développer ces tests afin de faciliter les efforts de recherche futurs et des applications cliniques. Microarrays de protéine sont une méthode d’immobiliser un grand nombre de protéines purifiées individuellement sous forme de tableau dans l’espace organisé des taches sur une surface microscopique axée sur la diapositive à l’aide d’un système robotisé qui peut être un contact20 ou un sans contact outil d’impression21. Les taches peuvent représenter des mélanges complexes tels que les lysats cellulaires, anticorps, homogénats tissulaires, protéines endogènes ou recombinantes ou peptides, fluides corporels ou médicaments22,23.

Technologie des microréseaux protéine offre des avantages distincts par ELISA interne standard techniques, qui ont traditionnellement été utilisées pour évaluer les réponses en anticorps anti -c. difficile . Il s’agit d’une capacité accrue pour détecter toute une série d’anticorps multi isotype-spécifiques contre un panel plus large de cibles protéiques, exigences de diminution du volume pour les antigènes, les échantillons et les réactifs et une capacité accrue d’intégrer un plus grand nombre de réplicats techniques, en plus du contrôle de qualité interne multiple (QC) mesure1. Puces sont donc plus sensible, précise et reproductible et ont une plus grande gamme dynamique. Ces facteurs rendent les microarrays une alternative meilleur marchée et potentiellement favorable à ELISA pour la détection à grande échelle des protéines connues. Cependant, inconvénients de la technologie des microréseaux résultent principalement des grandes coûts initiaux associés instituant un groupe d’antigènes hautement purifiés et mise en place de la plate-forme technologique.

Microarrays de protéine ont été largement utilisées pendant les deux dernières décennies comme un outil de recherche diagnostique et fondamentales en applications cliniques. Les applications spécifiques comprennent l’expression de la protéine de profilage, l’étude des relations d’enzyme / substrate, dépistage de biomarqueurs, analyse des interactions hôtes-microorganismes et profilage des anticorps spécificité23,24, 25,26,27,28. Nombreux nouveaux pathogènes/antigène de protéine microarrays ont été établis, y compris le paludisme (Plasmodium)29, VIH-1,30,31de la grippe, syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS)32, fièvre hémorragique virale33 , virus de l’herpès34et35de la tuberculose.

Le présent protocole est liée à la mise en place d’un simple fonctionnement C. réactive antigène microarray test difficile , qui permet une quantification exacte, précise et spécifique des multi-isotype et production d’anticorps spécifiques à la souche à C. difficile antigènes dans le sérum et polyclonaux IgIV. Dans les présentes, nous incluons des résultats représentatifs se rapportant à une performance de dosage microarray acceptable par rapport à ELISA ainsi que le dosage de précision et reproductibilité de profils. Ce test pourrait être développé pour définir le profil des autres échantillons cliniques et établit un nouveau standard pour la recherche dans les bases moléculaires de l’IDC.

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Protocol

1. préparer une plaque de Microarray

  1. Diluer les antigènes de c. difficile avec un tampon d’impression [PBS-Tween-tréhalose (50 mM)] à la concentration optimale (qui a été prédéfinie avant d’exécuter le sérum du patient) : toxines A (200 µg/mL) et B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL) et natif de purifiée SLPs ensemble dérivé ribotypes 001, 002 et 027 (200 µg/mL).
    Remarque : La toxine B proviennent d’une toxine B exprimant la souche CCUG 20309 (90 µg/mL).
    1. Diluer les contrôles positifs, lysats de c. albicanset de l’anatoxine tétanique avec le tampon d’impression à 100 µg/mL. Enfin, diluer l’immunoglobuline humaine purifiée correspondant l’isotype d’anticorps testés en série, en commençant à 50 µg/mL à travers 10 dilutions dans le tampon d’impression pour créer une courbe d’étalonnage.
  2. Transférer 10 µL des dilutions dans le tampon d’impression dans une plaque 384 puits.
  3. Couvrir la plaque avec un joint de la plaque et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.

2. impression tableaux avec un Robot Contact

  1. Chaleur la goupille de silicium à l’aide du brûleur à gaz portatif 3 x 2 s chaque et rincez-les à l’eau claire 3 x 3 s chaque.
  2. Placer la plaque de microarray dans la cartouche de chargement de l’arrayer.
  3. Placez les diapositives aminosilanes sur le plateau de la diapositive.
    Remarque : Le bac de diapositive peut contenir 27 diapositives : trois rangées de neuf diapositives. Les lames sont disposées en orientation portrait à partir de la gauche de la rangée du bas et le reste des espaces sont recouverts de lames vierges pour s’assurer que tous les trous sur la plaque de glissement sont recouvertes.
    1. Appuyez sur OK et vérifiez que le vide a été allumé et toutes les diapositives sont sécurisés. Laissez les diapositives dans l’environnement humide pendant au moins 1 h avant de commencer l’impression.
      NOTE : Les diapositives aminosilanes sont fournis dans un sachet scellé avec déshydratant. Une fois ouvert, aucune diapositive non utilisés doit être retournés immédiatement dans le dessiccateur pour stockage jusqu'à la date d’expiration.
  4. Mettre en place le programme d’impression approprié pour imprimer des antigènes de Clostridium difficile . Lancer l’Application TAS Suite et ouvrez le fichier de paramètres d’exécution impression requis à partir du répertoire « My quadrillant Runs ». Sélectionnez fichier de Clostridium difficile pour imprimer tous les antigènes de Clostridium difficile en quatre exemplaires.
  5. Sur un double-clic sur l’icône « microarray » sur la fenêtre principale une fenêtre dotée de trois onglets apparaîtront appelé « MicroArraying des paramètres ».  Les trois onglets sont « Source », « Cible » et « Options ». L’onglet « Source » montre les détails du nombre d’échantillons utilisés dans la plaque « microarray ». L’onglet « Cible » montre les détails de comment les diapositives doivent être chargés, lorsque le tableau doit être imprimé sur la diapositive et modifier la disposition de diapositive (16 sous-tableau formats). L’onglet « Options » affiche les détails du protocole de lavage et outil pour être utilisé par exemple. laver après chaque exemple terminé. Nettoyez la tige de silicone entre les échantillons afin d’éviter toute contamination croisée entre les différents échantillons.
  6. Les options de programmation sont situées sous Options > Préférences exécuter dans la barre d’outils de TAS Application Suite. Il y a 9 onglets à travailler par le biais de cette section et que vous complète un onglet passer à la suivante en cliquant dessus. En cliquant sur le le bouton « OK » vous emmènera hors « Préférences de Run ». Dans l’onglet « Général » des préférences « Run », il y a un certain nombre de cases à cocher disponibles en vertu du présent article relatives à la façon dont l’instrument comportera lorsqu’un programme est démarré. Cochez la case « Bain premier avant le début de la course », toutes les stations de lavage trois feront l’objet d’une séquence d’amorçage court avant le début d’exécution. Cochez la case « Laver en début de course », l’outil de NIP est lavé avant la visite de la première source. Cochez « Lavage à la fin de course », l’outil de NIP est lavé après visite de la dernière source. L’utilisateur peut définir le nombre de cycles de lavage. Dans l’onglet « Climat » des préférences « Run », commencer l’humidification. Le réglage que nous utilisons sont les suivantes : commencer le taux de 55 %, exécutez taux de 55 %, humidité minimum 55 %, cible humidité 60 %. Ne commencez pas la course jusqu'à ce que l’humidité de l’objectif a été atteint, sinon les taches sera la bonne taille et la bibliothèque va s’évaporer rapidement.
  7. Dans la barre de menu de TAS, cliquez sur le bouton go vert.  Lancer l’exécution et observer régulièrement l’arrayer pendant le tirage pour être certain que tout est OK.
    Remarque : Cela permet l’analyse des 15 échantillons en parallèle sur chaque diapositive comme un sous-tableau est utilisé comme contrôle négatif. La conception des sous-tableaux est déterminée par le nombre des imprimés protéines (antigènes) et le numéro de l’imprimé biologique réplique.
    Remarque : Après l’impression de chaque échantillon, la tête se déplace vers les bains de lavage pour permettre plusieurs trempage de l’axe dans les deux bains de lavage contenant de l’eau distillée et 0,002 % Tween-20 à 1. 5 s dans chaque bain, suivie de rinçage la tige avec de l’eau ultra pure et séchage de la goupille en la station de lavage principal pour 4 s.

3. stockage des tableaux

  1. Garder les diapositives imprimées conservées une nuit à température ambiante dans un dessiccateur.
    Remarque : Les diapositives imprimées peuvent être stockés pendant une semaine.

4. tableau de palpage

  1. Placer soigneusement les diapositives imprimées dans un support de diapositive de format 16 chambres multipuits.
    Remarque : Les chambres, ayant une profondeur d’environ 7,5 mm, fournissent une surface généreuse au rapport de volume pour faciliter le mélange et étapes de lavage.
  2. Tous les réactifs laisser se réchauffer à température ambiante avant utilisation. Sauf indication contraire, effectuez toutes les opérations suivantes à la température ambiante.
  3. Ajouter 100 µL d’interpolation de 5 % d’albumine sérique bovine filtrée (BSAT ; utiliser un filtre de seringue 0,2 µm) pour chaque bloc, couvrir les diapositives et les incuber sous agitation pendant 1 h.
  4. Laver les diapositives 5 x 1 min chacun dans 120 µL de tampon phosphate salin avec Tween 20 (PBST ; 0,1 % Tween) / puits avec agitation. Ne laissez pas les diapositives dessécher.
  5. Décongeler les échantillons de sérum sur la glace pendant 20 min et diluer chaque échantillon avec un anticorps disponible dans le commerce en diluant avec fond réduisant le composant (voir Table des matières).
    1. Optimiser la dilution des échantillons de sérum selon l’immunoglobuline testé comme indiqué dans le tableau 2.
  6. Transférer 100 µL des échantillons de sérum dilué dans tous les blocs sauf un, qui sera utilisé comme témoin négatif ; à ce bloc, ajouter 100 µL d’anticorps diluant uniquement. Incuber les lames avec une agitation modérée pendant 1 h.
  7. Laver les diapositives 5 x 3 min chacun dans 120 µL de PBST (0,1 % Tween) / puits avec agitation.
  8. Ajouter 100 µL d’un anticorps anti-humain de chèvre biotinylé dilué avec le diluant d’anticorps.
    1. Optimiser la dilution de l’anticorps secondaire selon l’immunoglobuline testé comme décrit dans le tableau 2. Couvrir les diapositives et les incuber avec agitant doucement pendant 1 h.
  9. Laver les diapositives 5 x 3 min chacun dans 120 µL de PBST / puits avec agitation.
  10. Ajouter 100 µL de streptavidine Cy5 à chaque bloc dilué à 1 : 2000 à 5 % de BSA. Couvrir les lames d’aluminium pour les protéger de la lumière tout en agitant pendant 15 min avec agitation douce.
  11. Laver les diapositives 5 x 1 min chacun dans 120 µL de PBST / puits avec agitation, suivie de 2 lavages de 1 min chacun dans du PBS seulement avec agitation.
  12. Faites tourner les lames pendant 5 min à 300 g pour les faire sécher.
  13. Garder les lames dans une boîte sombre pour le transport et le stockage à température ambiante.
  14. Aller de l’avant pour analyser les tableaux immédiatement pour garantir la cohérence de signal après sondage.
    Remarque : Cependant, sondées diapositives peuvent être conservés dans l’obscurité et scannés sous une semaine à sonder.

5. les tableaux d’analyse

  1. Allumer le scanner au laser (voir Table des matières) 30 min avant de les numériser pour réchauffer le laser. Télécharger le logiciel du scanner et de connecter l’ordinateur au scanner.
  2. Placez une lame avec le visage de face imprimée vers le haut dans le scanner jusqu'à ce que le jeu lumineux devient vert.
  3. Appuyez sur le bouton paramètres et ajustez les paramètres suivants lors de la numérisation des diapositives comme suit : Scan Mode, médiane ; Acquisition, 635 Mode d’acquisition, manuel ; Gain, 20 ; Puissance, faible ; Chariot Type, diapositive sans étiquette ; Mise au point, mise au point automatique. Désactiver le défilement automatique et affectez Barcode Reading Pixel taille 10 et 35 Scan.
  4. Enregistrer les images qui en résultent comme en niveaux de gris 16 bits format TIFF image multiple. Appuyez sur le bouton Importer la grille , puis sélectionnez la liste de tableau approprié.
    NOTE : La liste de tableau décrit la taille et la position des sous-tableaux ainsi que les noms des substances imprimés associées à chaque indicateur de fonctionnalité.
    1. Aligner la grille pour les taches sur la lame.
  5. Analyser les images en appuyant sur le bouton le processus de Quantification pour mesurer l’intensité de signal de fluorescence de chaque spot et enregistrer les résultats dans un format de texte appelé GenePix résultats (GPR).
    Remarque : Le fichier GPR contient les variables localisation et identification des cibles antigène sur le tableau et l’intensité de la fluorescence médian et le contexte local qui représente la liaison de l’anticorps signalent les valeurs de chaque spot.

6. analyse de données

  1. Calculer la médiane pour les répétitions de chaque antigène après soustraction de fond à l’aide d’un logiciel d’analyse microarray gratuit appelé analyseur de phase inverse protéine tableau (RPPA), un module dans le langage statistique R CRAN36.
  2. Tracer la courbe d’étalonnage et d’interpoler les signaux de chaque antigène par rapport à la courbe d’étalonnage à l’aide de graphiques scientifiques commerciales et des logiciels de statistiques (voir Table des matières) pour calculer le taux d’anticorps immunoglobulines.

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Representative Results

La figure 1 illustre un organigramme décrivant les principales étapes dans le protocole décrit. La figure 2 montre des essais de corrélation de Spearman démontrant l’important accord entre microarray et ELISA IgG et IgA anti-toxine A et B niveaux dans le sérum de patients test. La figure 3 montre classe-anticorps IgG et IgA différentielle d’anticorps spécifiques à la toxine A et la toxine B toxine binaire (pCDTb) dans les patients fibro-kystiques sans diarrhée, de la CDI patients souffrant de diarrhée et de HC. La figure 4 illustre c.difficile antitoxine neutralisante d’anticorps dans le sérum du patient. La figure 5 illustre la réactivité immunitaire (contre les toxines de c. difficile et SLPs) et un effet neutralisant (contre les toxines de c. difficile ) d’IgIV. La figure 6 montre la réactivité immunitaire (contre les toxines de c. difficile et SLPs) et un effet neutralisant (contre les toxines de c. difficile ) du sérum du patient pré et post-IVIg administration. Le tableau 1 illustre acceptables intra - et inter-essai coefficients de variabilité des puces à l’aide de sérums à tester. Le tableau 2 illustre une liste des immunoglobulines utilisée dans cette étude avec des concentrations de protéines purifiées ainsi que les dilutions optimisées pour les sérums et les anticorps secondaires.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble des principales étapes à suivre pour le protocole de microarray. La première étape est la préparation des antigènes et des contrôles. Les dilutions de l’échantillon suivant sont transférées à une plaque 384 en préparation pour l’impression en quadruplicates sur les lames d’aminosilanes. Après séchage et blocage des lames, les baies sont incubées avec le sérum du patient. Après un autre lavage, l’immunoglobuline d’anti-humain biotinylé (Ig) de l’isotype spécifié est ajouté. Après le lavage final et les étapes de séchage, les diapositives sont analysés et les images qui en résultent traitées avec un logiciel d’analyse microarray image. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Corrélation entre microarray et ELISA résultats. Le coefficient de corrélation de Spearman a été utilisé pour évaluer le niveau de concordance entre les deux plates-formes. Lorsque l'on compare les performances de microarray avec un dosage interne immuno-enzymatique (ELISA), A. un bon coefficient de corrélation a été observé pour la toxine A (r = 0,7051 ; P < 0,0001), B. et une moyennement bonne corrélation pour la toxine B (r = 0,5809 ; P < 0,0001). Le protocole complet de ELISA a été détaillée ailleurs37. Ce chiffre a été tiré à Negm al. 1 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: réponses anticorps Isotype-spécifiques à Clostridium difficile toxines. Cette image sème les anti-toxines IgG et IgA réponses sériques (toxinotype 0, souche VPI 10463, ribotype 087 ; toxine A à 200 µg/mL, la toxine B à 100 µg/mL), la toxine B (c. difficile toxine B-production de souche CCUG 20309 ; toxine B à 90 µg/mL) et la forme de précurseurs d’a et B fragment de toxine binaire, pCDTb (200 µg/mL), chez les patients atteints de mucoviscidose (CF) sans diarrhée, patients présentant une infection à c. difficile (CDI) avec diarrhée et dans les témoins sains (HC). La dilution de sérum pour les IgG et IgA sont respectivement de 1/500 et 1/100. Les différences entre les groupes ont été évalués en utilisant le test de Kruskal-Wallis, suivi de test post-hoc de Dunn pour plusieurs réponses. Comparé avec le HC (n = 17) et les patients avec CDI symptomatique (n = 16), les patients adultes atteints de mucoviscidose (n = 16) présentaient des niveaux significativement plus élevés de sérum IgA anti-toxine A et B ; P ≤ 0,05. La même tendance a prévalu pour les IgG, sauf qu’il n’y avait aucune différence dans les niveaux de A IgG anti-toxine entre les groupes. Les emplacements de la boîte et moustaches représentent la médiane, la gamme et les quartiles. P ≤0.0001 ; P ≤0.01 ; P ≤ 0,05. Les signaux normalisés sont normalisées à la courbe standard de l’immunoglobuline. Ce chiffre a été tiré à Monaghan et al. 2 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: efficacité d’anticorps neutralisants à c. difficile dans le sérum des patients les toxines A et B. Cette figure montre les anticorps neutralisants protecteurs (NAb) réponses aux toxines de c. difficile A et B [toxinotype 0, souche VPI 10463, ribotype 087, utilisé à une dose létale 50 % (DL50)] dans le sérum (dilution 1 : 100 ; toxine A 2,5 ng/mL, la toxine B 0,5 ng/mL) de la SC , les patients fibro-kystiques sans diarrhée et les patients atteints de CDI et diarrhée. Les sérums de patients atteints de mucoviscidose ont montré beaucoup plus forte protection NAb des antitoxines réponses comparés avec les sérums de la HC (toxines A et B) et chez les patients avec CDI (toxine A). Les différences entre les groupes ont été évalués en utilisant le test de Kruskal-Wallis, suivi de test post-hoc de Dunn pour plusieurs réponses. Les emplacements de la boîte et moustaches représentent la médiane, la gamme et les quartiles. P ≤0.01 ; P ≤ 0,05. Ce chiffre a été tiré à Monaghan et al. 2 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Réactivité immunitaire et neutraliser l’effet des IgIV aux antigènes de C.difficile . A. cette image montre la réactivité des multi-isotype des anticorps spécifiques d’antigènes de c. difficile dans les préparations commerciales immunoglobulines intraveineuses (IgIV). La carte thermique illustre les niveaux des isotypes d’anticorps spécifiques (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 et IgM) dans trois préparations disponibles dans le commerce (voir Table des matières) contre des antigènes de c. difficile sept [la toxine A (200 µg /mL), la toxine B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), la toxine B (CCUG 20309 ; 90 µg/mL) et les protéines (SLPs) 001, 002 et 027 (tous les 200 µg/mL) de la couche de surface] en utilisant la technologie de microarray de protéine. Le code couleur de la carte de chaleur est la suivante : vert (faible) à l’intensité du signal (haute) rouge. Les valeurs de signal représentées sur l’échelle de couleurs pour la carte thermique sont transformées log2 des unités arbitraires de fluorescence (AFU). S’il vous plaît, Notez que l’AFU a plus récemment été remplacé par le descripteur normalisé indique2. Les isotypes IgG, IgG1 et IgG2 total a donné les réactivités de liaison plus forte contre la toxine A, toxine B, toxine binaire (pCDTb) et la toxine B (CCUG 20309). B. ces diagrammes montrent l’efficacité de neutralisation des IgIV contre du natif de c. difficile toute les toxines A et B. Ils donnent le pourcentage de l’effet protecteur de neutralisation des produits commerciaux d’IgIV contre les toxines de c. difficile A et B. Chaque parcelle représente la médiane des expériences en triple à une dilution au 1/100. Préparation des IgIV 1 présente l’effet protecteur le plus bas par rapport aux préparations d’IgIV 2 et 3, en particulier contre la toxine A. *** P ≤0.0001 ; P ≤ 0,05 (analyse de variance). Ce chiffre a été modifié par Negm al. 3 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Réactivité immunitaire et neutraliser les effets du sérum du patient aux antigènes de c. difficile . A. ce chiffre montre une comparaison des réactivités des anticorps contre les protéines de c. difficile dans les sérums des patients avant et après la perfusion de l’IGIV. La carte thermique illustre le niveau d’expression de l’isotype (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 et IgM) dans le sérum chez sept patients avant et après la perfusion d’IgIV contre sept des antigènes de c. difficile [la toxine A (200 µg/mL), la toxine B (100µg / mL), pCDTb (200 µg/mL), la toxine B (CCUG 20309 ; 90 µg/mL) et SLPs 001, 002 et 027 (tous les 200 µg/mL)] en utilisant la technologie de microarray de protéine. Le code couleur de la carte de chaleur est la suivante : vert (faible) à l’intensité du signal (haute) rouge. Les valeurs de signal représentées sur l’échelle de couleurs pour la carte thermique sont transformées log2 de l’AFU. Veuillez noter que l’AFU a plus récemment été remplacé par signaux normalisés2. Il y avait une amélioration après la perfusion de la réactivité IgG, IgG1, IgG2, IgG3 et de total à la toxine A et la toxine B pCDTb. B. cette image montre les réponses IgG à la toxine A, toxine B et toxine binaire (pCDTb), pre et post-IVIg administration. Les taux d’IgG totaux contre toutes les toxines indiquent une augmentation significative après l’administration d’IgIV (en utilisant le test de Wilcoxon signé-rang). Chaque parcelle représente la médiane des expériences en triple à 01:10 dilution. C. ces parcelles montrent l’effet de neutralisation contre native c. difficile les toxines A et B après l’administration d’IgIV. Une comparaison des activités avant et après la perfusion d’anticorps neutralisants montre un effet protecteur accru après les perfusions d’IgIV contre le natif de toxines de c. difficile A et B. Chaque parcelle représente la médiane des expériences en triple à 01:10 dilution. Une augmentation significative de l’effet protecteur contre les toxines A et B a été notée dans l’infusion de post-IVIg de sérums de patients testés (en utilisant le test de Wilcoxon signé-rang). Ce chiffre a été tiré à Negm et al. 3 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Reproductibilité Toxine A Toxine B SLP001 SLP002 SLP027 La toxine B CCUG 20309 pCDTb
Intra-série 7,70 % 6.40 % 7,40 % 5.10 % 7,60 % 7 % 3,70 %
Inter-essais 9,10 % 9,10 % 7,40 % 11,20 % 12,8 9,70 % 12,50 %

Tableau 1 : précision intra-essai et inter-essai de Microarray 1. Microarray intra - et inter-essai variabilités ont été calculées par le sérum des 7 patients. Les échantillons identiques ont été dosés sur chacun des deux glissières à deux moments indépendants. Tous les antigènes (n = 7 test et n = 2 contrôles) ont été repérés à répétitions de cinq sur chaque tableau.

Concentration de la protéine purifiée Dilution du sérum Dilution de l’anticorps secondaire
IgG 50 μg/ml 1/500 1/20000
IgG1 200 μg/ml 1/100 1/5000
IgG2 200 μg/ml 1/100 1/10000
IgG3 200 μg/ml 1/100 1/5000
IgG4 200 μg/ml 1/100 1/5000
IgA 50 μg/ml 1/100 1/5000
IgA1 200 μg/ml 1/100 1/10000
IgA2 200 μg/ml 1/100 1/5000
IgM 50 μg/ml 1/500 1/20000

Tableau 2: liste des immunoglobulines utilisée dans cette étude. L’Igs sont affichés avec les concentrations de protéine purifiée pertinentes (µg/mL) et les dilutions pour le sérum et les anticorps secondaires.

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Discussion

Dans ce protocole, nous avons montré que « microarray » est une plate-forme appropriée pour définir l’immunité humorale aux antigènes de protéines de c. difficile dans le sérum du patient (Figures 3 et 6) et les préparations commerciales d’IgIV (Figure 5). Nous avons aussi démontré que la technique de microarray effectue bien par rapport aux classique ELISA (Figure 2) et montre excellente reproductibilité, avec variabilités intra - et inter-essai s’inscrivant dans les limites acceptables de précision ( Tableau 1).

Étapes essentielles :
Un certain nombre d’étapes critiques doit être respectée lors de la construction de n’importe quelle plateforme de microarray antigène réussie. Au départ, il est extrêmement important d’exécuter des expériences QC. Dans les expériences QC, différents paramètres doivent être évaluées, telles que la sélection de la chimie de surface appropriée, blocage tampons, tampons d’impression, dilutions des échantillons sériques et l’anticorps secondaires. Ces expériences doivent être réalisées dans le but de fournir une technique fiable et validé38,39.

La sélection d’un processus d’immobilisation adapté de protéine est l’une des étapes plus importantes dans les analyses de microarray, afin d’assurer une performance de haute qualité des diapositives aminosilanes testées, comme on le voit dans cette étude. Il est crucial d’observer la morphologie tache régulière et circulaire, intensité du signal élevé et spécifique et un fond clair. Un autre facteur influant sur le rendement de microarray est le tampon d’impression, ce qui est tout aussi important de parvenir à la chimie de surface désirée afin de produire des taches homogènes et régulières sur la diapositive.

Il est important de sélectionner les paramètres appropriés pour l’impression, ce qui permettra la taille optimale et la forme d’une tache à imprimer. Par exemple, le niveau d’humidité devrait être maintenu environ 55 % lors de l’impression, car sans humidité augmente le taux d’évaporation dans la chambre de microarray et moins de taches sont imprimés.

La liaison aux protéines non spécifiques est un autre facteur influant sur le fond et les signaux spots ; par conséquent, une sélection appropriée d’un tampon de blocage pourrait réduire toute liaison non-spécifique, conduisant à l’amélioration de la sensibilité et la précision des données tableau39.

Modifications et dépannage :
Antigènes et sérums doivent être aliquotés et stockée dans petits tubes de rangement dans le congélateur jusqu'à utilisation, qui permet d’éviter les répété plusieurs cycles de gel-dégel, qui peuvent se détériorer l’intensité du signal du tableau. Afin d’améliorer les chances d’une expérience réussie, tous les réactifs doivent être préparés frais et filtrés. Nettoyage l’arrayer avant impression et vérifier que les paramètres sont requis. En outre, le support de diapositives doit être propres pour minimiser le bruit de fond.

Limites :
L’application des microarrays de protéine est actuellement entravée par l’exigence rigoureuse sur la chimie de surface dans la fabrication de microarray de protéine. Ici la grande variation dans les propriétés chimiques et physiques de molécules protéiques nécessite chimie de surface unique personnalisé-conception pour les différentes classes de molécules de protéines et anticorps40. Autres défis techniques de l’application généralisée de cette technologie incluent le besoin de coûteux équipements spécialisés et logiciels avec banc-espace alloué, mais aussi l’examen des frais d’entretien, analyse de données complexes, parent dosage de la protéine et gravement l’accès aux antigènes purifiés.

Importance de la méthode en ce qui concerne les méthodes existantes et parallèles :
Technologie des microréseaux est semblable en principe à ELISA, méso échelle découverte ou Luminex immunoessais, mais est personnalisable, peut évoluer vers le haut pour atteindre la puissance statistique, repose sur la seule microlitre quantités d’échantillons précieux et a la capacité de sérums d’écran pour plusieurs des réactivités protéiques. Il est donc particulièrement adapté pour sérothèques à grande échelle, historiques et de découverte de biomarqueurs et de dépistage.

Applications futures ou des directives de la méthode :
Futurs efforts iront vers l’optimisation de l’analyse d’autres échantillons (surnageants de cellule), utilisant l’analyse comme un outil pronostique pour stratification patiente, extérieurement validant les biomarqueurs potentiels à l’aide de grandes cohortes de manière à double-insu, et prévoir et optimiser la réponse à l’immunothérapie (mAb, vaccins). Dans le futur, la technologie des microréseaux pourrait servir en milieu hospitalier comme un outil diagnostique utile ou de suivre un plan de traitement de drogue sur une période de temps.

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Disclosures

Aucun.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par une bourse Hermes à Ola Negm et Tanya Monaghan et grâce à un financement séparé depuis le Centre de maladies digestives de Nottingham et NIHR Nottingham digestif maladies Centre de recherches biomédicales.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioRobotics MicroGrid II arrayer Digilab, Malborough, MA, USA N/A Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710. Innopsys N/A A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0 Innopsys N/A Measure signal intensities of the spots.
Silicon contact pin Parallel Synthesis Technologies SMT-P75 Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene Desiccator Thermo Scientific 41102426 To store the new and printed slides.
384-well plate Genetix X7022UN To prepare the antigens.
Plate cover Sigma Aldrich, UK CLS6570-100EA To reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slides Schott,  Germany 1064875 The slide of choice for printing the antigens.
Slide holders GraceBio Labs, USA 204862 Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . 
Candida albicans lysate NIBSC PR-BA117-S Positive control
Tetanus Toxoid  Athens Research and Technology 04/150 Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707 Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. 
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-1 Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. 
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-2 Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. 
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-3 Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. 
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-4 Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. 
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090701 Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma  Athens research and  technology   16-16-090701-1M Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma  Athens research and  technology   16-16-090701-2M Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090713 Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific Vector Labs BA-3080 Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT Southern Biotec 9052-08  Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT Southern Biotec 9060-08   Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT Southern Biotec 9210-08    Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT Southern Biotec 9190-08   Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated Vector Labs BA-3030 Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOT Southern Biotec 9130-08 Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOT Southern Biotec 9140-08   Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOT Southern Biotec 9020-08  Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filter Thermo scientific 723-2520 Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich, UK A7284 Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluent Dako, UK S3022 To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5 eBioscience SA1011 Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) Toxins Group, Public Health England NA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) Toxins Group, Public Health England NA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb University of Bath  NA Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins Dublin City University  NA
Vigam (IVIg preparation 1) Nottingham University Hospitals NHS Trust N/A
Privigen (IVIg preparation 2) Nottingham University Hospitals NHS Trust N/A
Intratect (IVIg preparation 3) Nottingham University Hospitals NHS Trust N/A

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Immunologie et Infection numéro 136 protéine microarray anticorps les immunoglobulines intraveineuses Clostridium difficile,
Une analyse de Microarray de protéine pour détermination sérologique de l’Infection à <em>Clostridium difficile</em> anticorps réponses suivantes spécifiques à l’antigène
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