Summary
I denne artikel beskrives en simpel protein microarray metode til profilering LUN immun svar til en 7-plex panel af meget renset Clostridium difficile antigener i menneskelige sera. Protokollen kan udvides til bestemmelse af specifikt antistof reaktioner i forberedelserne af polyklonale intravenøs immunglobulin.
Abstract
Vi giver en detaljeret oversigt over en roman høj overførselshastighed protein microarray analyse til bestemmelse af anti -Clostridium difficile antistof niveauer i menneskers sera og separat præparater af polyklonale intravenøs immunglobulin (IVIg). Protokollen beskriver de metodiske trin involveret i prøveforberedelse, udskrivning af arrays, analyseprocedure og dataanalyse. Derudover kunne denne protokol udvikles yderligere for at integrere forskellige kliniske prøver herunder plasma og celle kultur analysere. Vi viser, hvordan protein microarray kan bruges til at afgøre en kombination af isotype (IgG, IgA, IgM), underklasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), og stamme-specifikke antistoffer mod meget renset hele C. difficile toksiner A og B (toxinotype 0, stamme VPI 10463, ribotype 087), toksin B fra en C. difficile toksin B kun udtrykke stamme (CCUG 20309), en forløber form af et B fragment af binære toksin, pCDTb, ribotype-specifikke hele overflade lag proteiner (SLPs, 001, 002, 027), og kontrollere proteiner (stivkrampe toxoid og Candida albicans). Under eksperimentet, microarrays er aftestede med sera fra personer med C. difficile infektion (CDI), personer med cystisk fibrose (CF) uden diarré, raske kontrolpersoner (HC), og fra enkeltpersoner pre og post-IVIg behandling for den behandling af CDI, kombineret immundefekt sygdom og kronisk inflammatorisk demyeliniserende polyradiculopathy. Vi møder betydelige forskelle i toksin neutralisering efficacies og multi-isotypen specifikt antistof niveauer mellem patientgrupper, kommercielle præparater af IVIg, og sera før og følgende IVIg administration. Også, der er en markant sammenhæng mellem microarray og enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) for antitoksin IgG niveauer i serumprøver. Disse resultater tyder på, at microarray kunne blive et lovende redskab for profilering antistof svar til C.difficile antigener på vaccineret eller inficerede mennesker. Med yderligere finjustering af antigen paneler og en reduktion af produktionsomkostningerne forventer vi, at microarray teknologi kan hjælpe med at optimere og vælge de mest klinisk nyttige immunoterapi til C. difficile infektion på en patient-specifikke måde.
Introduction
Denne protokol beskriver udvikling og validering af en roman og tilpassede protein microarray analyse til påvisning og semi-kvantificering af bakteriel stamme og isotypespecifikke antistof svar til C. difficile antigener. Vi kunne bruge vores C. difficile-specifikke microarray analyse som en lovende nye værktøj til den kompositoriske bioanalyse af specifikt antistof indhold i patientens sera1,2, præparater af IVIg3, og identifikation af antistof særtræk, der korrelerer med dårlige resultater i CDI4. Vi demonstrere, hvordan biobanked serumprøver og kommercielle præparater af IVIg kan analyseres på microarray dias, så høj kvalitet reproducerbare profilering af C. difficile patogen-specifikke antistof svar i denne analyse.
Mange raske børn og voksne har påviselige serum IgG og IgA antistoffer til C. difficile toksiner A og B5,6. Disse menes at opstå efter forbigående eksponering under vorden og efter udsættelse for C. difficile i voksenalderen. Derfor polyklonale IVIg har været brugt off-label til behandling af tilbagevendende og fulminant CDI7,8,9. Men dens endelige rolle og virkningsmekanisme er fortsat uklart. Flere undersøgelser har vist, at den LUN immun svar til C. difficile toksiner spiller en rolle i sygdom præsentation og resultatet. Specifikt, viser asymptomatiske patienter en øget serum anti-toksin A IgG koncentration sammenlignet med patienter, der udvikler symptomatisk sygdommen10. En påviselig tilknytning er blevet rapporteret til median anti-toksin A IgG titers og 30-dages all-dødelighed11. Flere rapporter har også afsløret en forening med en beskyttelse mod gentagelse og antistof svar til toksin A, B og flere ikke-toksin antigener (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD og overflade lag proteiner (SLPs))12,13 , 14 , 15. disse observationer har ansporet udvikling af den første passiv immunterapi narkotika målretning C. difficile toksin B (bezlotuxumab), som er for nylig blevet godkendt af US Food and Drug Administration og det Europæiske Lægemiddelagentur Agentur for forebyggelse af tilbagevendende CDI16. Vaccinationsstrategier ved hjælp af inaktiverede toksiner eller rekombinant toksin fragmenter er også i øjeblikket under udvikling17,18,19. Disse nye terapeutiske tilgange vil utvivlsomt fremme kravet om evaluering LUN immun svar til flere antigener i store stikprøvestørrelser.
I dag, er der en bemærkelsesværdig mangel på kommercielt tilgængelige høj overførselshastighed assays i stand til samtidigt vurdere bakteriel stamme og isotypespecifikke antistof svar til C. difficile antigener. Der er et udækket behov for at udvikle sådanne assays for at lette fremtidig forskning og kliniske applikationer. Protein microarrays er en metode til at immobilisere stort antal individuelt renset proteiner som et rumligt organiseret vifte af steder på en mikroskopisk slide-baserede overflade ved hjælp af en robot system, som kan være enten en kontakt20 eller en ikke-kontakt udskrivning værktøj21. Steder kan repræsentere komplekse blandinger som cellelysater, antistoffer, væv homogeniseret, endogene eller rekombinante proteiner eller peptider, kropsvæsker eller narkotika22,23.
Protein microarray teknologi tilbyder forskellige fordele i forhold til standard in-house ELISA teknikker, som traditionelt er blevet brugt til at vurdere anti -C. difficile antistof reaktioner. Disse omfatter en øget kapacitet til at afsløre et udvalg af multi-isotypespecifikke antistoffer mod en mere omfattende panel af protein mål, reduceret volumen krav for antigener, prøver og reagenser, og en forbedret evne til at indarbejde en større antallet af tekniske replikater, foruden flere interne kvalitetskontrol (QC) foranstaltninger1. Microarrays er derfor mere følsomme, nøjagtige og reproducerbare og har et større dynamikområde. Disse faktorer gør microarrays en billigere og potentielt gunstige alternativ til ringprøver for storstilet påvisning af kendte proteiner. Imidlertid ulemper af microarray teknologi skyldes hovedsageligt store up-front udgifter i forbindelse med oprettelse af et panel af højtrenset antigener og oprette den teknologiske platform.
Protein microarrays har været flittigt brugt i de seneste to årtier som et diagnostisk og grundlæggende forskningsværktøj i kliniske applikationer. Specifikke anvendelser omfatter protein udtryk profilering, undersøgelse af enzym-substrat relationer, biomarkør screening, analyse af host-mikrobe interaktioner, og profilering antistof specificitet23,24, 25,26,27,28. Mange nye patogen protein/antigen microarrays er fastlagt, herunder malaria (Plasmodium)29, HIV-130, influenza31, alvorlig akut luftvejssyndrom (SARS)32, viral hæmoragisk feber33 , herpesvirus34, og tuberkulose35.
Denne protokol vedrører oprettelsen af en let drift C. difficile reaktive antigen microarray analyse, som muliggør præcis, præcis og specifik kvantificering af multi-isotypen og stamme-specifikke antistof svar til C. difficile antigener i sera og polyklonale IVIg. Heri, medtager vi repræsentative resultater vedrørende en acceptabel microarray analyse ydeevne i forhold til ELISA assay præcision og reproducerbarhed profiler. Denne analyse kunne udvikles yderligere for at profilere andre kliniske prøver og sætter en ny standard for forskning i den molekylære grundlag af CDI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. udarbejde en Microarray plade
- Fortynd C. difficile antigener med en udskrivning buffer [PBS-Tween-trehalose (50 mM)] i den optimale koncentration, (som var foruddefinerede før du kører de patient sera): toksin en (200 µg/mL) og toksin B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), og renset indfødte hele SLPs stammer fra ribotypes 001, 002 og 027 (200 µg/mL).
Bemærk: Toksin B blev indhentet fra et toksin B-udtrykker stamme CCUG 20309 (90 µg/mL).- Fortynd de positive kontroller, lysates af C. albicansog tetanustoksoid med udskrivning bufferen på 100 µg/mL. Endelig, fortyndes den oprenset Humant immunglobulin matchende testet antistof isotype seriefremstillede, startende fra 50 µg/mL i hele 10 fortyndinger i den udskrivning buffer til at oprette en kalibreringskurve.
- Overføre 10 µL af fortyndinger i bufferen til udskrivning til en 384-godt plade.
- Dække pladen med en plade segl og centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
2. trykning Arrays med en kontakt Robot
- Varme silicium pinkoden ved hjælp af en håndholdt gas brænder 3 x 2 s hver og skylles i rent vand 3 x 3 s.
- Sted microarray plade til lastning patron af arrayer.
- Objektglassene aminosilane på bakken dias.
Bemærk: Skub skuffen kan rumme 27 dias: tre rækker af ni dias. Diasene er arrangeret i stående papirretning starter fra den venstre side af den nederste række og resten af rum er dækket med tomme dias til at sikre, at alle huller på bakken dias er dækket.- Tryk på OK og kontrollere, at et vakuum, slået og alle dias er sikker. Forlade dias i det fugtige miljø i mindst 1 time før du starter udskrivningen.
Bemærk: Aminosilane dias leveres i en forseglet pose med tørremiddel. Når åbnet, skal ubrugt dias returneres straks til ekssikkator til opbevaring indtil udløbsdatoen.
- Tryk på OK og kontrollere, at et vakuum, slået og alle dias er sikker. Forlade dias i det fugtige miljø i mindst 1 time før du starter udskrivningen.
- Indstille programmet egnet til udskrivning til at udskrive Clostridium difficile antigener. Lancere TAS Application Suite og åbne parameterfilen kræves print køre fra mappen 'My klods løber'. Vælg Clostridium difficile fil for at udskrive alle Clostridium difficile antigener i fire eksemplarer.
- Ved at dobbeltklikke på ikonet MicroArray på hovedvinduet vises en tre-tabbed vindue kaldet 'MicroArraying parametre'. De tre faner er "Kilde," "Target" og "Indstillinger". Fanen "Kilde" viser detaljer antallet af prøver, der indgår i microarray plade. Fanen "Target" viser detaljer om, hvordan diasene der skal lastes, hvor array skal være trykt på diaset og redigere diaslayout (16 subarray formater). "Options" fanen viser detaljer om vask protokol og værktøj skal bruges fx. vask efter hvert afsluttet prøve. Ren silicium pin mellem prøver at undgå enhver krydskontaminering mellem forskellige prøver.
- De programmerings muligheder findes under Indstillinger > køre indstillinger på værktøjslinjen TAS Application Suite. Der er 9 faner til at arbejde gennem i dette afsnit og som du komplette én fane flytte til næste ved at klikke på den. At klikke på "OK" knappen vil tage dig ud af "Run indstillinger." I fanen "Generelt" i "Kør præferencer" findes der en række afkrydsningsfelter under dette afsnit vedrører hvordan instrumentet vil opføre sig, når et program startes. Afkryds boksen "Prime bad før start af run" alle tre wash stationer vil undergå en kort priming sekvens før køre. Check boksen "Vaske ved start af run", værktøjet pin vil blive vasket, før den første kilde besøg. "Vask enden af run" afkrydsningsfeltet, værktøjet pin vil blive vasket, efter den sidste kilde besøg. Brugeren kan indstille antallet af vask cyklusser. Start befugtning i fanen "Klima" i "Run-indstillinger". Den indstilling, vi bruger er som følger: starte sats 55%, køre sats 55%, Minimal fugtighed 55%, target luftfugtighed 60%. Start ikke køre, indtil målet fugtighed er nået, ellers steder vil være den forkerte størrelse og biblioteket vil hurtigt fordampe.
- Klik på den grønne gå knap i menu advokatstanden af TAS. Start Kør og periodisk observere arrayer under den oplag at være visse alt er OK.
Bemærk: Dette muliggør analysen af 15 prøver samtidig på hvert dias som et subarray er brugt som en negativ kontrol. Design af subarrays bestemmes af antallet af udskrevne proteiner (antigener) og antallet af de trykte biologiske replikater.
Bemærk: Efter udskrivning af hver prøve, hovedet bevæger sig mod vask bade til at tillade flere dypning af stiften i to wash bade indeholdende destilleret vand og 0,002% Tween 20 til 1,5 s i hvert bad, efterfulgt af skylning pin med ultra rent vand og tørring pin i de vigtigste håndvask station for 4 s.
3. oplagring af Arrays
- Hold de udskrevne dias gemt natten over ved stuetemperatur i en ekssikkator.
Bemærk: De udskrevne dias kan opbevares i op til en uge.
4. array sondering
- Omhyggeligt placere udskrevne dias i en diasholderen 16 multi godt kamre format.
Bemærk: Kamre, at have en dybde på ca. 7.5 mm, giver en generøs overflade til volumen-forholdet at lette blanding og vaske trin. - Tillad alle reagenser til varme til stuetemperatur før anvendelse. Medmindre andet er angivet, skal du udføre følgende trin ved stuetemperatur.
- Tilsæt 100 µL af filtrerede 5% bovint serumalbumin tween (BSAT; brug en 0,2 µm sprøjte filter) til hver blok, dække dias og inkuberes dem med ryster for 1 h.
- Vask dias 5 x 1 min i 120 µL af phosphat bufferet saltvand med Tween 20 (PBST; 0,1% Tween) pr. brønd med ryster. Lad ikke de dias, tørre ud.
- Tø serumprøver på isen i 20 min. og fortyndes hver prøve med en kommercielt tilgængelig antistof fortyndingsmiddel med baggrund at reducere komponent (Se Tabel af materialer).
- Optimere fortynding for serumprøver ifølge den testede immunoglobulin, som vist i tabel 2.
- Overføre 100 µL af de fortyndede serumprøver til alle blokke undtagen én, som vil blive brugt som en negativ kontrol; til denne blok, kan du kun tilføje 100 µL antistof fortyndingsmiddel. Glassene inkuberes med blid agitation for 1 h.
- Vask dias 5 x 3 min. hver i 120 µL af PBST (0,1% Tween) pr. brønd med ryster.
- Tilsæt 100 µL af en biotinylated gede-anti-humant antistof fortyndet med antistof fortyndingsmiddel.
- Optimere fortyndingen af det sekundære antistof ifølge den testede immunoglobulin, som beskrevet i tabel 2. Dække diasene og inkuberes dem med blid ryster for 1 h.
- Vask dias 5 x 3 min. hver i PBST 120 µL pr. brønd med ryster.
- Tilføje 100 µL af streptavidin Cy5 til hver blok fortyndet til 1: 2000 i 5% BSA. Dække dias med folie for at beskytte dem mod lys, mens omrøring i 15 min med blid agitation.
- Vask dias 5 x 1 min hver i 120 µL af PBST pr. brønd med rysten, efterfulgt af 2 vasker på 1 min. i PBS kun under omrystning.
- Spin dias i 5 min på 300 x g tørre dem.
- Holde dias i en mørk kasse til transport og opbevaring ved stuetemperatur.
- Gå videre til at scanne arrays straks for at sikre signal konsistens efter sondering.
Bemærk: Dog probed dias kan opbevares i mørke og scannes inden for en uge fra sondering.
5. scanning Arrays
- Tænd laserscanner (Se Tabel af materialer) 30 min før scanning for at varme op laseren. Uploade scannersoftwaren og Tilslut computeren til scanneren.
- Placere et dias med udskriftssiden opad i scanneren, indtil spille lyser konstant grøn.
- Tryk på knappen Indstillinger og justere følgende indstillinger, når du scanner dias som følger: Scan Mode, Median; Erhvervelse, 635 kun; Erhvervelse Mode, håndbog; Gevinst, 20; Magt, lav; Skub Type, ikke-navngivet dias; Fokus, autofokus. Slå automatisk rulning og sat Barcode Reading til Pixel størrelse 10 og scanne 35.
- Gemme de resulterende billeder som 16-bit gråtoneskala flere billede TIFF-format. Tryk på knappen Importer gitter og vælge den passende array liste.
Bemærk: Array liste beskriver størrelse og placering af subarrays og navnene på de trykte stoffer tilknyttet hver funktion-indikator.- Justere gitteret til steder på diaset.
- Analysere billederne ved at trykke på knappen kvantificering proces at måle fluorescens signal intensiteter af hvert spot og gemme resultaterne i tekstformat kaldet GenePix resultater (GPR).
Bemærk: Filen GPR indeholder lokalisering og identifikation variablerne af antigen mål på matrixen og også median fluorescens-intensiteten og den lokale baggrund, der repræsenterer antistof bindende signal værdier af hvert spot.
6. dataanalyse
- Beregne medianværdien for replikater af hver antigen efter baggrund subtraktion ved hjælp af en gratis microarray analyse software kaldet reverse fase protein array (RPPA) analyzer, et modul i R statistiske sprog på CRAN36.
- Plot standardkurven og interpolere signaler hver antigen i forhold til immunoglobulin standardkurven ved hjælp af kommercielle videnskabelige graftegning og statistik software (Se Tabel af materialer) til at beregne antistof niveauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer et rutediagram, der beskriver de vigtigste trin i den beskrevne protokol. Figur 2 viser Spearman korrelation tests viser betydelig aftale mellem microarray og ELISA for IgG og IgA anti-toksin A og B niveauer i patient testsera. Figur 3 viser differential IgG og IgA antistof-klasse specifikt antistof svar til toksin A, toksin B og binære toksin (pCDTb) i patienter med CF uden diarré, CDI patienter med diarré, og HC. Figur 4 viser C. difficile antitoksin neutraliserende antistof svar i de patient sera. Figur 5 viser immun reaktivitet (mod C. difficile toksiner og SLPs) og neutraliserende virkning (mod C. difficile toksiner) af IVIg. Figur 6 viser immun reaktivitet (mod C. difficile toksiner og SLPs) og neutraliserende virkning (mod C. difficile toksiner) patient sera pre og post-IVIg administration. Tabel 1 viser acceptable intra og Inter-Diesel assay koefficienter af variabiliteten af microarray ved hjælp af testsera. Tabel 2 viser en liste over immunoglobuliner anvendes i denne undersøgelse med relevante koncentrationer af renset proteiner samt optimeret fortyndinger for sera og sekundære antistoffer.
Figur 1 : Oversigt over vigtige trin involveret i microarray protokol. Det første skridt er forberedelsen af antigener og kontrol. Efterfølgende prøve fortyndinger er overført til en 384-plade i beredskab til udskrivning i quadruplicates på aminosilane dias. Efter tørring og blokering af dias, arrays inkuberes med patient sera. Efter yderligere vask, føjes biotinylated-anti-humant immunglobulin (Ig) af den angivne isotype. Efter den sidste vask og tørring trin, dias scannes og de deraf følgende billeder behandles med et microarray billede analyse software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Korrelation mellem microarray og ELISA resultater. Spearman korrelationskoefficienten blev brugt til at vurdere omfanget af aftalen mellem de to platforme. Når man sammenligner microarray ydeevne med en in-house enzymmaerket assay (ELISA), A. en god korrelationskoefficienten blev observeret for toksin A (r = 0.7051; P < 0,0001), B. og en moderat god korrelation til toksin B (r = 0.5809; P < 0,0001). Fuld ELISA protokollen har været udførligt beskrevet andetsteds37. Dette tal er blevet genoptrykt fra Negm et al. 1 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: isotypespecifikke antistof svar til Clostridium difficile toksiner. Dette billede søer serum anti-toksin IgG og IgA svar (toxinotype 0, stamme VPI 10463, ribotype 087; toksin A på 200 µg/mL, toksin B på 100 µg/mL), toksin B (C. difficile toksin B-producerende stamme CCUG 20309, toksin B på 90 µg/mL) og forløber form af en B fragment af binære toksin, pCDTb (200 µg/mL), hos patienter med cystisk fibrose (CF) uden diarré, patienter med C. difficile infektion (CDI) med diarré, og raske kontrolpersoner (HC). Serumfortynding for IgG og IgA er 1: 500 og 1: 100, henholdsvis. Forskelle mellem grupperne blev vurderet ved hjælp af Kruskal-Wallis test, efterfulgt af Dunn's post hoc test for flere svar. Sammenlignet med HC (n = 17) og patienter med symptomatisk CDI (n = 16), de voksne CF patienter (n = 16) udstillet betydeligt højere niveauer af serum IgA anti-toksin A og B niveauer; P ≤0.05. Det samme mønster sejrede for IgG, bortset fra at der var ingen forskel i anti-toksin A IgG niveauer mellem grupperne. Boks og bakkenbart parceller repræsenterer median, rækkevidde og kvartiler. P ≤0.0001; P ≤0.01; P ≤0.05. De standardiserede signaler er normaliseret til immunoglobulin standardkurven. Dette tal er blevet genoptrykt fra Monaghan et al. 2 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Neutralizing antistof efficacies til C. difficile toksiner A og B i patienternes sera. Denne figur viser det beskyttende neutraliserende antistof (NAb) svar til C. difficile toksiner A og B [toxinotype 0, stamme VPI 10463, ribotype 087, anvendes en 50% dødelig dosis (LD50)] i seraene (1: 100 fortynding; toksin A 2,5 ng/mL, toksin B 0,5 ng/mL) fra HC , patienter med CF uden diarré, og patienter med CDI med diarré. Sera fra CF patienter udstillet betydeligt stærkere beskyttende anti-toksin NAb svar sammenlignet med sera fra HC (toksiner A og B) og patienter med CDI (toxin A). Forskelle mellem grupperne blev vurderet ved hjælp af Kruskal-Wallis test, efterfulgt af Dunn's post hoc test for flere svar. Boks og bakkenbart parceller repræsenterer median, rækkevidde og kvartiler. P ≤0.01; P ≤0.05. Dette tal er blevet genoptrykt fra Monaghan et al. 2 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Immun reaktivitet og neutralisere effekten af IVIg til C.difficile antigener. A. dette billede viser reaktiviteten af multi-isotypen specifikke antistoffer til C. difficile antigener i kommercielle intravenøs immunglobulin (IVIg) præparater. Varmen kortet illustrerer niveauer af specifikt antistof isotypes (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 og IgM) i tre kommercielt tilgængelige præparater (Se Tabel af materialer) mod syv C. difficile antigener [toksin en (200 µg /mL), toksin B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), toksin B (CCUG 20309; 90 µg/mL), og overfladen lag proteiner (SLPs) 001, 002 og 027 (alle 200 µg/mL)] ved hjælp af protein microarray teknologi. Farvekode på zonekort er som følger: grøn (lav) til rød (høj) signal intensitet. Signal værdier repræsenteret på farveskalaen for varmen kortet er log2 forvandlet fra tilfældige fluorescens enheder (AFU). Venligst signaler Bemærk at AFU for nylig blevet afløst af descriptor standardiseret2. Den samlede IgG, IgG1 og IgG2 isotypes gav de højeste bindende reactivities mod toksin A, toksin B, binære toksin (pCDTb), og toksin B (CCUG 20309). B. disse parceller Vis IVIg neutralisering effekt mod de indfødte C. difficile hele toksiner A og B. De giver procentdelen af den beskyttende neutralisering effekt af IVIg produkter mod C. difficile toksiner A og B. Hver plot repræsenterer medianværdien af tredobbelt eksperimenter på 1: 100 fortynding. IVIg forberedelse 1 udstiller den laveste beskyttende virkning i forhold til IVIg præparater 2 og 3, især mod toksin A. *** P ≤0.0001; P ≤0.05 (envejs variansanalyse). Dette tal er blevet ændret fra Negm et al. 3 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Immun reaktivitet og neutralisere effekten af patientens sera til C. difficile antigener. A. denne figur viser en sammenligning af antistof reactivities mod C. difficile proteiner i patienternes sera før og efter IVIg infusion. Varmen kortet illustrerer udtryk niveau af isotypes (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 og IgM) i serumprøver syv patienter før og efter IVIg infusion mod syv C. difficile antigener [toksin en (200 µg/mL), toksin B (100 µg / mL), pCDTb (200 µg/mL), toksin B (CCUG 20309; 90 µg/mL), og SLPs 001, 002 og 027 (alle 200 µg/mL)] ved hjælp af protein microarray teknologi. Farvekode på zonekort er som følger: grøn (lav) til rød (høj) signal intensitet. Signal værdier repræsenteret på farveskalaen for varmekort er log2 omdannet fra AFU. Bemærk venligst at AFU for nylig blevet afløst af standardiserede signaler2. Der var en efter infusion forbedring af de samlede IgG, IgG1, IgG2 og IgG3 reactivities toxin A, toksin B og pCDTb. B. dette billede viser IgG svar til toksin A, toksin B, og binære toksin (pCDTb), pre og post-IVIg administration. De total IgG niveauer mod alle giftstoffer viser en betydelig stigning efter IVIg administration (ved hjælp af Wilcoxon underskrevet-rank test). Hver plot repræsenterer medianværdien af tredobbelt eksperimenter på 1:10 fortynding. C. disse parceller Vis neutralisering effekt mod indfødte C. difficile toksiner A og B efter IVIg administration. En sammenligning af før og efter infusion neutraliserende antistof aktiviteter viser en forstærket beskyttende effekt efter IVIg infusioner mod indfødt C. difficile toksiner A og B. Hver plot repræsenterer medianværdien af tredobbelt eksperimenter på 1:10 fortynding. En betydelig stigning i den beskyttende effekt mod toksiner A og B blev bemærket i patienternes sera testet post-IVIg infusion (ved hjælp af Wilcoxon underskrevet-rank test). Dette tal er blevet genoptrykt fra Negm mfl. 3 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reproducerbarhed | Toksin A | Toksin B | SLP001 | SLP002 | SLP027 | Toksin B CCUG 20309 | pCDTb |
| Intra-assay | 7,70% | 6.40% | 7.40% | 5.10% | 7,60% | 7% | 3,70% |
| Inter assay | 9.10% | 9.10% | 7.40% | 11.20% | 12.8 | 9.70% | 12,50% |
Tabel 1: Microarray intra-assay og Inter assay præcision 1. Microarray intra og Inter-Diesel assay variabilitet blev beregnet ved hjælp af sera af 7 patienter. Identiske prøver blev analyseret på hver af to dias på to uafhængige tidspunkter. Alle antigener (n = 7 test og n = 2 Kontroller) blev spottet i replikater af fem på hver matrix.
| Oprenset proteinkoncentration | Serumfortynding | Sekundær antistof fortynding | |
| IgG | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
| IgG1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1: 5000 |
| IgG2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgG3 | 200 μg/ml | 1/100 | 1: 5000 |
| IgG4 | 200 μg/ml | 1/100 | 1: 5000 |
| IgA | 50 μg/ml | 1/100 | 1: 5000 |
| IgA1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgA2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1: 5000 |
| IgM | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
Tabel 2: liste over immunoglobuliner anvendes i denne undersøgelse. Igs er vist med de relevante oprenset protein koncentrationen (µg/mL) og fortyndinger for serum og sekundære antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, har vi vist, at microarray er en velegnet platform til at definere humorale immunrespons til C. difficile protein antigener i patient sera (tallene 3 og 6) og kommercielle præparater af IVIg (figur 5). Vi har også bevist at microarray teknik udfører godt i forhold til konventionelle ELISA (figur 2) og viser fremragende reproducerbarhed, med intra og Inter-Diesel assay variabilitet falder inden for acceptable grænser for præcision ( Tabel 1).
Kritiske trin:
En række kritiske trin skal følges, når bygningen enhver vellykket antigen microarray platform. I første omgang, er det ekstremt vigtigt at køre QC eksperimenter. I eksperimenter, QC, bør forskellige parametre evalueres, såsom udvælgelse af passende overfladekemi, udskrivning buffere, blokerende buffere, fortyndinger af serumprøver og de sekundære antistoffer. Disse forsøg skal udføres med formålet at levere et godt validerede og pålidelige teknik38,39.
Udvælgelsen af en passende protein immobilisering proces er en af de vigtigste skridt i microarray analyser, at sikre en høj kvalitet af de testede aminosilane dias, som set i denne undersøgelse. Det er afgørende at overholde regelmæssig og cirkulære plet morfologi, høj og specifikke signal intensitet og en klar baggrund. En anden faktor, der påvirker microarray ydeevne er den udskrivning buffer, som er lige så vigtigt at opnå den ønskede overflade kemi til at producere ensartet og regelmæssige steder på diaset.
Det er vigtigt at vælge de korrekte indstillinger for udskrivning, da dette vil give den optimale størrelse og form af et sted der skal udskrives. For eksempel, opretholdes luftfugtigheden omkring 55% under udskrivningen, fordi uden fugt fordampning i microarray kammer er nyttiggørelsesniveauet og færre steder er trykt.
Ikke-specifikke protein binding er en yderligere faktor, der påvirker baggrund og spot signaler; Derfor, passende udvalg af en blokerende buffer kunne reducere enhver ikke-specifik binding, fører til forbedret følsomhed og nøjagtighed af array data39.
Ændringer og fejlfinding:
Antigener og serumprøver skal være aliquoted og lagret i mindre opbevaring rør i fryseren indtil brug, som hjælper med at undgå gentages flere fryse-tø cykler, som kan forringe signalstyrken for matrixen. For at øge chancerne for en vellykket eksperiment, alle reagenser skal være forberedt friske og filtreres. Rengøring af arrayer før udskrivning og kontrollere indstillingerne er påkrævet. Derudover skal lysbilledholderen holdes rene at minimere baggrundsstøj.
Begrænsninger:
Anvendelsen af protein microarrays hæmmes i øjeblikket af de strenge krav på overfladen kemi i protein microarray fabrikation. Her nødvendiggør den store variation i de kemiske og fysiske egenskaber af proteinmolekyler custom-design unikke overfladekemi for forskellige klasser af protein og antistof molekyler40. Andre tekniske udfordringer udbredt gennemførelse af sådanne teknologier omfatter behovet for dyre specialiseret udstyr og software med tildelte bænk-rum, samt hensyntagen til vedligeholdelsesgebyrer, komplekse dataanalyse, relative protein kvantificering, og kritisk adgang til oprensede antigener.
Betydningen af metode med hensyn til eksisterende/alternative metoder:
Microarray teknologi svarer i princippet til ELISA, Meso skala opdagelse eller Luminex immunassays, men kan tilpasses, kan skaleres til at opnå statistiske effekt, afhængig af kun microliter mængder af ædle prøver og har evnen til at skærmen sera for flere protein reactivities. Det er derfor specielt velegnet til store, historiske serum banker og biomarkør opdagelse og screening.
Fremtidige ansøgninger eller retninger af metode:
Fremtidige bestræbelser vil være rettet mod optimering assay for andre prøver (celle analysere), bruge analysen som en prognostiske redskab for tålmodige stratificeringsniveau, eksternt validering potentielle biomarkører ved hjælp af store kohorter i en dobbelt-blind mode, og forudsige og optimere svar på immunterapi (mAb, vacciner). Microarray teknologi kan i fremtiden bruges på et hospital som en nyttig diagnostisk redskab eller til at overvåge et lægemiddel behandlingsplan over en periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af en Hermes Fellowship Ola Negm og Tanya Monaghan og gennem særskilte midler fra Nottingham fordøjelsessystemet sygdomme centrum og NIHR Nottingham fordøjelsessystemet sygdomme biomedicinsk forskning centrum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobotics MicroGrid II arrayer | Digilab, Malborough, MA, USA | N/A | Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides. |
| Scanner InnoScan 710. | Innopsys | N/A | A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction. |
| MAPIX software version 7.2.0 | Innopsys | N/A | Measure signal intensities of the spots. |
| Silicon contact pin | Parallel Synthesis Technologies | SMT-P75 | Print the samples onto the slides. |
| Thermo Scientific Nalgene Desiccator | Thermo Scientific | 41102426 | To store the new and printed slides. |
| 384-well plate | Genetix | X7022UN | To prepare the antigens. |
| Plate cover | Sigma Aldrich, UK | CLS6570-100EA | To reduce evaporation of the samples. |
| Aminosilane slides | Schott, Germany | 1064875 | The slide of choice for printing the antigens. |
| Slide holders | GraceBio Labs, USA | 204862 | Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . |
| Candida albicans lysate | NIBSC | PR-BA117-S | Positive control |
| Tetanus Toxoid | Athens Research and Technology | 04/150 | Positive control |
| Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707 | Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-1 | Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-2 | Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-3 | Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-4 | Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. |
| Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701 | Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-1M | Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-2M | Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma. |
| Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090713 | Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma. |
| Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific | Vector Labs | BA-3080 | Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9052-08 | Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT | Southern Biotec | 9060-08 | Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9210-08 | Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT | Southern Biotec | 9190-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated | Vector Labs | BA-3030 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA1-BIOT | Southern Biotec | 9130-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA2-BIOT | Southern Biotec | 9140-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgM-BIOT | Southern Biotec | 9020-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| 0.2 mm syringe filter | Thermo scientific | 723-2520 | Filter the 5% BSA. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, UK | A7284 | Use 5% BSA for blocking the slides. |
| Antibody diluent | Dako, UK | S3022 | To dilute the serum and the secondary antibody. |
| Streptavidin Cy5 | eBioscience | SA1011 | Detection of the immune reaction. |
| Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb | University of Bath | NA | Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70) |
| Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins | Dublin City University | NA | |
| Vigam (IVIg preparation 1) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Privigen (IVIg preparation 2) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Intratect (IVIg preparation 3) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A |
References
- Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
- Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
- Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
- Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, Suppl. 2 31 (2017).
- Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
- Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
- Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
- Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
- Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
- Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
- Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
- Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
- Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
- Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
- Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
- Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
- Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21 (2013).
- Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
- Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
- Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
- Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
- Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
- Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529 (2011).
- Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
- Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580 (2015).
- Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842 (2013).
- Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349 (2015).
- Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
- Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452 (2013).
- Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
- Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).
- Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton. (2007).
