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Immunology and Infection

क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल संक्रमण के बाद प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के सीरम वैज्ञानिक निर्धारण के लिए एक प्रोटीन Microarray परख

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57399
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3
1Breast Surgery Group, Division of Medical Sciences and Graduate Entry Medicine, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham, 2Medical Microbiology and Immunology Department, Faculty of Medicine, Mansoura University, 3Nottingham Digestive Diseases Centre and NIHR Nottingham Digestive Diseases Biomedical Research Centre, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham

Summary

यह आलेख वर्णन करता है कि मानव सीरा में अत्यधिक शुद्ध क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल प्रतिजनों के एक 7-plex पैनल के लिए विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की रूपरेखा के लिए एक सरल प्रोटीन microarray विधि । प्रोटोकॉल polyclonal नसों में immunoglobulin की तैयारी में विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के निर्धारण के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

Abstract

हम एंटी के निर्धारण के लिए एक उपंयास उच्च प्रवाह प्रोटीन microarray परख का एक विस्तृत सिंहावलोकन प्रदान-क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल एंटीबॉडी स्तर मानव सीरा में और polyclonal नसों में immunoglobulin (IVIg) की अलग तैयारी में । प्रोटोकॉल methodological नमूना तैयारी में शामिल कदम, arrays, परख प्रक्रिया के मुद्रण, और डेटा विश्लेषण का वर्णन करता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल और प्लाज्मा और सेल संस्कृति supernatants सहित विविध नैदानिक नमूनों को शामिल करने के लिए विकसित किया जा सकता है । हम बताएंगे कि कैसे प्रोटीन microarray isotype का एक संयोजन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (आईजीजी, IgA, आईजीएम), उपवर्ग (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), और तनाव विशिष्ट एंटीबॉडी को अत्यधिक शुद्ध पूरे ग. डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों a और B (toxinotype 0, तनाव VPI १०४६३, ribotype ०८७), विष b से एक C. डिफीसाइल विष-b-केवल व्यक्त तनाव (CCUG २०३०९), बाइनरी विष का एक बी टुकड़ा का प्रणेता रूप, pCDTb, ribotype-विशिष्ट साबुत सतह परत प्रोटीन (SLPs; 001, 002, 027), और नियंत्रण प्रोटीन (टिटनेस टोक्शहॉइड और Candida albicans) । प्रयोग के दौरान, microarrays डिफीसाइल संक्रमण (CDI) के साथ व्यक्तियों से सीरा के साथ जांच कर रहे हैं, दस्त के बिना सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) के साथ व्यक्तियों, स्वस्थ नियंत्रण (कोर्ट), और व्यक्तियों से पूर्व और के बाद IVIg चिकित्सा के लिए CDI के उपचार, संयुक्त इम्यूनो विकार, और जीर्ण भड़काऊ demyelinating polyradiculopathy । हम रोगी समूहों के बीच विष बेअसर efficacies और बहु isotype विशिष्ट एंटीबॉडी स्तर में महत्वपूर्ण मतभेद, IVIg की वाणिज्यिक तैयारी, और सीरा से पहले और निंनलिखित IVIg प्रशासन मुठभेड़ । इसके अलावा, सीरम नमूनों में आंतीटोक्षिण आईजीजी स्तरों के लिए microarray और एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) के बीच एक महत्वपूर्ण संबंध है । इन परिणामों का सुझाव है कि microarray टीका या संक्रमित मनुष्यों में C. डिफीसाइल एंटीजन को एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं की रूपरेखा के लिए एक आशाजनक उपकरण बन सकता है । प्रतिजन पैनलों और उत्पादन लागत में कमी के आगे शोधन के साथ, हम आशा करते है कि microarray प्रौद्योगिकी अनुकूलन में मदद कर सकते है और एक रोगी विशेष तरीके से सी डिफीसाइल संक्रमण के लिए सबसे नैदानिक उपयोगी immunotherapies का चयन करें ।

Introduction

इस प्रोटोकॉल का पता लगाने और अर्द्ध ठहराव बैक्टीरियल तनाव और isotype-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के लिए सी डिफीसाइल एंटीजन के लिए एक उपंयास और अनुकूलित प्रोटीन microarray परख के विकास और सत्यापन का वर्णन करता है । हम सफलतापूर्वक रोगी सीरा1,2, IVIg3की तैयारी में विशिष्ट एंटीबॉडी सामग्री के संयोजनीय विश्लेषण के लिए एक होनहार नए उपकरण के रूप में हमारे सी डिफीसाइलविशेष microarray परख का उपयोग करें, और CDI4में गरीब परिणामों के साथ सहसंबंधी एंटीबॉडी विशिष्टताओं की पहचान । हम प्रदर्शन कैसे IVIg के सीरम नमूने और वाणिज्यिक तैयारियों microarray स्लाइड पर विश्लेषण किया जा सकता है, उच्च गुणवत्ता reproducible सी डिफीसाइल रोगज़नक़ के इस परख में विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं की अनुमति ।

कई स्वस्थ बच्चों और वयस्कों सी. डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों को एक और बी5,6को detectable सीरम आईजीजी और IgA एंटीबॉडी है । ये बचपन के दौरान क्षणिक जोखिम निंनलिखित उठता है और वयस्कता में सी डिफीसाइल के लिए जोखिम के बाद लगा रहे हैं । इस कारण से, polyclonal IVIg बंद इस्तेमाल किया गया है लेबल दोनों आवर्तक और अचानक CDI7,8,9के इलाज के लिए । हालांकि, अपनी निश्चित भूमिका और कार्रवाई की विधा अस्पष्ट बनी हुई है । कई अध्ययनों से पता चला है कि विनोदी प्रतिरक्षा सी. डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों को प्रतिक्रिया रोग प्रस्तुति और परिणाम में एक भूमिका निभाता है । विशेष रूप से, स्पर्शोन्मुख रोगियों एक बढ़ी सीरम विरोधी विष एक आईजीजी एकाग्रता रोगियों जो रोगसूचक रोग10का विकास की तुलना में दिखाते हैं । एक प्रत्यक्ष संघ औसत विरोधी विष एक आईजीजी titers और 30 दिन सभी कारण मृत्यु11के लिए सूचित किया गया है । कई रिपोर्टों को भी एक पुनरावृत्ति और एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के खिलाफ एक संरक्षण के साथ एक सहयोग से पता चला है विष ए, बी, और कई गैर विष एंटीजन (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD, और सतह परत प्रोटीन (SLPs))12,13 , 14 , 15. इन टिप्पणियों ने प्रथम निष्क्रिय immunotherapy औषध लक्ष्यीकरण सी. डिफीसाइल विष बी (bezlotuxumab) के विकास को प्रेरित है, जिसे हाल ही में अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन और यूरोपीयन औषधियों द्वारा अनुमोदित किया गया है आवर्तन CDI की रोकथाम के लिए एजेंसी16. निष्क्रिय विषाक्त पदार्थों या रिकॉमबिनेंट विष टुकड़े का उपयोग टीकाकरण रणनीतियों भी वर्तमान में विकास के तहत कर रहे हैं17,18,19. इन नए चिकित्सीय दृष्टिकोण निस्संदेह बड़े नमूना आकार में एकाधिक प्रतिजनों के लिए विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए आवश्यकता को प्रोत्साहित करेंगे ।

आज, वहां व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उच्च प्रवाह एक साथ बैक्टीरियल तनाव और isotype-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का आकलन करने में सक्षम परख की एक उल्लेखनीय कमी सी डिफीसाइल एंटीजन है । वहां एक unmet के लिए ऐसी परख विकसित करने के लिए भविष्य के अनुसंधान के प्रयासों और नैदानिक अनुप्रयोगों की सुविधा की जरूरत है । प्रोटीन microarrays एक विधि एक रोबोटिक प्रणाली का उपयोग करके एक सूक्ष्म स्लाइड पर धब्बे की एक विशेष रूप से संगठित सरणी के रूप में व्यक्तिगत रूप से शुद्ध प्रोटीन की बड़ी संख्या को स्थिर करने के लिए कर रहे हैं, जो या तो एक संपर्क20 या एक गैर संपर्क किया जा सकता है मुद्रण उपकरण21. स्पॉट सेल lysates, एंटीबॉडी, ऊतक homogenates, अंतर्जात या रिकॉमबिनेंट प्रोटीन या पेप्टाइड्स, शरीर के तरल पदार्थ या22,23दवाओं के रूप में जटिल मिश्रण का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं ।

प्रोटीन microarray प्रौद्योगिकी मानक में घर एलिसा तकनीक है, जो परंपरागत रूप से विरोधीसी. डिफीसाइल एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का आकलन किया गया है पर अलग लाभ प्रदान करता है । ये प्रोटीन लक्ष्य की एक अधिक व्यापक पैनल के खिलाफ बहु isotype-विशिष्ट एंटीबॉडी की एक सीमा का पता लगाने के लिए एक वृद्धि की क्षमता शामिल, प्रतिजनों, नमूनों के लिए कम मात्रा आवश्यकताओं, और रिएजेंट, और एक बढ़ाया करने के लिए एक बड़ा शामिल करने की क्षमता तकनीकी प्रतिकृतियों की संख्या, एकाधिक आंतरिक गुणवत्ता नियंत्रण (QC) उपायों1के अलावा । Microarrays इसलिए अधिक संवेदनशील हैं, सही है, और reproducible और एक अधिक गतिशील रेंज है । इन कारकों microarrays ज्ञात प्रोटीन के बड़े पैमाने पर पता लगाने के लिए एलिसा के लिए एक सस्ता और संभावित अनुकूल विकल्प बनाते हैं । हालांकि, microarray प्रौद्योगिकी के नुकसान मुख्य रूप से बड़ी ऊपर-सामने अत्यधिक शुद्ध एंटीजन के एक पैनल की स्थापना और तकनीकी मंच की स्थापना के साथ जुड़े लागत से परिणाम है ।

प्रोटीन microarrays बड़े पैमाने पर नैदानिक अनुप्रयोगों में एक नैदानिक और बुनियादी अनुसंधान उपकरण के रूप में पिछले दो दशकों में इस्तेमाल किया गया है । विशिष्ट अनुप्रयोगों प्रोटीन अभिव्यक्ति profiling, एंजाइम-सब्सट्रेट संबंधों, के अध्ययन में शामिल है मार्कर स्क्रीनिंग, मेजबान के विश्लेषण-सूक्ष्म जीव बातचीत, और रूपरेखा एंटीबॉडी विशिष्टता23,24, 25,26,27,28. कई नए रोगज़नक़ प्रोटीन/प्रतिजन microarrays स्थापित किया गया है, सहित मलेरिया (प्लाज्मोडियम)29, एचआईवी-130, इंफ्लूएंजा31, गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम (सार्स)३२, वायरल रक्तस्रावी बुखार३३ , herpesviruses३४, और तपेदिक३५।

वर्तमान प्रोटोकॉल एक आसान संचालन सी डिफीसाइल प्रतिक्रियाशील प्रतिजन microarray परख की स्थापना से संबंधित है, जो सटीक, सटीक, और सी के लिए बहु isotype और तनाव विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के विशिष्ट ठहराव सक्षम बनाता है । डिफीसाइल एंटीजन में सीरा और polyclonal IVIg है । साथ ही, हम प्रतिनिधि एक स्वीकार्य microarray परख प्रदर्शन से संबंधित परिणाम जब एलिसा की तुलना में शामिल है और साथ ही परख परिशुद्धता और reproducibility प्रोफाइल । इस परख आगे प्रोफ़ाइल अंय नैदानिक नमूनों को विकसित किया जा सकता है और CDI के आणविक आधार में अनुसंधान के लिए एक नया मानक सेट ।

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Protocol

1. एक Microarray प्लेट तैयार करना

  1. एक मुद्रण बफर के साथ C. डिफीसाइल एंटीजन पतला [पंजाब के बीच-trehalose (५० mM)] इष्टतम एकाग्रता पर (जो रोगी सीरा चलाने से पहले पूर्वनिर्धारित था): विष a (२०० µ g/ml) और विष B (१०० µ g/ml), pCDTb (२०० µ g/मिलि), और शुद्ध देशी ribotypes 001, 002, और 027 (२०० µ g/एमएल) से व्युत्पंन पूरे SLPs ।
    नोट: विष बी एक विष बी व्यक्त तनाव CCUG २०३०९ (९० µ g/एमएल) से प्राप्त किया गया था ।
    1. धनात्मक नियंत्रणों, C. albicansके lysates, और १०० µ g/एमएल पर मुद्रण बफ़र के साथ टिटनेस टोक्शहॉइड को पतला करें । अंत में, एक अंशांकन वक्र बनाने के लिए मुद्रण बफर में 10 कमजोर पड़ने के पार ५० µ जी/एमएल पर शुरू, परीक्षण एंटीबॉडी isotype प्रश्नपत्र मिलान शुद्ध मानव immunoglobulin पतला ।
  2. एक ३८४-अच्छी तरह से थाली में मुद्रण बफर में कमजोर पड़ने के 10 µ एल स्थानांतरण ।
  3. प्लेट सील और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक के साथ कवर ।

2. एक संपर्क रोबोट के साथ मुद्रण arrays

  1. सिलिकॉन हाथ का उपयोग-गैस बर्नर 3x 2 एक और साफ पानी 3x 3 एस प्रत्येक में कुल्ला के प्रयोग किया जाता है ।
  2. सरणी के लोडिंग कारतूस में microarray प्लेट रखें ।
  3. स्लाइड ट्रे पर aminosilane स्लाइड्स रखें ।
    नोट: स्लाइड ट्रे 27 स्लाइड: नौ स्लाइड की तीन पंक्तियों को होल्ड कर सकते हैं । स्लाइडों को निचली पंक्ति के बाईं ओर से प्रारंभ करके पोर्ट्रेट ओरिएंटेशन में व्यवस्थित किया जाता है और शेष रिक्तियों को रिक्त स्लाइड्स के साथ कवर किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि स्लाइड्स ट्रे पर सभी छिद्रों को कवर किया गया है ।
    1. ठीक दबाएं और जांचें कि एक वैक्यूम चालू किया गया है और सभी स्लाइड सुरक्षित हैं । आर्द्र वातावरण में स्लाइड् स को मुद्रण प्रारंभ करने से पहले कम से 1 h तक छोड़ें.
      नोट: aminosilane स्लाइड जलशुष्कक के साथ एक सील थैली में प्रदान की जाती हैं । एक बार खोला, किसी भी अप्रयुक्त स्लाइड तुरंत समय सीमा समाप्ति तिथि तक भंडारण के लिए desiccator को लौटा दिया जाना चाहिए ।
  4. क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल एंटीजन मुद्रित करने के लिए उपयुक्त मुद्रण कार्यक्रम सेट करें । स्क एप्लिकेशन सुइट को लॉंच करें और ' माय Gridding रन ' निर्देशिका से आवश्यक प्रिंट रन पैरामीटर फ़ाइल खोलें । quadruplicate में सभी क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल प्रतिजनों मुद्रण के लिए क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल फ़ाइल का चयन करें ।
  5. पर डबल MicroArray आइकन पर मुख्य विंडो एक तीन tabbed खिड़की पर क्लिक करके दिखाई देगा ' MicroArraying पैरामीटर ' कहा जाता है ।  तीन टैब्स हैं "स्रोत," "लक्ष्य," और "विकल्प." "स्रोत" टैब microarray प्लेट में इस्तेमाल नमूनों की संख्या विवरण दिखाता है । "लक्ष्य" टैब दिखाता है कि स्लाइड्स कैसे लोड की जा रही हैं, जहां सरणी स्लाइड पर मुद्रित की जानी चाहिए और स्लाइड लेआउट (16 उपसरणी स्वरूप) संपादित करने की जानकारी है । "विकल्प" टैब वॉश प्रोटोकॉल और उपकरण के विवरण के उदाहरणके लिए इस्तेमाल किया जा दिखाता है । हर पूरा नमूना के बाद धो लें । विभिन्न नमूनों के बीच किसी भी पार संक्रमण से बचने के लिए नमूनों के बीच सिलिकॉन पिन साफ.
  6. प्रोग्रामिंग विकल्प विकल्प के अंतर्गत स्थित हैं > स्क आवेदन सुइट टूलबार पर प्राथमिकताएं चलाएं । इस अनुभाग में के माध्यम से काम करने के लिए 9 टैब्स हैं और आप उस पर क्लिक करके अगले करने के लिए एक टैब चाल को पूरा करने के रूप में. "OK" बटन पर क्लिक करने से आपको "Run प्राथमिकताएं" से बाहर ले जाना होगा । "प्राथमिकताएं चलाएं" के "सामांय" टैब में, इस अनुभाग के अंतर्गत उपलब्ध चेक बॉक्स के एक नंबर है कि कैसे लिखत व्यवहार करेगा जब कोई प्रोग्राम प्रारंभ किया गया है । "भागो की शुरुआत से पहले प्रधानमंत्री स्नान" बॉक्स की जांच करें, सभी तीन धो स्टेशनों रन शुरुआत करने से पहले एक छोटी कण्ठ अनुक्रम से गुजरना होगा । "भागो के शुरू में धो" बॉक्स की जांच करें, पिन उपकरण पहले स्रोत यात्रा से पहले धोया जाएगा । "भागो के अंत में धो" बॉक्स की जांच करें, पिन उपकरण पिछले स्रोत यात्रा के बाद धोया जाएगा । उपयोगकर्ता धोने चक्र की संख्या निर्धारित कर सकते हैं । "भागो वरीयताओं" के "जलवायु" टैब में, humidification शुरू करते हैं । हम सेटिंग का उपयोग निंनानुसार हैं: प्रारंभ दर ५५%, रन रेट ५५%, न्यूनतम आर्द्रता ५५%, लक्ष्य आर्द्रता ६०%. जब तक लक्ष्य आर्द्रता नहीं पहुंच गई तब तक भागना शुरू न करें अन्यथा धब्बे गलत आकार के हो जाएंगे और पुस्तकालय तेजी से वाष्पित हो जाएगा ।
  7. स्क के मेन्यू बार में ग्रीन गो बटन पर क्लिक करें ।  रन प्रारंभ करें और आवधिक रूप से प्रिंट चलाने के दौरान सरणी का निरीक्षण करने के लिए कुछ सब कुछ ठीक है ।
    नोट: यह विश्लेषण में प्रत्येक स्लाइड पर समानांतर में 15 नमूने का एक उपसरणी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है के रूप में सक्षम करता है । उपसरणी के डिजाइन मुद्रित प्रोटीन की संख्या (एंटीजन) और मुद्रित जैविक प्रतिकृति की संख्या से निर्धारित होता है ।
    नोट: प्रत्येक नमूना मुद्रण के बाद, सिर धोने स्नान की ओर ले जाता है दो आसुत जल और ०.००२% 20 के बीच प्रत्येक स्नान में १.५ एस के लिए धोने स्नान में पिन की सूई, अल्ट्रा शुद्ध पानी के साथ पिन धोने के बाद और पिन सुखाने में कई 4 एस के लिए मुख्य वॉश स्टेशन ।

3. arrays का भंडारण

  1. मुद्रित स्लाइड desiccator में कमरे के तापमान पर रातोंरात संग्रहीत रखें ।
    नोट: मुद्रित स्लाइड्स को एक सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है ।

4. सरणी की जांच

  1. ध्यान से 16 बहु-well मंडलों प्रारूप के एक स्लाइड धारक में मुद्रित स्लाइड जगह ।
    नोट: कक्षों, लगभग ७.५ mm की गहराई होने, मिश्रण और धुलाई चरणों की सुविधा के लिए मात्रा अनुपात के लिए एक उदार सतह प्रदान करते हैं ।
  2. सभी एजेंट का उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को गर्म करने की अनुमति दें । अंयथा निर्दिष्ट नहीं है, तो कक्ष के तापमान पर निंन चरणों का पालन ।
  3. फ़िल्टर किए गए 5% की १०० µ l जोड़ें गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के बीच (BSAT; एक ०.२ µm सिरिंज फिल्टर का उपयोग करें) प्रत्येक ब्लॉक करने के लिए, स्लाइड कवर, और उन्हें 1 ज के लिए झटकों के साथ गर्मी.
  4. स्लाइडें 5x 1 मिन प्रत्येक के बीच 20 (PBST; ०.१% के बीच) के साथ अच्छी तरह से मिलाते के साथ फॉस्फेट बफर खारा के १२० µ एल धो लो । स्लाइड को सूखने न दें ।
  5. पिघल 20 मिनट के लिए बर्फ पर सीरम नमूने और पृष्ठभूमि को कम करने के घटक के साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी मंदक के साथ प्रत्येक नमूने को पतला ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    1. परीक्षण immunoglobulin के अनुसार सीरम नमूनों के कमजोर पड़ने का अनुकूलन के रूप में तालिका 2में दिखाया गया है ।
  6. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा, जो एक को छोड़कर सभी ब्लॉकों के लिए पतला सीरम नमूनों के १०० µ एल स्थानांतरण; इस खंड को जोड़ने के लिए, एंटीबॉडी मंदक के १०० µ l को ही जोड़ें । 1 एच के लिए कोमल आंदोलन के साथ स्लाइड की मशीन ।
  7. स्लाइड 5x 3 मिन PBST (०.१% के बीच) के १२० µ एल में प्रत्येक अच्छी तरह से झटकों के साथ धो लो ।
  8. जोड़ें एक biotinylated बकरी विरोधी मानव एंटीबॉडी एंटीबॉडी मंदक के साथ पतला के १०० µ एल ।
    1. तालिका 2में वर्णित के रूप में परीक्षण immunoglobulin के अनुसार माध्यमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने का अनुकूलन । स्लाइड कवर और उंहें 1 एच के लिए कोमल मिलाते के साथ मशीन ।
  9. स्लाइड को धो 5x 3 मिन PBST के १२० µ एल में प्रत्येक अच्छी तरह से मिलाते के साथ प्रति ।
  10. 5% BSA में 1:2000 पर पतला प्रत्येक ब्लॉक करने के लिए streptavidin Cy5 के १०० µ एल जोड़ें । उंहें प्रकाश से बचाने के लिए पंनी के साथ स्लाइड कवर 15 कोमल आंदोलन के साथ मिनट के लिए मिलाते whilst ।
  11. स्लाइडें 5x 1 मिन PBST के १२० µ एल में प्रत्येक अच्छी तरह से मिलाते के साथ धो, 1 मिन के 2 बहाकर केवल मिलाते के साथ पंजाब में प्रत्येक के बाद ।
  12. उंहें शुष्क करने के लिए ३०० x g पर 5 मिनट के लिए स्लाइड स्पिन ।
  13. स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर ट्रांसपोर्ट और स्टोरेज के लिए डार्क बॉक्स में रखें ।
  14. तुरंत जांच के बाद संकेत निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए arrays स्कैन आगे बढ़ें ।
    नोट: हालांकि, जांच की गई स्लाइड को अंधेरे में संग्रहित किया जा सकता है और एक सप्ताह के भीतर स्कैन कर सकते हैं ।

5. arrays स्कैनिंग

  1. लेजर स्कैनर पर स्विच ( सामग्री की तालिकादेखें) 30 लेजर को गर्म स्कैनिंग से पहले मिनट । स्कैनर सॉफ़्टवेयर अपलोड करें और कंप्यूटर स्कैनर से कनेक्ट करें ।
  2. मुद्रित पक्ष के साथ एक स्लाइड प्लेस ऊपर स्कैनर में चेहरा जब तक खेलने के प्रकाश ठोस हरी बदल जाता है ।
  3. सेटिंग्स बटन दबाएँ और निम्नानुसार स्लाइड्स स्कैन करते समय निम्न सेटिंग्स समायोजित करें: स्कैन मोड, माध्य; अधिग्रहण, ६३५ केवल; अधिग्रहण मोड, मैनुअल; लाभ, 20; बिजली, कम; स्लाइड प्रकार, अनलेबल्ड स्लाइड; फोकस, ऑटो फोकस । बारी स्वत: स्क्रॉल बंद और पिक्सेल आकार 10 और स्कैन ३५ के लिए बारकोड पढ़ने सेट करें ।
  4. परिणामी छवियों को 16-बिट ग्रेस्केल एकाधिक छवि TIFF स्वरूप के रूप में सहेजें । ग्रिड आयात बटन दबाएँ और उपयुक्त सरणी सूची का चयन करें ।
    नोट: सरणी सूची उप-सरणी के आकार और स्थिति और प्रत्येक सुविधा-संकेतक के साथ संबद्ध मुद्रित पदार्थों के नाम का वर्णन करती है.
    1. ग्रिड को स्लाइड पर धब्बों में संरेखित करें ।
  5. प्रत्येक स्थान के प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता को मापने और GenePix परिणाम (GPR) नामक एक पाठ प्रारूप में परिणाम को बचाने के लिए ठहराव प्रक्रिया बटन दबाकर छवियों का विश्लेषण.
    नोट: GPR फ़ाइल स्थानीयकरण और सरणी पर प्रतिजन लक्ष्यों की पहचान चर और भी औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता और स्थानीय पृष्ठभूमि है कि प्रत्येक स्थान के एंटीबॉडी बाध्यकारी संकेत मूल्यों का प्रतिनिधित्व होता है ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. एक मुक्त microarray विश्लेषण सॉफ्टवेयर रिवर्स चरण प्रोटीन ऐरे (RPPA) विश्लेषक, CRAN३६पर आर सांख्यिकीय भाषा के भीतर एक मॉड्यूल बुलाया का उपयोग कर पृष्ठभूमि घटाव के बाद प्रत्येक प्रतिजन की प्रतिकृति के लिए औसत की गणना ।
  2. मानक वक्र भूखंड और लगाना immunoglobulin मानक वक्र वाणिज्यिक वैज्ञानिक रेखांकन और सांख्यिकी सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए प्रत्येक प्रतिजन के संकेत ( सामग्री की तालिकादेखें) एंटीबॉडी स्तर की गणना करने के लिए ।

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Representative Results

चित्र 1 वर्णित प्रोटोकॉल में प्रमुख चरणों का वर्णन करने वाला फ़्लोचार्ट दिखाता है । चित्रा 2 स्पीमरन सहसंबंध परीक्षण से पता चलता है microarray और एलिसा के बीच आईजीजी और IgA विरोधी विष ए और बी स्तर के लिए रोगी परीक्षण सीरा में महत्वपूर्ण समझौते का प्रदर्शन । चित्रा 3 अंतर आईजीजी और IgA एंटीबॉडी-वर्ग विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को विष एक, विष बी, और द्विआधारी विष (pCDTb) CF के साथ दस्त के बिना रोगियों में, दस्त के साथ CDI रोगियों से पता चलता है, और HC में । चित्रा 4 से पता चलता है C. डिफीसाइल आंतीटोक्षिण रोगी सीरा में एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को बेअसर । चित्रा 5 ( सी. डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों और SLPs के खिलाफ) प्रतिरक्षा जेट से पता चलता है और IVIg के ( c. डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों के खिलाफ) प्रभाव बेअसर. चित्रा 6 ( सी. डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों और SLPs के खिलाफ) प्रतिरक्षा जेट से पता चलता है और रोगी सीरा पूर्व और बाद IVIg प्रशासन के ( सी. डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों के खिलाफ) प्रभाव बेअसर । तालिका 1 परीक्षण सीरा का उपयोग करके microarray की परिवर्तनशीलता के स्वीकार्य अंतर और अंतर-परख गुणांक दिखाता है । 2 तालिका शुद्ध प्रोटीन के प्रासंगिक सांद्रता के साथ ही सीरा और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित कमजोर पड़ने के साथ इस अध्ययन में इस्तेमाल किया इम्युनोग्लोबुलिन की एक सूची दिखाता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : microarray प्रोटोकॉल में शामिल प्रमुख चरणों का सामांय अवलोकन । पहला कदम प्रतिजनों और नियंत्रण की तैयारी है । बाद के नमूने कमजोर पड़ने aminosilane स्लाइड पर quadruplicates में छपाई के लिए तैयारी में एक ३८४-प्लेट को हस्तांतरित कर रहे हैं । सुखाने और स्लाइड के अवरुद्ध के बाद, arrays रोगी सीरा के साथ मशीन हैं । आगे धुलाई के बाद विनिर्दिष्ट isotype के biotinylated एंटी ह्यूमन immunoglobulin (आइजी) को जोड़ा जाता है । अंतिम धुलाई और सुखाने चरणों के बाद, स्लाइड स्कैन की जाती है और परिणामी छवियां एक microarray छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ संसाधित की जाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : microarray और एलिसा परिणाम के बीच सहसंबंध । स्पीमरन सहसंबंध गुणांक का उपयोग दो प्लेटफ़ॉर्म के बीच अनुबंध के स्तर का आकलन करने के लिए किया गया था । जब एक में घर एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा), एकके साथ microarray प्रदर्शन की तुलना । विष a के लिए एक अच्छा सहसंबंध गुणांक मनाया गया (r = ०.७०५१; P < 0.0001), B. और विष बी के लिए एक मामूली अच्छा संबंध (r = ०.५८०९; P < 0.0001) । पूर्ण एलिसा प्रोटोकॉल कहीं विस्तृत किया गया है३७। इस आंकड़े को Negm एट अल से रिप्रिंट किया गया है । 1 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों को Isotype-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं । इस छवि बोता सीरम विरोधी विष आईजीजी और IgA प्रतिक्रियाओं (toxinotype 0, छलनी VPI १०४६३, ribotype ०८७; विष A पर २०० µ g/मब, विष b पर १०० µ g/मब), विष ख (ग. डिफीसाइल विष b-उत्पादक तनाव CCUG २०३०९; विष b at ९० µ g/मब) और अ b के प्रणेता रूप बाइनरी विष के अंश, pCDTb (२०० µ g/एमएल), सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) के साथ रोगियों में दस्त के बिना, सी. डिफीसाइल संक्रमण के साथ रोगियों (CDI) दस्त के साथ, और स्वस्थ नियंत्रण में (कोर्ट). आईजीजी और IgA के लिए सीरम कमजोर पड़ने क्रमशः 1:500 और 1:100 हैं । समूहों के बीच मतभेद Kruskal-वालिस परीक्षण का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया, एकाधिक प्रतिक्रियाओं के लिए डन के पोस्ट हॉक परीक्षण के बाद । एचसी (एन = 17) और रोगसूचक CDI (n = 16) के साथ रोगियों के साथ तुलना में, वयस्क CF रोगियों (n = 16) सीरम IgA विरोधी विष ए और बी के स्तर के काफी उच्च स्तर का प्रदर्शन; P ≤ ०.०५. एक ही पैटर्न आईजीजी के लिए प्रचलित है, सिवाय इसके कि वहां विरोधी समूहों के बीच एक आईजीजी स्तर विष में कोई अंतर नहीं था । बॉक्स और मूंछ भूखंड औसत, सीमा, और quartiles प्रतिनिधित्व करते हैं । P ≤ ०.०००१; * * P ≤ ०.०१; * P ≤ ०.०५. मानकीकृत संकेतों immunoglobulin मानक वक्र को सामान्यीकृत कर रहे हैं । इस आंकड़े को मोनाघन एट अल से रिप्रिंट किया गया है । 2 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: एंटीबॉडी efficacies को निष्क्रिय कर C. डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों ए और मरीजों के सीरा में बी । यह आंकड़ा सी के लिए सुरक्षात्मक बेअसर एंटीबॉडी (नब) प्रतिक्रियाओं से पता चलता है । डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों ए और बी [toxinotype 0, तनाव VPI १०४६३, ribotype ०८७, एक ५०% घातक खुराक (LD50) में इस्तेमाल किया] सीरा में (1:100 कमजोर पड़ने; विष एक २.५ एनजी/एमएल, विष बी ०.५ एनजी/ , दस्त के बिना CF के साथ रोगियों, और दस्त के साथ CDI के साथ रोगियों. CF रोगियों से सीरा ने एचसी (विषाक्त पदार्थों ए और बी) से सीरा के साथ तुलना में काफी मजबूत सुरक्षात्मक विरोधी विष को पकड़ने प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया और CDI (विष एक) के साथ रोगियों से । समूहों के बीच मतभेद Kruskal-वालिस परीक्षण का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया, एकाधिक प्रतिक्रियाओं के लिए डन के पोस्ट हॉक परीक्षण के बाद । बॉक्स और मूंछ भूखंड औसत, सीमा, और quartiles प्रतिनिधित्व करते हैं । * * P ≤ ०.०१; * P ≤ ०.०५. इस आंकड़े को मोनाघन एट अल से रिप्रिंट किया गया है । 2 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : प्रतिरक्षा जेट और IVIg के सी डिफीसाइल एंटीजन को बेअसर प्रभाव । A. यह छवि बहु-isotype विशिष्ट एंटीबॉडी की जेट को वाणिज्यिक नसों में immunoglobulin (IVIg) की तैयारी में सी डिफीसाइल एंटीजन से पता चलता है । हीट मैप तीन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तैयारियों में विशिष्ट एंटीबॉडी isotypes (आईजीजी, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2, और आईजीएम) के स्तर को दिखाता है ( सामग्री की तालिकादेखें) सात C. डिफीसाइल एंटीजन [विष A (२०० µ g /mL), विष b (१०० µ g/ml), pCDTb (२०० µ g/एमएल), विष b (CCUG २०३०९; ९० µ g/ml), और सतह परत प्रोटीन्स (SLPs) 001, 002, और 027 (सभी २०० µ g/ml)] प्रोटीन microarray तकनीक का प्रयोग । गर्मी के नक्शे के रंग कोड इस प्रकार है: ग्रीन (कम) लाल (उच्च) के लिए संकेत तीव्रता । गर्मी के नक्शे के लिए रंग पैमाने पर प्रतिनिधित्व संकेत मान मनमाने ढंग से प्रतिदीप्ति इकाइयों (आफु) से log2-बदल रहे हैं । कृपया ध्यान दें कि आफु और हाल ही में डिस्क्रिप्टर मानकीकृत संकेतों2द्वारा स्थान दिया गया है । कुल आईजीजी, IgG1, और IgG2 isotypes विष एक, विष बी, द्विआधारी विष (pCDTb), और विष बी (CCUG २०३०९) के खिलाफ उच्चतम बाध्यकारी पुनर्क्रियाएं दिया । b. ये भूखंड देशी सी. डिफीसाइल पूरे विषाक्त पदार्थों ए और बी के खिलाफ IVIg बेअसर प्रभावकारिता दिखाते हैं. वे सी डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों ए और बी के खिलाफ वाणिज्यिक IVIg उत्पादों की सुरक्षात्मक बेअसर प्रभाव का प्रतिशत दे । प्रत्येक भूखंड 1:100 कमजोर पड़ने पर तपसिल प्रयोगों के औसत का प्रतिनिधित्व करता है । IVIg तैयारी 1 IVIg की तैयारी 2 और 3, विशेष रूप से विष ए के खिलाफ की तुलना में सबसे कम सुरक्षात्मक प्रभाव प्रदर्श * * * * P ≤ ०.०००१; * पी ≤ ०.०५ (एक तरह से विचरण का विश्लेषण) । यह आंकड़ा Negm एट अल से संशोधित किया गया है । 3 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : प्रतिरक्षा जेट और सी. डिफीसाइल एंटीजन को रोगी के सीरा के प्रभाव को बेअसर । ए यह आंकड़ा IVIg अर्क से पहले और बाद में रोगियों के सीरा में सी डिफीसाइल प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी पुनर्क्रियाएं की तुलना दिखाता है । हीट मैप isotypes (आईजीजी, के अभिव्यक्ति स्तर को दिखाता है, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2, और आईजीएम) के सात रोगियों में सीरम नमूनों में पहले और बाद में सात सी के खिलाफ IVIg इन्फ्यूश़न डिफीसाइल एंटीजन [विष ए (२०० µ g/एमएल), विष बी (१०० µ g/ एमएल), pCDTb (२०० µ g/एमएल), विष बी (CCUG २०३०९; ९० µ g/एमएल), और SLPs 001, 002, और 027 (सभी २०० µ जी/एमएल)] प्रोटीन microarray प्रौद्योगिकी का उपयोग कर । गर्मी के नक्शे के रंग कोड इस प्रकार है: ग्रीन (कम) लाल (उच्च) के लिए संकेत तीव्रता । संकेत मूल्यों गर्मी के नक्शे के लिए रंग पैमाने पर प्रतिनिधित्व log2-आफु से बदल रहे हैं । कृपया ध्यान दें कि आफु अधिक हाल ही में मानकीकृत संकेतों द्वारा स्थान दिया गया है2. वहां कुल आईजीजी, IgG1, IgG2, और विष एक, विष बी, और pCDTb को IgG3 reकलाप के बाद अर्क वृद्धि हुई थी । b. इस छवि को विष एक, विष बी, और द्विआधारी विष (pCDTb), पूर्व और बाद IVIg प्रशासन को आईजीजी प्रतिक्रियाओं से पता चलता है । सभी विषाक्त पदार्थों के खिलाफ कुल आईजीजी स्तर IVIg प्रशासन के बाद एक महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाने (Wilcoxon का उपयोग कर हस्ताक्षर किए रैंक परीक्षण) । प्रत्येक भूखंड 1:10 कमजोर पड़ने पर तपसिल प्रयोगों के औसत का प्रतिनिधित्व करता है । c. ये भूखंड देशी ग. डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों ए और बी म् IVIg प्रशासन के खिलाफ बेअसर प्रभाव दिखाते हैं. पूर्व की तुलना और एंटीबॉडी गतिविधियों को निष्क्रिय करने के बाद अर्क-देशी सी डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों ए और बी के खिलाफ IVIg सुई लेनी के बाद एक बढ़ाया सुरक्षात्मक प्रभाव से पता चलता है प्रत्येक भूखंड 1:10 कमजोर पड़ने पर तपसिल प्रयोगों के औसत का प्रतिनिधित्व करता है । विषाक्त पदार्थों के खिलाफ सुरक्षात्मक प्रभाव में एक उल्लेखनीय वृद्धि और बी रोगी सीरा में उल्लेख किया गया था पोस्ट-IVIg अर्क का परीक्षण (Wilcoxon पर हस्ताक्षर किए रैंक परीक्षण) का उपयोग कर । इस आंकड़े को Negm एट अलसे रिप्रिंट किया गया है । 3 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Reproducibility विष घालून विष B SLP001 SLP002 SLP027 विष B CCUG २०३०९ pCDTबी
इंट्रा-परख ७.७०% ६.४०% ७.४०% ५.१०% ७.६०% 7 ३.७०%
इंटर-परख ९.१०% ९.१०% ७.४०% ११.२०% १२.८ ९.७०% १२.५०%

तालिका 1: Microarray अंतर परख और अंतर परख परिशुद्धता 1. Microarray इंट्रो-और इंटर-परख variabilities की गणना 7 रोगियों के सीरा के प्रयोग से की गई । प्रत्येक दो स्लाइड पर दो स्वतंत्र समय बिंदुओं पर समान नमूनों की परख की गई । सभी एंटीजन (n = 7 परीक्षण और n = 2 नियंत्रण) प्रत्येक सरणी पर पांच की प्रतिकृति में देखा गया था ।

शुद्ध प्रोटीन एकाग्रता सीरम कमजोर पड़ने माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने
आईजीजी ५० μg/एमएल 1/500 1/20000
IgG1 २०० μg/एमएल 1/100 1/5000
IgG2 २०० μg/एमएल 1/100 1/10000
IgG3 २०० μg/एमएल 1/100 1/5000
IgG4 २०० μg/एमएल 1/100 1/5000
Iga ५० μg/एमएल 1/100 1/5000
IgA1 २०० μg/एमएल 1/100 1/10000
IgA2 २०० μg/एमएल 1/100 1/5000
आईजीएम ५० μg/एमएल 1/500 1/20000

तालिका 2: इस अध्ययन में प्रयुक्त इम्युनोग्लोबुलिन की सूची । Igs प्रासंगिक शुद्ध प्रोटीन सांद्रता (µ जी/एमएल) और सीरम और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए कमजोर पड़ने के साथ दिखाया जाता है ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हमने दिखाया है कि microarray रोगी सीरा में सी. डिफीसाइल प्रोटीन एंटीजन को विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को परिभाषित करने के लिए एक उपयुक्त मंच है (आंकड़े 3 और 6) और IVIg की वाणिज्यिक तैयारियां (चित्रा 5) । हम यह भी दिखा दिया है कि microarray तकनीक अच्छा प्रदर्शन जब पारंपरिक एलिसा (चित्रा 2) की तुलना में और उत्कृष्ट reproducibility से पता चलता है, इंट्रा और अंतर के साथ परख variabilities परिशुद्धता की स्वीकार्य सीमा के भीतर गिरने ( तालिका 1) ।

महत्वपूर्ण कदम:
किसी भी सफल antigen microarray प्लेटफ़ॉर्म का निर्माण करते समय महत्वपूर्ण चरणों का एक नंबर का पालन किया जाना चाहिए । प्रारंभ में, यह QC प्रयोगों को चलाने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है । QC प्रयोगों में, विभिन्न मापदंडों का मूल्यांकन किया जाना चाहिए, जैसे कि उपयुक्त सतह रसायन का चयन, प्रिंटिंग बफ़र्स, बफ़र्स अवरुद्ध, सीरम नमूनों के कमजोर पड़ने और माध्यमिक एंटीबॉडी. इन प्रयोगों एक अच्छी तरह से मान्य और विश्वसनीय तकनीक३८,३९वितरित करने के उद्देश्य के साथ किया जाना चाहिए.

एक उपयुक्त प्रोटीन स्थिरीकरण प्रक्रिया का चयन microarray विश्लेषण में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है, परीक्षण aminosilane स्लाइड के एक उच्च गुणवत्ता के प्रदर्शन को सुनिश्चित करने के लिए, के रूप में इस अध्ययन में देखा । यह नियमित और परिपत्र स्थान आकृति विज्ञान, उच्च और विशिष्ट संकेत तीव्रता, और एक स्पष्ट पृष्ठभूमि का निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है । microarray प्रदर्शन को प्रभावित करने वाला एक अन्य कारक प्रिंटिंग बफर है, जो स्लाइड पर वर्दी और नियमित स्थानों का उत्पादन करने के लिए वांछित सतह रसायन को प्राप्त करने के लिए समान रूप से महत्वपूर्ण है ।

यह मुद्रण के लिए सही सेटिंग्स का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में इस इष्टतम आकार और एक स्थान के आकार मुद्रित किया जा करने की अनुमति देगा । उदाहरण के लिए, आर्द्रता स्तर छपाई के दौरान ५५% के आसपास बनाए रखा जाना चाहिए, क्योंकि नमी के बिना microarray चैंबर में वाष्पीकरण की दर बढ़ जाती है और कम स्थानों मुद्रित कर रहे हैं ।

गैर विशिष्ट प्रोटीन बाध्यकारी एक अतिरिक्त पृष्ठभूमि और स्पॉट संकेतों को प्रभावित कारक है; इसलिए, एक ब्लॉकिंग बफ़र का उपयुक्त चयन किसी भी गैर-विशिष्ट बाइंडिंग में सुधार संवेदनशीलता और सरणी डेटा३९की शुद्धता के लिए अग्रणी को कम कर सका ।

संशोधन और समस्या निवारण:
एंटीजन और सीरम के नमूने aliquoted और फ्रीजर में छोटे भंडारण ट्यूबों में संग्रहीत किया जाना चाहिए जब तक उपयोग करते हैं, जो सरणी के संकेत शक्ति खराब कर सकते हैं दोहराया एकाधिक फ्रीज-गल चक्र, से बचने में मदद करता है. एक सफल प्रयोग की संभावनाओं को बढ़ाने के लिए, सभी रिएजेंटों को नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए और फ़िल्टर किया जाना चाहिए । मुद्रण और सेटिंग्स की जाँच करने से पहले सरणी की सफाई आवश्यक हैं । इसके अलावा, स्लाइड धारक को पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए साफ रखा जाना चाहिए ।

सीमाओं:
प्रोटीन microarrays के आवेदन वर्तमान में प्रोटीन microarray निर्माण में सतह रसायन विज्ञान पर कड़े मांग से बाधा है । यहां प्रोटीन अणुओं के रासायनिक और भौतिक गुणों में महान भिंनता आवश्यक कस्टम-प्रोटीन और एंटीबॉडी अणुओं४०के विभिंन वर्गों के लिए अद्वितीय सतह रसायन डिजाइन । अंय तकनीकी ऐसी प्रौद्योगिकी के व्यापक कार्यांवयन का सामना करना पड़ चुनौतियां महंगी विशेष उपकरण और आवंटित बेंच-अंतरिक्ष के साथ सॉफ्टवेयर, साथ ही रखरखाव शुल्क, जटिल डेटा विश्लेषण, रिश्तेदार के विचार के लिए की आवश्यकता शामिल प्रोटीन ठहराव, और गंभीर रूप से शुद्ध एंटीजन तक पहुंच ।

मौजूदा/वैकल्पिक तरीकों के संबंध में विधि का महत्व:
Microarray प्रौद्योगिकी के सिद्धांत में एलिसा, मेसो पैमाने पर खोज, या Luminex immunoassays के समान है, लेकिन अनुकूलन योग्य है, तक पहुंचा जा सकता है सांख्यिकीय शक्ति को प्राप्त करने, कीमती नमूनों की केवल microliter मात्रा पर निर्भर करता है, और करने की क्षमता है सीरा स्क्रीन कई प्रोटीन reएक्टिविटीज के लिए । इसलिए यह विशेष रूप से बड़े पैमाने पर, ऐतिहासिक सीरम बैंकों और एक अगोचर खोज और स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है ।

भविष्य अनुप्रयोगों या विधि के निर्देश:
भविष्य के प्रयासों के अंय नमूनों (सेल supernatants) के लिए परख के अनुकूलन की दिशा में निर्देशित किया जाएगा, रोगी स्तरीकरण के लिए एक शकुन उपकरण के रूप में परख का उपयोग, बाह्य संभावित एक डबल अंधा फैशन में बड़े साथियों का उपयोग कर मार्क्स मांय, और भविष्यवाणी और immunotherapy (मॉब, टीके) के लिए प्रतिक्रिया का अनुकूलन । भविष्य में, microarray प्रौद्योगिकी एक उपयोगी नैदानिक उपकरण के रूप में एक अस्पताल की स्थापना में या समय की अवधि में एक दवा उपचार योजना की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

कोई.

Acknowledgments

इस अनुसंधान के लिए एक हेमीज़ फैलोशिप द्वारा ओला Negm और तान्या मोनाघन और नॉटिंघम पाचन रोग केंद्र और NIHR नॉटिंघम पाचन रोगों जैव चिकित्सा अनुसंधान केंद्र से अलग धन के माध्यम से समर्थन किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioRobotics MicroGrid II arrayer Digilab, Malborough, MA, USA N/A Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710. Innopsys N/A A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0 Innopsys N/A Measure signal intensities of the spots.
Silicon contact pin Parallel Synthesis Technologies SMT-P75 Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene Desiccator Thermo Scientific 41102426 To store the new and printed slides.
384-well plate Genetix X7022UN To prepare the antigens.
Plate cover Sigma Aldrich, UK CLS6570-100EA To reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slides Schott,  Germany 1064875 The slide of choice for printing the antigens.
Slide holders GraceBio Labs, USA 204862 Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . 
Candida albicans lysate NIBSC PR-BA117-S Positive control
Tetanus Toxoid  Athens Research and Technology 04/150 Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707 Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. 
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-1 Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. 
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-2 Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. 
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-3 Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. 
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090707-4 Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. 
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090701 Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma  Athens research and  technology   16-16-090701-1M Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma  Athens research and  technology   16-16-090701-2M Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma  Athens research and  technology   16-16-090713 Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific Vector Labs BA-3080 Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT Southern Biotec 9052-08  Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT Southern Biotec 9060-08   Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT Southern Biotec 9210-08    Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT Southern Biotec 9190-08   Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated Vector Labs BA-3030 Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOT Southern Biotec 9130-08 Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOT Southern Biotec 9140-08   Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOT Southern Biotec 9020-08  Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filter Thermo scientific 723-2520 Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich, UK A7284 Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluent Dako, UK S3022 To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5 eBioscience SA1011 Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) Toxins Group, Public Health England NA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) Toxins Group, Public Health England NA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb University of Bath  NA Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins Dublin City University  NA
Vigam (IVIg preparation 1) Nottingham University Hospitals NHS Trust N/A
Privigen (IVIg preparation 2) Nottingham University Hospitals NHS Trust N/A
Intratect (IVIg preparation 3) Nottingham University Hospitals NHS Trust N/A

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३६ प्रोटीन microarray एंटीबॉडी क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल नसों में immunoglobulin
<em>क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल</em> संक्रमण के बाद प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के सीरम वैज्ञानिक निर्धारण के लिए एक प्रोटीन Microarray परख
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Negm, O. H., Hamed, M., Monaghan, T. M. A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection. J. Vis. Exp. (136), e57399, doi:10.3791/57399 (2018).

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