Profunda dérmica injeção como um modelo de Candida albicans de infecção da pele para análise histológica

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo que permite a análise histológica e molecular de amostras de pele após injeção intradérmica de Candida albicans . Esse protocolo mantém a integridade estrutural da pele e permite a localização do tecido-residente ou recém recrutadas células do sistema imunológico, bem como a distribuição do patógeno.

Resumo

A pele é um órgão extremamente estendido do corpo e, devido a esta grande superfície, é continuamente exposto a microorganismos. Danos de pele podem facilmente levar a infecções na derme, que por sua vez, pode, resultar na disseminação de patógenos para a corrente sanguínea. Compreender como o sistema imunológico combate infecções na fase inicial e como o host pode eliminar os patógenos, é um passo importante para definir a base para futuras intervenções terapêuticas. Aqui descrevemos um modelo de infecção por Candida albicans que pode visualizar os processos que ocorrem durante uma infecção, incluindo quando o patógeno já passou a barreira epitelial, bem como a resposta imune provocada pela de c. albicans invasão. Usamos este modelo de infecção para realizar análises histológicas que mostram as células imunitárias que se infiltrar a pele, bem como a presença e a localização do patógeno. As amostras coletadas após a infecção pode ser processada para extração de RNA.

Introdução

O corpo humano é coberto com um número extremamente elevado de microorganismos. A superfície da pele é o habitat de quase 1 milhão de bactérias por centímetro quadrado¹. Este número, no entanto, não reflete a completa variedade de microorganismos que coloniza a pele. Além de bactérias, o corpo humano é colonizado por muitas espécies de fungos, incluindo c. albicans, que é capaz de sobreviver tanto as mucosas e a pele de nível².

Nos últimos anos, a percentagem de pessoas diagnosticadas com infecções fúngicas aumentou enormemente. Isto é principalmente devido ao maior número de pessoas imunodeprimidas, ou seja, pacientes HIV-positivos e pacientes que passaram por quimioterapia ou drogas imunossupressoras após transplante³. Em um estudo de vigilância realizado nos Estados Unidos, Wisplinghoff et al mostrou que 9,5% das infecções nosocomiais corrente sanguínea foram causadas por espécies de Candida ⁴. Devido à maior ocorrência de infecções fúngicas e especialmente devido à elevada percentagem de Candida espécies encontradas durante infecções na corrente sanguínea, compreender como este patógeno escapa do controle do sistema imunológico é extremamente importante.

C. albicans é um fungo dimórfico que cresce em diferentes formas morfológicas tais como levedura, vermiforme, pseudo-hifas e hifas consoante as condições ambientais⁵. Na sua forma hifal, c. albicans mostra sua mais alta capacidade de invasividade e tem a capacidade de penetrar o epitélio⁶.

C. albicans infecções têm sido estudadas usando várias abordagens experimentais. O modelo mais comum de infecção é a injeção intravenosa de c. albicans levedura⁷. No entanto, este modelo não leva em consideração todos os processos que acontecer antes que o fungo consegue espalhar-se para a corrente sanguínea. Outro modelo aproveita a capacidade de c. albicans para invadir o epitélio. Este método, também conhecido como, o papel da areia modelo⁸, foi desenvolvido por Gaspari et al . em 1998,⁹e consiste no uso de papel da areia para friccionar a pele, eliminando assim o estrato córneo antes de aplicar a c. albicans. Este procedimento permite que o fungo penetrar o epitélio, possibilitando assim a análise das habilidades invasivas deste patógeno. Finalmente, outros modelos de infecções para o gastrointestinal¹⁰ e respiratórias¹¹ têm sido utilizados em diferentes estudos.

A formação de uma ferida (como no modelo de papel da areia) provoca a ativação de várias vias, incluindo o recrutamento de células imunes e ativação, a fim de promover a cura do processo¹². Isto pode alterar ou mascarar a resposta imune suscitou especificamente contra o patógeno, conduzindo assim a confundir os resultados.

Aqui nós descrevemos um método de infecção da pele que evita a formação de ferida inicial e a indução de um ambiente inflamatório basal. Para manter a estrutura epitelial intacta, injetamos diretamente c. albicans em sua forma hifas no derma profunda. Mesmo que uma única injeção pode provocar inflamação suave, a quantidade de inflamação é limitada e restrito em comparação com a formação de uma ferida aberta, como no modelo de papel da areia. A abordagem que descrevemos aqui permite o estudo da resposta imune à infecção fúngica e disseminação, evitando o ambiente inflamatório pré-existente e excessivo causado por danos mecânicos.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados sob o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) e operados sob a supervisão do departamento de recursos animais às crianças do Hospital (ARCH) no Hospital infantil de Boston, ou foram aprovados pelo italiano Ministério da saúde e executada sob o Animal conta Comissão institucional da Universidade de Milano-Bicocca.

1. preparação de c. albicans

1. Cultura C. albicans, estirpe CAF3-1¹³, em tubos contendo meio rico (dextrose de peptona de extrato de levedura (YEPD), extrato de levedura 1% (p/v), 2% (p/v) de Bacto peptona, 2% (p/v) glicose) suplementado com uridina (50 mg/L) a 25 ° C. Nestas condições, c. albicans cresce como um fermento.
   Nota: Outras cepas de c. albicans podem ser usadas, tais como o clínico isolar c. albicans estirpe SC5314¹³. Desde que nós recentemente demonstramos que o processo ulcerosa é induzido pela ativação do sistema imune inato¹⁴, teoricamente cada cepa de c. albicans que mantém seus componentes da parede celular e a estrutura, bem como a capacidade de origem hifas projeções, poderia ser usado.
2. Monitore a cultura contando a concentração celular usando um analisador de contador de célula.
3. Colha a cultura quando atinge uma concentração de cerca de 8 x 10⁶ células/mL. Como alternativa, use um espectrofotômetro para medir o OD₆₀₀.
   Nota: Normalmente, um valor de OD₆₀₀ = 1 corresponde a uma concentração de levedura de 3 x 10⁷ células/mL, mas recomenda-se titulação.
4. Resuspenda a cultura em meio YEPD-uridina, usando o como agente tampão HEPES (50 mM, pH 7,5) e incubar a cultura a 37 ° C, para induzir a formação de hifas. Verifica a formação de hifas sob um microscópio com ampliação de 100 X. Formação das hifas é visível 5h após cultivo a 37 ° C; no entanto, use as células 16 h após incubação a 37 ° C, quando a porcentagem das hifas atinge quase 95% da cultura total.
5. Para enriquecer ainda mais a preparação na concentração das hifas, alíquotas de centrífuga da cultura a 3.300 x g, durante 5 min. descartar o sobrenadante e resuspenda o pellet em PBS estéril na concentração de 1 x 10⁸ hifas/mL.

2. fundo dérmica injeção

1. 24 h antes o processo de infecção, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) e em seguida raspar o flanco dos ratos usando uma tosquiadeira elétrica.
   Nota: Após qualquer procedimento envolvendo anestesia, coloque os ratos sob uma lâmpada de aquecimento até que eles recuperaram eficientemente.
2. Descanse os ratos por 24 h evitar qualquer inflamação devido ao processo de barbear.
3. 24 h após o procedimento de corte, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg).
4. Verifica o reflexo de pata para garantir que os ratos são anestesiados profundamente. Avalie o reflexo da pata por beliscar-se firmemente a pata. Se a anestesia é alcançada, o animal não sente dor e não se move.
5. Injete hifas de c. albicans no derma profunda utilizando uma seringa de insulina de 0,3 mL com agulha 30 x 8 mm em um volume final de 50 µ l/injeção, correspondente a 5 x 10⁶ hifas/injeção.
   1. Puxe a pele do flanco raspada esticada usando dois dedos para injetar o volume diretamente no derma profunda. Introduza a agulha com um ângulo de 10-15° com o bisel da agulha voltado para cima.
   2. Com este ângulo, o patógeno será injetado com uma profundidade de aproximadamente 300-500 µm. Para garantir que a injeção é bem executada, verifique que o volume injetado forma um galo que é absorvido alguns min após a injeção.
      Nota: O galo formada após a injeção será de aproximadamente 1 cm². Esta é a área que será removida em ponto de tempo designado, para análise histológica ou molecular.
   3. Para pontos de tempo de menos de 24 h (recomendado) marca a área da infecção com uma caneta, uma vez que a colisão que formou com a injeção persiste por alguns minutos, após o qual é absorvido. Para pontos de tempo de 24 h ou mais, esta etapa não é necessária, porque uma úlcera ou um cisto será claramente visível.

3. recolha e preparação para a coloração histológica da amostra

1. Eutanásia nos ratos, de acordo com os procedimentos institucionais.
2. Usando pinças cirúrgicas, puxe a pele na fronteira do local injetado, previamente marcada com a caneta marcador. Usando uma tesoura cirúrgica, impostos especiais de consumo do site infectado pelo corte da pele seguindo a linha marcada.
   Nota: Tenha cuidado para separar a pele do peritônio usando uma tesoura de ponta redonda.
3. Mergulhe a pele em um molde base descartável cheio de temperatura de corte ideal (OCT) composta, com o lado interno da pele virada para cima. Congele a amostra em nitrogênio líquido até que o composto torna-se branco. Não deixe que o nitrogênio líquido cobrir a amostra antes de que é completamente congelado como isso iria danificar a amostra.
   Nota: cuidado! Durante a etapa de 3.3, use um protetor facial para proteção de nitrogênio líquido.
4. Se as amostras não forem utilizadas imediatamente para a preparação de slide, armazená-los rapidamente a-80 ° C.
   Nota: As amostras podem ser armazenadas a-80 ° C indefinidamente.

4. preparação de Slides

1. Corte a amostra ao meio para preparar as fatias para histologia a partir do centro da amostra.
2. Corte fatias grossas de 5 µm com um criostato.
   Nota: Para amostras de pele, a temperatura do criostato não deve ser superior a-25 ° C. Uma temperatura mais alta poderia causar uma fusão parcial de H-OCT e, portanto, as amostras não serão mantidas na posição correcta durante o procedimento de corte.
3. Use corrediças do microscópio carregados positivamente para coletar as fatias.
4. Se as fatias coletadas não forem utilizadas logo após o preparo, armazene-os em-20 ° C. Neste ponto, as fatias podem ser armazenadas a-20 ° C indefinidamente.

5. hematoxilina & eosina coloração

1. Mancha os slides por imersão em hematoxilina de Gill para 4 min. lavar as lâminas em água corrente por 5 min.
2. Mancha que os slides por imersão em solução de eosina Y para 1 min. lavagem as lâminas em água corrente por 5 min. enxágue os slides usando água destilada antes de continuar o protocolo.
3. Desidrata-se por imersão em serialmente, aumentando as concentrações das soluções de etanol (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Mergulhe os slides por 15 s em cada solução de etanol.
4. Limpe os slides pelo menos 2 min por imersão em um despachante histológica.
5. Monte as lâminas usando o meio de montagem e lamínulas.
6. Adquirir imagens dos slides com um scanner de slides do microscópio com uma ampliação de 40 X.

6. ácido periódico-Schiff (PAS) coloração

1. Fixe as lâminas com 99.5% de acetona em temperatura ambiente por 1 min. lavar as lâminas em água corrente por 1 min.
2. Mancha os slides por imersão em solução de ácido periódico (1 g/dL) por 5 min. Lave os slides em 3 mudanças de água destilada.
3. Mancha os slides por imersão em do reagente de Schiff durante 15 min. lavar as lâminas em água corrente por 5 min.
4. Mancha os slides por imersão em hematoxilina de Gill, por 5 min. Lave as lâminas em água corrente por 30 s.
5. Desidrate os slides por imersão em 3 alterações de 100% de etanol. Mergulhe os slides por 15 s de cada vez.
6. Limpe os slides pelo menos 2 min por imersão em um despachante histológica.
7. Monte as lâminas usando o meio de montagem e lamínulas.
8. Adquirir imagens dos slides com um scanner de slides do microscópio.

7. recolha e preparação para a extração do RNA da amostra

1. Eutanásia nos ratos, de acordo com os procedimentos institucionais. Remova as amostras de pele, como no passo 3.2.
2. Mergulhe as amostras em um tubo de snap-cap 2 mL com 1 mL do reagente para a extração de ácido guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e as amostras podem ser armazenadas a-80 ° C.
3. Corte a amostra em pedaços de aproximadamente 0,2 cm² usando pinça cirúrgica.
   Nota: cuidado! A maioria dos reagentes para isolamento de RNA são tóxicos e mutagênicos. Passos, 7.3 e 7.4 deve ser feito sob uma coifa.
4. Esmagar a amostra com uma fresa de grânulo a uma velocidade de 20 oscilações/s para 20 min. como alternativa, um oleiro mecânico pode ser usado.
5. Verificar a homogeneização eficaz das amostras, procurando a presença de pedaços intactos da pele. Repita este passo se as amostras não são completamente homogeneizadas.
6. Centrifugar as amostras a 16.000 x g por 1 min. Mantenha os sobrenadantes para extração do RNA e descartar a pelota. Esta etapa é realizada para eliminar o cabelo e detritos que possam obstruir as colunas de extração.
7. Prosseguir com a extração do RNA usando o RNA purificação colunas¹⁴.
8. Use um espectrofotômetro para avaliar a concentração e purificação de RNA. Se extratos de RNA não são usados imediatamente para a preparação do cDNA, armazenar as amostras a-80 ° C.

Resultados

Através da injecção de patógeno diretamente no derma profunda, a morfologia estrutural do tecido permanece intacta (figura 1A).

A manutenção da integridade estrutural da pele permite a detecção de células do sistema imunológico e sua localização no local da infecção. A maior ampliação mostrada na figura 1B revela que o abscesso é composto principalmente de leucócitos po...

Discussão

Aqui nós descrevemos um método de infecção de c. albicans para estudar o processo inflamatório que é iniciado após a entrada de fungosa no derma profunda.

Mesmo que a formação de abscesso da pele é um evento relativamente raro em cima de infecção de c. albicans ¹⁵, injeção do fungo diretamente no derma profunda permite não só o estudo da formação de abscesso orientada por fungos, mas também a análise de imune específica células que participam para cont...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
fortes
PBS	Euroclone	ECB4053L	quentes em 37 > Banho C antes da utilização
Laboratórios de histolinha	composta H-OCT	R0030
Gill's Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Solução de eosina Y,	laboratórios de histolinha	09-209-05
Etanol	absoluto scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, meio de montagem	bio-óptico
Acetona	sigma-aldrich	179124
sistema de coloração PAS	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptona	BD	211677
Extrato de levedura Bacto	BD	212750
D(+)-Glicose anidra para biologia molecular	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Tubos Safe-Lock 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Tóxico, corrosivo e mutagênico. Use todas as precauções necessárias
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
nitrogênio			Use proteção para os olhos
Instrumento
Coulter Contagem de Contrapartículas	Centrífuga Beckman Coulter
5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
strong>Materials
0.3 ml Seringa de Insulina com agulha de 30G x 8mm	BD	324826
Pinça
Tesoura
Molde de base descartável	histo-line laboratories	2781
Lâminas de biomicroscópio carregadas positivamente	bio-optica	09-2000
Lamínulas 24 x 50 mm	thermo scientific	11911998

alcoólica líquido <cirúrgicacirúrgica