Aqui descrevemos um protocolo que permite a análise histológica e molecular de amostras de pele após injeção intradérmica de Candida albicans . Esse protocolo mantém a integridade estrutural da pele e permite a localização do tecido-residente ou recém recrutadas células do sistema imunológico, bem como a distribuição do patógeno.
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Artigo de método
Profunda dérmica injeção como um modelo de Candida albicans de infecção da pele para análise histológica
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A pele é um órgão extremamente estendido do corpo e, devido a esta grande superfície, é continuamente exposto a microorganismos. Danos de pele podem facilmente levar a infecções na derme, que por sua vez, pode, resultar na disseminação de patógenos para a corrente sanguínea. Compreender como o sistema imunológico combate infecções na fase inicial e como o host pode eliminar os patógenos, é um passo importante para definir a base para futuras intervenções terapêuticas. Aqui descrevemos um modelo de infecção por Candida albicans que pode visualizar os processos que ocorrem durante uma infecção, incluindo quando o patógeno já passou a barreira epitelial, bem como a resposta imune provocada pela de c. albicans invasão. Usamos este modelo de infecção para realizar análises histológicas que mostram as células imunitárias que se infiltrar a pele, bem como a presença e a localização do patógeno. As amostras coletadas após a infecção pode ser processada para extração de RNA.
Introdução
O corpo humano é coberto com um número extremamente elevado de microorganismos. A superfície da pele é o habitat de quase 1 milhão de bactérias por centímetro quadrado1. Este número, no entanto, não reflete a completa variedade de microorganismos que coloniza a pele. Além de bactérias, o corpo humano é colonizado por muitas espécies de fungos, incluindo c. albicans, que é capaz de sobreviver tanto as mucosas e a pele de nível2.
Nos últimos anos, a percentagem de pessoas diagnosticadas com infecções fúngicas aumentou enormemente. Isto é principalmente devido ao maior número de pessoas ....
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Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados sob o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) e operados sob a supervisão do departamento de recursos animais às crianças do Hospital (ARCH) no Hospital infantil de Boston, ou foram aprovados pelo italiano Ministério da saúde e executada sob o Animal conta Comissão institucional da Universidade de Milano-Bicocca.
1. preparação de c. albicans
- Cultura C. albicans, estirpe CAF3-113, em tubos contendo meio rico (dextrose de peptona de extrato de levedura (YEPD), extrato de levedura 1% (p/v), 2% (p/v) de Bacto peptona, 2% (p/v) glicose) suplem....
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Resultados
Através da injecção de patógeno diretamente no derma profunda, a morfologia estrutural do tecido permanece intacta (figura 1A).
A manutenção da integridade estrutural da pele permite a detecção de células do sistema imunológico e sua localização no local da infecção. A maior ampliação mostrada na figura 1B revela que o abscesso é composto principalmente de leucócitos po.......
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Discussão
Aqui nós descrevemos um método de infecção de c. albicans para estudar o processo inflamatório que é iniciado após a entrada de fungosa no derma profunda.
Mesmo que a formação de abscesso da pele é um evento relativamente raro em cima de infecção de c. albicans 15, injeção do fungo diretamente no derma profunda permite não só o estudo da formação de abscesso orientada por fungos, mas também a análise de imune específica células que participam para cont.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
FG é suportado pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Fundação Cariplo (Grant 2014-0655) e Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB).
IZ é suportado pelo NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical escola Milton encontrou, CCFA Senior Research Awards (412708), a Eleanor e Miles Shore 50º aniversário Fellowship Program e a Fundação Cariplo ( 2014-0859).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| fortes | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | quentes em 37 > Banho C antes da utilização |
| Laboratórios de histolinha | composta H-OCT | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Solução de eosina Y, | laboratórios de histolinha | 09-209-05 | |
| Etanol | absoluto scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, meio de montagem | bio-óptico | ||
| Acetona | sigma-aldrich | 179124 | |
| sistema de coloração PAS | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptona | BD | 211677 | |
| Extrato de levedura Bacto | BD | 212750 | |
| D(+)-Glicose anidra para biologia molecular | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Tubos Safe-Lock 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Tóxico, corrosivo e mutagênico. Use todas as precauções necessárias |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| nitrogênio | Use proteção para os olhos | ||
| Instrumento | |||
| Coulter Contagem de Contrapartículas | Centrífuga Beckman Coulter | ||
| 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| strong>Materials | |||
| 0.3 ml Seringa de Insulina com agulha de 30G x 8mm | BD | 324826 | |
| Pinça | |||
| Tesoura | |||
| Molde de base descartável | histo-line laboratories | 2781 | |
| Lâminas de biomicroscópio carregadas positivamente | bio-optica | 09-2000 | |
| Lamínulas 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
Referências
- Belkaid, Y., Segre, J. A. Dialogue between skin microbiota and immunity. Science. 346 (6212), 954-959 (2014).
- Kashem, S. W., Kaplan, D. H. Skin Immunity to Candida albicans. Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).
- Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M.
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Reimpressões e permissões
