Summary
في هذا البحث، نبدي طريقة فصل خالية من تسمية العَدلات من إفرازات السريرية مجرى الهواء باستخدام عملية مغلقة من دوامة القصور الذاتي ميكروفلويديكس. الطريقة المقترحة ستوسع فحوصات سريرية في المختبر لأمراض الجهاز التنفسي المختلفة.
Abstract
مجرى الهواء إفرازات تحتوي على عدد كبير من الخلايا المتصلة بجهاز المناعة، مثلاً، العَدلات، الضامة، والخلايا الليمفاوية، التي يمكن استخدامها كمورد رئيسي لتقييم مجموعة متنوعة من الأمراض الرئوية، سواء بالنسبة للبحوث والأغراض السريرية. ومع ذلك، نظراً للطبيعة غير المتجانسة ولزوجة المخاط المريض، يوجد حاليا أي أسلوب الانفصال الموثوق بها التي لا تضر بالخلايا المناعية المضيف في إفراز مجرى الهواء المريض. في هذا البحث، علينا الأخذ بأسلوب إعداد نموذج يستخدم ميكروفلويديكس القصور الذاتي للتقييم المناعي للمريض. بغض النظر عن خصائص العينات السريرية فلويديك غير المتجانسة، يستعيد الطريقة المقترحة أكثر من 95 في المائة العَدلات من عينات إفراز مجرى الهواء التي هي المخفف 1,000-fold مع ملليلتر من المحلول الملحي نظيفة. وترد بتعميم دفق الإخراج المركزة إلى خزان عينة أولية، تركيزات عالية والانتعاش والنقاء من الخلايا المناعية؛ ويعتبر إعادة تدوير مفاضلة لتشغيل المستندة إلى حقنه واحدة تديرها ميكروفلويديكس القصور الذاتي. وتقدم العملية حلقة مغلقة من دوامة ميكروفلويديكس الكريات البيضاء دون اضطراب الفيزيائية أو الكيميائية، كما يتبين من phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)-الناجم عن إطلاق سراح elastase العَدلات تم فرزها.
Introduction
حيث يتم تغليف الخلايا في كمية كبيرة من المخاط في مجرى الهواء إفرازات، وعرقل الوظيفية تقييم الكريات البيضاء بفحص في المختبر . ديثيوثريتول (DTT) هو الأكثر شيوعاً تحلل المخزن المؤقت أيوناتها وتجانسه البلغم لتحليل الخلوية والكشف عن الوسطاء مع توفير السلامة مقبولة للخلايا المعزولة1،2. ومع ذلك، القيمة يمكن أن تتداخل مع المستضدات السطحية زمنياً من العَدلات مجرى الهواء، أدى إلى تعطيل وظيفة العَدلات مثل الستسي وميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات) الإصدار2،3. ولذلك، أجريت دراسات قليلة من وظيفة العَدلات مجرى الهواء البشرية مع العَدلات الدم المحيطية، التي قد لا تكشف عن الخصائص الفسيولوجية ل الرئة4. وفي الوقت نفسه، ميكروفلويديكس القصور الذاتي قد أحرزت تقدما في عزل الخلايا من مختلف بيوماتريسيس المريض5،6. التوازن بين القوى رفع القصور الذاتي واسحب عميد يحاذي الجسيمات/الخلية وفقا لحجمها، مما يسمح للجسيمات خالية من تسمية الفصل7. عرض مجموعتنا سابقا طريقة إعداد نموذج لتعميم ورم الخلايا8،9، العوامل الممرضة في الدم8خلايا من تعليق ثقافة10،11، 12، والكريات البيض النوى (بمنس) من الدم13،14.
نقدم لك هنا، وضع بروتوكول لإعداد الخلايا المناعية من إفرازات مجرى الهواء للمريض استخدام حلقة مغلقة ميكروفلويديكس القصور الذاتي للمتلقين للمعلومات في المختبر مقايسة، مثل المقايسة elastase العَدلات (شمال شرق). يوفر هذا الأسلوب التركيز العالي والانتعاش، ولا سيما عندما يكون هناك تداخل كبير في الاتجاه الأفقي الخلية/الجسيمات منه الخلية/الجسيمات من الفائدة المراد إزالتها، الذي يتم الاحتفال به عادة في العينات السريرية. بتعميم الجدار الداخلية (IW)-تركز الجزيئات الكبيرة أو الخلايا إلى أنبوب العينة الإدخال، والجسيمات أو مركزات الخلية من الفائدة في الخزان الأصلي، بينما يمر السوائل الخلفية مع المجاميع الصغيرة الميوسين خزان النفايات. على الرغم من خصائص العينات السريرية فلويديك غير المتجانسة، يسترد الأسلوب المقترح استمرار أعلاه 95% العَدلات من عينات إفراز مجرى الهواء التي هي تضعف 1,000-fold مع المحلول الملحي نظيفة (~ 1 مل). على النقيض من ذلك، يعرض طريقة تحلل طائفة واسعة من بمنس معدلات الاسترداد استناداً الشرط الذي عينة. يلتقط البروتوكول المقترح الكريات البيضاء بطريقة خالية من التسمية مع لا اضطراب الفيزيائية أو الكيميائية، التي توفر إمكانية لحصاد الخلايا الحساسة من تحدي سريرياً القياسات الحيوية مع إجراءات كسبها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جمع العينات أقرها مجلس جامعة بيتسبرغ المراجعة المؤسسية (IRB # PRO16060443، PRO10110387). جميع التجارب التي تتم تحت السلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
1-جهاز التصنيع والطباعة الحجرية الناعمة
ملاحظة: استخدمت تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة القياسية15،16 لإنشاء microchannel بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS).
- مزيج من السلائف PDMS بنسبة 10:1 قاعدة وعلاج عامل.
- صب 30 جرام المخلوط السلائف PDMS على القالب الصغير تشكيلة الألومنيوم (انظر الشكل 1 لإبعاد) و 20 غرام الخليط السلائف PDMS على 100 مم من طبق بيتري.
ملاحظة: يتم استخدام طبق بيتري جعل الفيلم سميكة من PDMS (~ 3 مم) الطبقة الداعمة. الطبقة الداعمة ل PDMS توفر خصائص سطح المادية موحدة في جميع أنحاء ميكروفلويديكس. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام طبقة رقيقة PDMS على الشريحة الزجاجية. صمم القالب الرئيسي مع أبعاد قناة معينة وملفقة بالطحن الجزئي على ورقة الألمنيوم. وكان دوامة القناة المستخدمة في هذه الدراسة microchannel دوامة 8-حلقة مع مدخل واحد واثنين من المنافذ، مع دائرة نصف قطرها زيادة من 8 ملم إلى 24 ملم لكفاءة الفصل على أساس الحجم. - ضع العفن وطبق بيتري إلى مجفف فراغ ديغا حتى لا فقاعات مرئية على السطح، وعادة 5-10 دقيقة استخدام فراغ بيت مجففة.
- الإفراج عن الفراغ ومكان العفن وطبق بيتري في فرن 90 درجة مئوية ح 1.
ملاحظة: هوتبلت أو غيرها من أدوات تدفئة استخدامها بدلاً من فرن. - إزالة العفن وطبق بيتري من الفرن والسماح لها لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- قطع الخطوط العريضة ولكمه ثقوب الوصول السوائل على الجهاز باستخدام تثقيب 2 مم بعناية.
ملاحظة: يمكن أن تختلف الحجم لكمه تبعاً لحجم الدليل الأنابيب أو السوائل. - التقيد شريط إلى جانب قناة الجهاز والفيلم سميكة من PDMS وقشر بعناية مع الملقط لإزالة الغبار.
- علاج جانبي القناة للجهاز وعادي PDMS مع الهواء البلازما والسندات مع طبقة دعم استعداد PDMS عادي (الشكل 1A).
- ضع الشريحة على الشريحة الزجاجية 50 ملم × 70 ملم ووضعه في فرن 70 درجة مئوية مدة 30 دقيقة على الأقل تعزيز قوة الترابط.
2-القصبة الهوائية إفراز مجموعة من المرضى الموضوعين على التهوية الميكانيكية
ملاحظة: إفرازات القصبة الهوائية ويمكن الحصول من المرضى الموضوعين على التهوية الميكانيكية أثناء رعاية الخطوط الجوية الروتينية العادية باستخدام بروتوكول تعديل من الأساليب التقليدية لاستيعاب المريض التهوية القياسية، والكبار. الشطب وحددت عينات وإرسالها فورا للمعالجة.
- إذا كان تتم الإشارة إلى تطلع الرغامى، استخدام قسطرة لاستخراج إفرازات مجرى الهواء.
- تقدم القسطرة بعناية في منتصف الطريق في أنبوب داخل الرغامى وغرس 5 مل من 0.9% عقيمة المالحة العادية من حقنه معبئة مسبقاً 10 مل.
- عندما القسطرة متقدمة تماما، أو الوفاء بالمقاومة، نضح الإفرازات وجمع في وعاء جمع بصاق عقيمة.
- جمع 10 مل إفرازات القصبة الهوائية في حاوية معقمة بصاق ووضعه على الجليد. إرسال العينات فورا للمعالجة.
3-إعداد عينة إفراز القصبة الهوائية
ملاحظة: يجب إجراء جميع التجارب تحت السلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
- تفريق 1 مل عينات إفراز مجرى الهواء في 9 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام المحاقن بلاستيكية 10 مل (لإضعاف 10 x). استخدام ماصة غير حادة لمجانسة عينة مخاط.
- سلالة مخفف مع 40 ميكرومتر نايلون خلية مصفاة لإزالة أجزاء كبيرة أو تجلط الدم، الذي يمكن أن كتلة الثقب الوصول ميكروفلويديكس أو القناة. ضع العينة على الجليد بعد المعالجة.
- تفريق مخفف لكل عينة باستخدام وحدة تخزين 100 x من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني، أدى 1,000 x تعليق المخفف. ضع العينة على الجليد أثناء عملية الانفصال الكامل.
4-الإعداد تجريبي
ملاحظة: يجب إجراء جميع التجارب تحت السلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
- تجميع الرقائق PDMS مع دليل السائل تطبيق تدفق موحد لكل من ميكروتشانيلس دوامة الأربعة (الشكل 1B).
ملاحظة: استخدمت أربع قنوات لزيادة الإنتاجية بالموازاة، فضلا عن الاستفادة المثلى من كثافة التخزين وخلية تعليق الناتجة. دليل السائل هو تصميم ومع طابعة نوع المجسمة ثلاثية الأبعاد مع الراتنج واضحة. المدخل ومنفذ مأخذ الدليل السوائل استخدام الإناث اللوير موصلات لسهولة الاتصال وختم مستقرة أثناء العملية. - قم بتوصيل موصل اللوير ذكور 1/16 بوصة المدخل ومنفذ الجدار الداخلي (IW) والمنفذ منفذ الجدار الخارجي (آه) من دليل السائل وتوصيل أنابيب سيليكون تعليق عينة.
- إدراج نصائح حادة في نهاية كل مدخل ومنافذ للوصول إلى الجزء السفلي من الخزان عينة.
- قم بتوصيل مضخة تمعجية مع أنابيب مدخل.
- وضع النهاية لمدخل الأنبوب والأنابيب منفذ IW في الخزان العينة ووضع نهاية الأنابيب منفذ آه في خزان النفايات (الشكل 1، د).
- وضع أنبوب 50 مل من برنامج تلفزيوني تم تصفيتها دون الكالسيوم والمغنيسيوم في الخزان عينة.
- بدء ضخ بمعدل تدفق منخفض (~ 1 مل/دقيقة) رئيس الجهاز.
ملاحظة: عندما يتم التقاط فقاعات في القناة، دفع الجزء العلوي من القناة مع ملقط لزعزعة الاستقرار والقضاء على فقاعات الهواء. عندما يتم تعبئة الجهاز تماما مع الحل المخزن المؤقت، تغيير الأنبوب برنامج تلفزيوني لإعداد أنبوب عينة إفراز مجرى الهواء. - عندما يتم وضع العينة في الخزان عينة، التبديل على مضخة تمعجية وتعيين معدل التدفق في 4 مل/دقيقة (الشكل 1، د).
- عندما يصل حجم العينة إلى وحدة التخزين المعينة (~ 1 مل)، إيقاف العملية وقطع أنابيب سيليكون.
ملاحظة: الأسلوب المقترح أكثر فعالية في الحد من حجم كبير من مخفف (> 50 مل) إلى حجم أنبوب الصغير-الطرد المركزي (~ 1 مل) (الشكل 2).
5. التدفق الخلوي التحليل
ملاحظة: لمقارنة طرق الانفصال (ميكروفلويديكس وتحلل)، تم استخدام التدفق الخلوي مع الفلورة.
- إضافة fluorescein isothiocyanate (فيتك)-الماوس مترافق الإنسان المضادة CD66b [مونوكلونل] جسم واللوفيكوسيانين (APC)-مترافق الماوس المضادة الإنسان CD45 [مونوكلونل] جسم إلى تعليق الأولى (الخطوة 3، 3) والمعلقات الناتجة (الخطوة 4.9) (200 ميليلتر لكل جسم) بنسبة 01:25 الخامس/الخامس.
- احتضان هذه العينات في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة.
- تحليل كل العينات في سيتوميتير تدفق للقياس الكمي في بمنس.
ملاحظة: يعتبر السكان إيجابية مزدوجة فيتك-آسيا والمحيط الهادئ والإيجابي CD66b وإيجابية CD45 أن العَدلات. تم حساب الاسترداد بنسبة أرقام الخلية إجمالي المدخلات وتعليق الناتجة.
6. تحليل الإصدار ني
ملاحظة: لمقارنة وظيفة عزلة العَدلات بطريقة ميكروفلويديكس، وتحلل، وضع مجموعة من أدوات تحليل NE استخدمت.
- إضافة سلطة النقد الفلسطينية (المقدمة في أدوات التحليل) لكل تعليق الناتجة (التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.9) بتركيز نهائي من 50 نانومتر.
- احتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية ح 2.
- الطرد المركزي أن الإيقاف على 300 غرام x لمدة 10 دقائق.
- نقل 10 ميليلتر من المادة طافية كل لوح 96-جيدا (المقدمة في أدوات التحليل).
ملاحظة: يمكن استخدام ميكروسكوبية 96-جيدا مع مسطحة القاع والبوليستيرين الأسود كذلك. - إضافة ميليلتر 90 المخفف بالانزيم المخزن المؤقت (المقدمة في أدوات التحليل) لكل بئر.
- إضافة 10 ميليلتر من الركازة elastase (Z-علاء-علاء-علاء-علاء 2Rh110، قدمت في أدوات التحليل).
- احتضانها ح 1.5 عند 37 درجة مئوية.
- قراءة لوحة 96-جيدا باستخدام فلوروميتير في الطول موجي إثارة من 485 نانومتر والطول موجي انبعاثات من 525 نانومتر.
ملاحظة: تم تقسيم مستوى ني بالعد المجنحة من تحليل التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد حققنا معلقات الخلايا المناعية شفافة مع كلا DTT موكوليسيس وميكروفلويديكس الانفصال (الشكل 3A). ميكروفلويديكس تفارق جمعت 4.40 × 105 بمنس في المتوسط (2.1 × 104 إلى 5، 60 × 105 بمنس، n = 6) من مجرى الهواء إفراز عينات المخفف 1,000-fold (الحجم الإجمالي 50 مل) في 1 مل تعليق نظيفة. مخفف الأولية، بمنس 94.0% بالمقارنة مع (CD66b+/CD45+) عثر في حجم صغير، باستمرار أكثر من 6 عينات سريرية. ومع ذلك، الأسلوب موكوليسيس DTT أظهر انتعاش 53.5 في المائة في المتوسط مع وجود تباينات كبيرة عينة بعينه (30.8 96.0%) (الشكل 3).
بعد ذلك، بحثت الإفراج عن الاستاسي مع مجموعة مقايسة NE تجارية كإثبات لمفهوم. دون المؤثر الخارجي، أظهرت العينة أعدت بواسطة الأسلوب موكوليتيك ني أعلى مستوى من العينة من الأسلوب ميكروفلويديكس. سلطة النقد الفلسطينية أضيفت إلى أن الإيقاف الناتجة من كل من ميكروفلويديكس وأساليب الانفصال موكوليتيك لتشغيل الإصدار NE. قمنا باختبار كل أسلوب مع مجرى الهواء إفراز عينات من 6 المرضى المختلفة. تعرض الخلايا المناعية المنفصلين مع ميكروفلويديكس وظيفة سليمة، تظهر زيادة كمية ني الإفراج عن طريق تحفيز سلطة النقد الفلسطينية. من ناحية أخرى، أظهرت الخلايا التي أعدت بواسطة الأسلوب الانفصال mucolytic زيادة غير متناسقة الإفراج NE (الشكل 3).
رقم 1: دوامة موائع جزيئية الجهاز وإعدادات التجريبية. تجميع صور فوتوغرافية ميكروفلويديكس دوامة (A) و (ب) الجهاز مع محول فلويديك. (ج) رسم تخطيطي لفصل حلقة مغلقة باستخدام دوامة القصور الذاتي ميكروفلويديكس. بتعميم دفق الجسيمات/خلية تتركز (IW منفذ) يعود إلى الخزان العينة الأصلية، المتصلة بجهاز المناعة الخلايا تتركز في وحدة تخزين صغيرة بينما السائل الخلفية التي تحتوي على مجاميع الميوسين وكانت طفيفة كرات الدم الحمراء بشكل مستمر إزالة من خلال أنبوب النفايات متصلة إلى منفذ آه. (د) الإعداد التجريبية والصورة الفلورية جسيمات 10 ميكرون، والمسار (الأخضر) ومخرج قناة دوامة (أعلى اليمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: رسم تخطيطي لإعداد نموذج إفراز مجرى الهواء استخدام حلقة مغلقة القصور الذاتي ميكروفلويديكس. سريرياً الناجمة عن إفراز مجرى الهواء فرقت ميكانيكيا في 1,000 x حجم المخزن المؤقت الحل. ويتركز مخفف حسب ميكروفلويديكس، نتج عنه ~ 1 مل تعليق خلية مع خلفية واضحة. حقوق الطبع وتكييفها مع إذن من ريو et al., "جمعية الكيميائيين الأمريكية" (2017)17. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: مقارنات الممثل من الأسلوب mucolytic DTT لأسلوب الانفصال موائع جزيئية. عينة إفرازات القصبة الهوائية (A) (يسار) وصورة مجهرية بعد الانفصال موائع جزيئية. (ب) صورة فوتوغرافية من المعلقات الأصلي والناتجة عن ذلك. (ج) مقارنة لمعدلات استرداد المجنحة بين الأساليب موكوليتيك وميكروفلويديكس. (د) مقارنة بين إطلاق سراح NE العَدلات المنفصلين عن ذويهم، ميكروفلويديكس وأساليب موكوليتيك DTT قبل وبعد تحفيز سلطة النقد الفلسطينية. الإصدار NE ناجم إلى حد كبير سلطة النقد الفلسطينية على العينة من فصل موائع جزيئية (ف < 0.0001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في ميكروفلويديكس القصور الذاتي، تعريب الخلايا والجسيمات في موقف معين جانبية في الدقيقة-قناة استناداً على حجم5،18،،من1920. بسبب التأثير المشترك للعميد سحب قوة وقوة رفع القصور الذاتي في microchannel المنحنية أو الجسيمات الكبيرة أو العَدلات (> 10 ميكرون) تقع داخل القناة والجسيمات الصغيرة والمجاميع المخاط، والحطام أصغر من 6 ميكرون متوضعة خارج القناة في سرعة تدفق بعض الظروف10،11،،من1314.
ومع ذلك، هناك مفاضلة بين التركيز والانتعاش للفصل عند استخدام ميكروفلويديكس، لا سيما عند فصل نطاق حجم الجسيمات أو الخلية التي تهم يتراكب مع خلايا/الجزيئات الأخرى. تحقيق تركيزات عالية من خلايا وجزيئات مفروزة، نطاق الفصل يحتاج إلى أن يكون ضيقاً ويحتاج صقل مع الملاحظة المجهرية لكل تشغيل العينة؛ وهذا يحد من استخدام ميكروفلويديكس القصور الذاتي في القياسات الحيوية غير المتجانسة، مثل إفرازات مجرى الهواء.
وهنا نقدم طريقة إعداد عينة إفرازات مجرى الهواء سريرية لفحوصات في المختبر على استخدام حلقة مغلقة ميكروفلويديكس القصور الذاتي (الشكل 1، ج). حققت عملية مغلقة بإعادة تدوير الجسيمات/الخلية من خلال منفذ لتركيز عوامل تركيز عالية ومعدلات الانتعاش عالية. منفذ آه ينساب إلى أنبوب النفايات، ويتم تغذية مأخذ IW باستمرار إلى أنبوب العينة الأصلية. تظل الخلايا أكبر من 10 ميكرون في القطر في أنبوب العينة الأولية، وبالتالي، زيادة كثافة خلية العينة، في حين يتم القضاء على خلفية السائل إلى أنبوب النفايات. يسمح إضعاف ارتفاع المعدل إزالة السائل الخلفية، بما في ذلك الحطام والمخاط. أيضا، بغض النظر عن حالة المريض عينة، الطريقة المقترحة يمكن موحد فصل وعزل الخلايا المناعية.
DTT هو مخزن مؤقت تحلل الميوسين مستخدمة على نطاق واسع أن كليفس ثنائي كبريتيد السندات في تجميع بروتيوغليكان لفصل محتوى الخلية من الصمغ1،،من2122. ومع ذلك، يقال أن DTT يتداخل مع المستضدات السطحية خلايا الدم البيضاء، التي يمكن أن تؤثر على وظيفة الكريات البيض2. في دراستنا، محتويات الخلوية المستردة بالانفصال DTT تتعارض عبر العينات، بسبب كفاءة mucolytic غير موحدة وانسداد لعامل التصفية. وهذا يصبح أكثر انتقاداً لإعداد العينات الأولية بكميات صغيرة وعينات إفراز مجرى الهواء سميكة نسبيا. من ناحية أخرى، طريقة استخدام ميكروفلويديكس تمكين استرداد متسقة لمحتويات الخلايا في عينات المرضى غير متجانسة (الشكل 3). كما هو موضح في الشكل 3، ونحن يمكن أن استمرار عزل محتويات الخلية من إفراز مجرى الهواء في مخزن مؤقت نظيف بغض النظر عن الدولة العينة الأصلية، أي الدموي أو عنيد أو مائي. مقارنة بالطريقة التقليدية، بالطريقة المقترحة أقل الحطام في العينة المسترجعة، مما يقلل من أي تداخل محتمل من الحطام في التحاليل البيوكيميائية المتلقين للمعلومات.
الإصدار NE بحثت لتقييم السلامة الفنية العَدلات القبض على كلا أساليب الإثراء (3D الشكل). إزالة العَدلات الأجنبية الجزيئات العضوية عن طريق ني إطلاق سراح23،،من2425. سلطة النقد الفلسطينية يستخدم عادة لتفعيل العَدلات في المختبر26. حفز الخلايا المعزولة ميكروفلويديكس والأساليب (DTT) موكوليتيك مع 50 نيوتن متر من سلطة النقد الفلسطينية. قمنا باختبار كل أسلوب مع عينات إفراز الإنسان مجرى الهواء (وصفت بأنها P173 P174، P176، P177، P181 و P182). العينات التي تتركز بها ميكروفلويديكس وأظهرت زيادة في ني بتحفيز سلطة النقد الفلسطينية لجميع العينات 6. على النقيض من ذلك، يمكن حمل 3 فقط من العينات القيمة التي تعالج زيادة النشاط NE بعد تحفيز سلطة النقد الفلسطينية. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت العَدلات معزول بواسطة الأسلوب موكوليتيك DTT الكثير من النشاط الأساس أعلى من العَدلات معزول بواسطة ميكروفلويديكس. وأظهرت نتائج هذه الاضطرابات الكيميائية المحتملة إليه NE، ملزمة أي اضطراب السطح مستضد2،3، مما يوحي بأن أسلوب ميكروفلويديكس طريقة محسنة من حيث الحفاظ على العَدلات الدالة من تجانس DTT. ويعمل الأسلوب الانفصال المقترح أيضا بطريقة تلقائية والوارد تماما، التقليل من التعرض لعينات المرضى مع المخاطر المحتملة للبيئة الخارجية.
ومع ذلك، يتطلب الأسلوب المقترح بمعدل تدفق عالية، ومن ثم اتصال فلويديك مستقرة. أيضا، بسبب تقلب الملازمة لمضخة تمعجية تداولها، IW مأخذ البعد يجب أن يكون أكبر من البعد منفذ آه، وإلا قد تتعرض للخطر الناتج. ونحن نتوقع أن الأسلوب المقترح سيوفر أعلى من الناتج إذا كان هناك مضخة الدورة الدموية التي يمكن أن توفر معدل تدفق أكثر استقرارا.
من خلال توفير بروتوكول الانفصال لالتقاط العَدلات من إفرازات مجرى الهواء السريرية، الأسلوب الذي قدم في هذه الدراسة المتوقعة لتوسيع نطاق البحوث السريرية المتعلقة بأمراض الجهاز التنفسي، مثل الالتهاب الرئوي، الربو، والتليف الكيسي، والمزمن مرض الانسداد الرئوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
مقدمي البلاغ قد قدم طلب براءة التكنولوجيا المبينة هنا.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة/نييد (R21AI119042) فضلا عن برنامج الفحص "تجنيب عينة U24 المعاهد الوطنية للصحة" (U24-AI118656).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
References
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, Suppl 4. 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D.
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
