Summary
이 연구에서 임상 기도 분 비 물이 나선형 관성 마이크로의 폐쇄 루프 작업에서 레이블 없는 호 중구 분리 방법을 설명 합니다. 제안된 된 방법 분석 실험 임상 생체 외에서 다양 한 호흡기 질환에 대 한 확장 이라고 합니다.
Abstract
기도 분 비의 면역 관련 세포, 예, 호 중구, 대 식 세포, 림프 톨, 폐 질환, 연구 및 임상 목적을 위해 둘 다의 다양 한 평가를 주요 자원으로 사용 될 수 있는 큰 숫자를 포함. 그러나, 이기종 및 점성의 특성상 환자 점액, 거기 현재 없습니다 신뢰할 수 있는 분리 방법이입니다 환자 기도 분 비에서 호스트 면역 세포를 손상 하지 않는다. 이 연구에서 우리는 환자의 면역 평가 대 한 관성 마이크로 사용 하는 샘플 준비 방법 소개. 임상 샘플의 이종 유체 속성에 제안된 된 방법 1,000-fold 희석 하는 기도 분 비 샘플에서 호 중구의 95% 이상 복구와 깨끗 한 식 염 수의 밀리 리터. 초기 샘플 저수지에 집중된 출력 스트림에 재순환 하 여 높은 농도, 복구, 및 면역 세포의 순도 제공 됩니다; 재순환 관성 마이크로의 단일 실행 주사기 기반 작업에 교환으로 간주 됩니다. 나선형 마이크로의 폐쇄 루프 작업 제공 물리적 또는 화학적 방해 없이 백혈구 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)에 의해 증명-정렬 된 호 중구 elastase 출시를 유도.
Introduction
이후 셀 기도 분 비 물에 점액의 다량에 캡슐화, 생체 외에서 시험에 의해 백혈구의 기능 평가 방해 되었습니다 있다. Dithiothreitol (DTT)는 해리 cytological 분석 및 격리 된 셀1,2의 쾌활 생존을 제공 하면서 중재자의 검출에 대 한가 래를 균질 하 가장 일반적인 세포의 용 해 버퍼. 그러나, DTT 방해할 수 있습니다 기도 중 성구의 표면 바인딩된 항 같은 elastase myeloperoxidase (MPO) 릴리스2,3호 중구 기능 장애의 결과로. 따라서, 인간의 기도 호 중구 기능 몇 가지 연구와 말 초 혈액 호 중구, 폐4의 생리 적 특성을 드러내지 수 있습니다 실시 되었습니다. 한편, 관성 마이크로 다양 한 환자 biomatrices5,6에서 세포를 분리 하는에서 발전을 했다. 딘 끌어서 관성 리프트 힘 사이 평형 입자/셀 라벨 무료 입자 분리7를 수 있는 그들의 크기에 따라 정렬 합니다. 우리의 그룹은 이전 순환 종양 세포8,9, 혈액8병원 체, 세포는 현 탁 액 문화10,11, 를 위한 샘플 준비 방법 소개 12, 및 polymorphonuclear 백혈구 (PMNs) 혈액13,14에서.
여기, 다운스트림 시험관에서 분석 결과, 같은 호 중구 elastase (NE) 분석 결과 대 한 폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 환자의 기도 분 비 물에서 면역 세포를 준비 하는 프로토콜을 소개 합니다. 셀/입자의 있는 셀/입자-의-관심은 제거 되어야 하는 임상 견본에서 일반적으로 관찰 되는 측면 방향에 상당한 중복 하는 경우에 특히 높은 농도 및 복구,이 메서드를 제공 합니다. 내부 벽 (IW)를 재순환 하 여-작은 mucin 집계 배경 액체 폐기물 저수지를 통과 하는 동안 큰 입자 또는 셀 입력된 샘플 튜브, 입자 또는 원래 저수지에서 셀의 관심 집중에 다시 집중. 임상 샘플의 이종 유체 속성에도 불구 하 고 제안된 된 방법 1,000-fold 희석 하는 기도 분 비 샘플에서 호 중구의 95% 이상 일관 되 게 복구 솔루션과 깨끗 한 식 염 수 (~ 1 mL). 대조적으로, 세포의 용 해 방법 샘플 조건에 따라 회수율 PMNs의 넓은 범위를 제공합니다. 제안 된 프로토콜 임상 도전 최소한 침략 적 절차와 생체 인식에서 섬세 한 세포 수확에 물리적 또는 화학적 중단 없이 레이블 없는 방식으로 백혈구를 캡처합니다.
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Protocol
샘플 컬렉션은 피츠버그 대학 기관 검토 위원회 (IRB # PRO16060443, PRO10110387)에 의해 승인 되었다. 모든 실험은 적절 한 개인 보호 장비와 캐비닛 biosafety 아래 수행 됩니다.
1. 장치 제조 및 소프트 리소 그래피
참고: 표준 소프트 리소 그래피 기술을15,16 입니다 (PDMS) 아닌을 만드는 데 사용 했다.
- PDMS 전조를 기본 및 경화 에이전트의 10:1 비율로 섞는다.
- PDMS 전조 혼합물의 30 g 마이크로 가공 알루미늄 몰드에 부 어 (치수는 그림 1 참조) 및 100 mm 페 트리 접시에 PDMS 전조 혼합물의 20 g.
참고: 페 트리 접시 지원 계층에 대 한 PDMS (3 m m)의 박막을 만드는 데 사용 됩니다. PDMS의 지원 레이어는 마이크로 걸쳐 균일 한 표면 물성을 제공합니다. 또한, PDMS 박막 유리 슬라이드에 사용할 수 있습니다. 특정 채널 치수와 마스터 몰드 설계와 마이크로 밀링 알루미늄 시트에 의해 조작. 이 연구에 사용 된 나선형 채널 한 입구와 두 개의 콘센트, 효율적인 크기 기반 분리에 대 한 24 m m 8mm에서 증가 하는 반경 8 루프 나선형 아닌 했다. - 아니 거품 표면에, 일반적으로 5-10 분 사용 집 진공은 desiccator 표시 됩니다 때까지 드를 진공 desiccator로 형과 페 트리 접시를 놓습니다.
- 진공 놓고 1 시간 동안 90 ° C 오븐에서 형과 페 트리 접시를 놓습니다.
참고: 열판 또는 다른 난방 도구는 오븐 대신 사용할 수 있습니다. - 오븐에서 형과 페 트리 접시를 제거 하 고 10 분 동안 실내 온도에 냉각 수 있습니다.
- 신중 하 게 개요를 잘라 하 고 2mm 구멍을 뚫는 사용 하 여 장치에 액체 접근 구멍을 펀치.
참고: 펀치의 크기는 배관 또는 유체 가이드의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. - 준수는 소자의 채널 쪽을, PDMS의 두꺼운 필름 테이프와 먼지를 제거 하는 집게와 신중 하 게 껍질.
- 장치 및 공기 플라즈마와 일반 PDMS와 채권 일반 PDMS (그림 1A)의 준비 지원 계층에 두 채널 측면을 취급.
- 50 m m x 70 m m 유리 슬라이드에 칩을 놓고 접합 강도 향상 시키기 위해 적어도 30 분 동안 70 ° C 오븐에 배치 합니다.
2. 기계적으로 통풍된 환자에서 tracheal 분 비 컬렉션
참고: Tracheal 분 비 물은 얻을 수 있습니다 기계적으로 통풍된 환자에서 정상적인 일상적인 기도 관리 중 표준, 성인 통풍된 환자를 수용 하기 위해 기존의 방법에서 변경 하는 프로토콜을 사용 하 여. 샘플 드 식별 하 고 즉시 처리를 위해 전송 했다.
- Tracheal 포부를 표시 하는 경우 카 테 터를 사용 하 여 기도 분 비 물을 추출.
- Endotracheal 튜브로 테 신중 하 게 반 방법은 사전 및 미리 채워진된 10 mL 주사기에서 0.9% 메 마른 정상적인 염 분의 5 mL 주입.
- 카 테 터를 완벽 하 게, 고급 또는 저항을 만났다, 분 비 물 발음 고 메 마른가 래 수집 용기에 수집.
- 메 마른가 래 컨테이너 tracheal 비의 10 mL를 수집 하 고 얼음에 그것을 배치. 즉시 처리를 위해 샘플을 보냅니다.
3. tracheal 분 비 샘플 준비
참고: 모든 실험 biosafety 적절 한 개인 보호 장비와 캐비닛에서 수행 되어야 합니다.
- 1 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (10 배 희석)에 대 한 플라스틱 10 mL 주사기를 사용 하 여 9 mL에 기도 분 비 샘플의 분산. 무딘 피 펫을 사용 하 여 균질 점액 샘플.
- 큰 덩어리 또는 마이크로 접근 구멍 또는 채널을 차단할 수 있는 혈전을 제거 하려면 40 µ m 나일론 셀 스 트레이너와 희석제를 변형. 처리 후 얼음에 샘플을 놓습니다.
- 100 x 양의 희석된 정지 x 1000 결과 PBS 버퍼를 사용 하 여 각 샘플의 희석 액을 분산. 전체 분리 작업 중 얼음에 샘플을 놓습니다.
4. 실험 설정
참고: 모든 실험 biosafety 적절 한 개인 보호 장비와 캐비닛에서 수행 되어야 합니다.
- 각 4 개의 나선형 microchannels (그림 1B)의 일정 한 흐름을 적용 유체 가이드와 함께 PDMS 칩을 조립.
참고: 4 채널 처리량 증가를 병렬화, 결과 서 스 펜 션의 볼륨 및 셀 밀도의 최적화에 의해 사용 되었다. 유체 가이드 설계 및 명확한 수 지와 스테레오 리소 그래피 형식 3D 프린터와 함께 했다. 입구와 출구 포트 유체 가이드의 연결 및 작업 중 안정적인 씰링의 용이성에 대 한 여성 Luer 커넥터를 사용합니다. - 입구, 안 벽 (IW) 콘센트와 유체 가이드의 외벽 (아야) 출구 포트 1/16 인치 남성 Luer 커넥터를 연결 하 고 샘플 정지에 실리콘 튜브를 연결.
- 무딘 도움말 샘플 저수지의 바닥에 도달 하는 출구 및 입구의 양쪽 끝을 삽입 합니다.
- 연동 펌프 유입 배관으로 연결 합니다.
- 샘플 저수지에 유입 튜브와 IW 콘센트 튜브의 끝을 놓고 폐기물 저수지 (그림 1 c, D)에 아야 콘센트 배관의 끝을 놓습니다.
- 샘플 저수지에 칼슘과 마그네슘 없이 필터링 된 PBS의 50 mL 튜브를 배치 합니다.
- 장치를 낮은 흐름 속도 (~ 1 mL/min)에서 펌핑 시작 합니다.
참고: 때 거품에에서 캡처됩니다 채널, 기포를 불안정 하 게 트위터와 채널의 상단을 밀어. 장치는 완전히 버퍼 솔루션 때, PBS 튜브 준비 기도 분 비 샘플 튜브를 변경 합니다. - 샘플 샘플 저수지에 놓으면 연동 펌프에 전환 하 고 4 mL/min (그림 1 c, D)에 흐름 속도 설정 합니다.
- 샘플 볼륨에 지정 된 볼륨 (~ 1 mL)에 도달 하면, 작업을 중지 하 고 실리콘 튜브를 분리.
참고: 제안 된 메서드는 희석제의 큰 볼륨을 감소에 더 효율적입니다 (> 50 mL)를 마이크로 원심 튜브 볼륨 (~ 1 mL) (그림 2).
5. 교류 Cytometry 분석
참고: 분리 방법 (마이크로 및 세포)를 비교, cytometry 면역 형광 검사와 함께 사용 되었다.
- Fluorescein isothiocyanate (FITC)-활용된 마우스 반대로 인간 CD66b 단일 클론 항 체 및 allophycocyanin (APC)-마우스 안티 인간 CD45 단일 클론 항 체는 초기 정지 (단계 3.3) 및 결과 정지 (단계 4.9)를 (200 µ L 활용 추가 각 항 체)의 1시 25분의 비율에서 v/v.
- 30 분 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 샘플을 품 어.
- 교류 cytometer는 PMNs 척도 두 샘플을 분석 합니다.
참고: FITC APC 이중 긍정, CD45 긍정적인, CD66b 긍정 이며 인구 neutrophils 것 여겨졌다. 복구는 입력 및 결과 서 스 펜 션의 총 세포 수의 비율에 의해 계산 되었다.
6. 네브라스카 릴리스 분석
참고:는 격리의 기능을 비교 메서드에서 마이크로 및 세포, 호 중구는 NE 분석 결과 키트 사용 되었다.
- PMA (분석 결과 키트에 제공 된) 각 결과 정지 (단계 4.9에서 얻은) 50의 최종 농도를 추가 nM.
- 2 h 37 ° C에서 샘플을 품 어.
- 10 분에 대 한 300 x g에서 정지 원심
- (분석 결과 키트에 제공 된) 96 잘 접시에 각 상쾌한의 10 µ L를 전송 합니다.
참고: 플랫 바닥와 검은 폴리스 티 렌 96 잘 microplate 뿐만 사용할 수 있습니다. - 각 우물에 희석된 분석 결과 버퍼 (분석 결과 키트에 제공 된)의 90 µ L를 추가 합니다.
- Elastase 기판 (Z 날개 날개 날개 날개 2Rh110, 분석 결과 키트에 제공 된)의 10 µ L를 추가 합니다.
- 1.5 h 37 ° c.에 대 한 품 어
- 96 잘 접시 485의 여기 파장에는 fluorometer를 사용 하 여 읽기 및 525의 방출 파장 nm.
참고: 네브라스카의 수준 흐름 cytometry 분석에서 PMN 수로 분할 되었다.
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Representative Results
우리 모두 DTT mucolysis 및 마이크로 분리 (그림 3A)와 투명 한 면역 세포 정지 달성. 마이크로 분리 수집 105 PMNs x 4.40 평균 (2.1 x 10 x 105 PMNs 5.604 n = 6) 기도 분 비 샘플에서 1,000-fold 희석 (50 mL 전체 볼륨) 깨끗 한 서 스 펜 션의 1 mL. 94.0 %PMNs 초기 희석제에 비해 (CD66b+/CD45+) 6 임상 샘플 작은 볼륨에서 지속적으로 복구 했다. 그러나, DTT mucolysis 메서드 보여 53.5% 복구 평균 중요 한 샘플--예제 유사 (30.8 96.0%) (그림 3B)입니다.
다음, elastase의 릴리스 상업 NE 분석 결과 키트 개념 증명으로 시험 되었다. 외부 자극 없이 mucolytic 메서드에 의해 준비 샘플 보여 높은 NE을 마이크로 메서드에서 샘플 보다 수준. PMA는 마이크로 mucolytic 분리 방법 NE 릴리스 하에서 결과 정지에 추가 되었습니다. 6 다른 환자에서 기도 분 비 샘플 각 방법을 테스트 했습니다. 면역 세포 마이크로 구분 제시 그대로 기능, 네브라스카의 양이 증가 보여주는 PMA 자극에 의해 해제. 다른 한편으로, 셀 mucolytic 분리 방법에 의해 준비 NE 릴리스 (그림 3C)의 일관성이 증가 보였다.
그림 1: 나선형 미세 장치 및 실험 설정. 사진 이미지 (A) 나선형 마이크로 및 (B) 소자의 유체 어댑터와 함께 조립. (C) 나선형 관성 마이크로 사용 하 여 폐쇄 루프 분리의 회로도. 원래 샘플 저수지로 다시 집중 하는 입자/셀 스트림 (IW 콘센트)를 재순환 하 여 면역 관련 세포는 mucin 집계를 포함 하는 배경 액체 동안 작은 볼륨에 집중 했다 그리고 사소한 Rbc 지속적으로 아야 콘센트에 연결 하는 폐기물 관을 통해 서 제거. (D) 실험 설정 및 10 µ m 입자 궤적 (녹색), 나선형 채널 (오른쪽 위)의 콘센트의 형광 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 기도 분 비 샘플 준비의 회로도. 임상 기도 분 비 버퍼 솔루션의 1000 x 볼륨에 기계적으로 분산 유도. 희석제 ~ 1 mL 분명 배경 가진 세포 현 탁 액의 결과로 마이크로 의해 집중 된다. 류 외., 저작권 (2017) 미국 화학 사회17허가 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 미세 분리 방법에 DTT mucolytic 방법의 대표적인 비교. (A) Tracheal 분 비 물 샘플 (왼쪽)와 미세 분리 후 현미경 이미지. (B) 원본과 결과 정지의 사진 이미지. (C) mucolytic 및 마이크로 메서드 사이 PMN 회수율의 비교. (D) 마이크로 PMA 자극 전후 DTT mucolytic 방법에 의해 분리 된 호 중구의 NE 출시의 비교. 북동 릴리스 미세 분리에서 샘플에 PMA에 의해 크게 촉발 되었다 (p < 0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
관성 마이크로 입자 및 셀의 크기5,18,,1920에 따라 마이크로 채널에서 특정 측면 위치에 지역화 합니다. 학장의 결합된 효과의 한 힘 및 곡선된 아닌, 큰 입자 또는 호 중구에 관성 리프트 힘을 끌어 (> 10 µ m) 있는 내부 채널 및 작은 입자, 점액 집계, 및 파편 6 보다 작은 µ m 위치 특정 흐름 속도에서 채널 밖에10,11,,1314조건.
그러나, 특히 때 입자의 분리 크기 범위 또는 관심의 셀 다른 셀/입자와 겹치는 마이크로를 사용 하 여 농도 분리의 복구 사이 교환이 이다. 정렬 된 입자와 셀의 높은 농도 달성 하기 위해 분리 범위 좁은 있어야 하며 각 샘플 실행;에 대 한 현미경 관찰과 미세 조정 이 관성 마이크로 기도 분 비 물 같은 유형이 다른 생체 인식에의 사용을 제한합니다.
여기, 우리가 시험관에서 분석 실험 폐쇄 루프 관성 마이크로 (그림 1B, C)를 사용 하 여에 대 한 임상 기도 분 비 물 샘플 준비 방법 소개. 입자/초점 콘센트를 통해 세포의 재순환에 의해 폐쇄 루프 작업 높은 농도 요인 및 높은 회수율을 달성. 그리고 아야 콘센트 폐기물 관으로 흐름 IW 콘센트는 원래 샘플 튜브를 지속적으로 먹인 다. 10 µ m 직경에서 보다 큰 셀 초기 샘플 튜브, 따라서, 배경 액체 폐기물 튜브를 제거 하는 동안 샘플의 셀 밀도 증가에 남아 있습니다. 높은 희석 속도 파편과 점액을 포함 하 여 배경 액체의 수 있습니다. 또한, 환자 샘플의 상태에 제안된 된 방법 수 균일 하 게 해리 하 고 면역 세포를 분리.
DTT 점액1,,2122셀 내용 구분 proteoglycan 집계에서 이황화 결합을 고대의 널리 mucin 세포의 용 해 버퍼입니다. 그러나, DTT 보도 백혈구 표면 항 원, 백혈구 기능2에 영향을 미칠 수 있는 방해 합니다. 우리의 연구, DTT 분리 되는 세포 내용 했다 일관 된 샘플, 걸쳐 비균일 mucolytic 효율성과 필터의 막힘 때문에. 이것은 더 작은 볼륨으로 초기 샘플 및 상대적으로 두꺼운 기도 분 비 샘플의 준비에 대 한 중요 한 된다. 다른 한편으로, 마이크로 사용 하 여 메서드는 셀 내용 다른 유형의 환자 샘플 (그림 3C)의 일관 된 복구를 사용할 수 있습니다. 그림 3B에서 같이, 우리가 일관 되 게 원래 샘플 상태, 즉, 피 묻은, 끈기, 또는 물에 깨끗 한 버퍼에서 기도 분 비의 셀 내용을 분리 수 있습니다. 종래의 방법에 비해, 제안된 된 방법에 더 적은 파편 다운스트림 생화학 분석에서 파편의 가능한 간섭 최소화 복구 된 샘플 합니다.
NE 릴리스 두 농축 방법 (그림 3D)으로 캡처된 호 중구의 기능적 무결성을 평가 하기 위해 시험 되었다. 호 중구 제거 외국 NE 통해 유기 분자 출시23,,2425. PMA는 일반적으로 체 외에호 중구26를 활성화 하는데 사용 됩니다. 세포는 마이크로 및 mucolytic (DTT) 방법에 의해 분리 50 자극 했다 PMA의 nM. 우리 인간의 기도 분 비 샘플 (P173, P174, P176, P177, P181, 및 P182 표시) 각 메서드를 테스트 합니다. 마이크로 의해 집중 샘플 모든 6 샘플에 대 한 PMA 자극에 의해 북동에 증가 보여주었다. 반면, DTT 처리 샘플의 유일한 3 PMA 자극 후 NE 활동 증가 유발 수 있습니다. 또한, DTT mucolytic 방법에 의해 분리 하는 호 중구 마이크로 의해 고립 된 호 중구 보다 훨씬 더 높은 초기 활동을 보여주었다. 이 결과 보였다 NE 기계의 가능한 화학 소요 표면의 중단 즉, 바인딩된 항2,3, 마이크로 메서드는 보존 측면에서 개선된 방법 건의 하는 DTT 균질 보다 호 중구 기능입니다. 제안 된 분리 방법 또한 자동이 고 완벽 하 게 포함 된 방식으로, 외부 환경의 잠재적인 위험 환자 샘플의 노출을 최소화 작동 합니다.
그러나, 제안된 된 방법에는 높은 유량과, 따라서, 안정적인 유체 연결 필요합니다. 또한, 연동 순환 펌프의 내재 변동으로 인해 IW 콘센트 차원 아야 콘센트 크기 보다 커야 합니다, 그리고 그렇지 않으면 처리량이 저하 될 수 있습니다. 우리는 순환 펌프 보다 안정적인 유량을 제공할 수 있는 경우 제안된 된 방법 보다 높은 처리량을 제공할 것입니다 기대 합니다.
임상 기도 분 비 물에서 호 중구 잡으려고 분리 프로토콜을 제공 함으로써이 연구에서 제시 하는 방법은 폐 렴, 천식, 낭 성 섬유 증, 호흡기 질환에 대 한 임상 연구의 범위를 확장할 것으로 예상 하 고 만성 폐쇄성 폐 질환입니다.
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Disclosures
저자는 여기에 설명 된 기술에 특허 출원을 제기 했습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH U24 샘플 살려주는 분석 결과 프로그램 (U24-AI118656) 뿐만 아니라 NIH/NIAID (R21AI119042)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
References
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