Summary
I denne forskning viser vi en etiket-fri neutrofile adskillelse metode fra kliniske luftveje sekreter med lukket kredsløb drift af spiral inertial mikrofluidik. Den foreslåede metode ville udvide klinisk in vitro- assays til forskellige luftvejssygdomme.
Abstract
Luftveje sekreter indeholder et stort antal immun-relaterede celler, fx, neutrofiler, makrofager og lymfocytter, som kan bruges som en stor ressource til at evaluere en række forskellige lungesygdomme, både til forskning og kliniske formål. Men på grund af de heterogene og tyktflydende karakter af patient slim, der er i øjeblikket ingen pålidelig dissociation metode, der ikke skader vært immunceller i patientens luftveje sekretion. I denne forskning introducere vi præparationsmetode stikprøve, der bruger inertial mikrofluidik for patientens immunforsvar vurdering. Uanset de heterogene fluidic egenskaber af de kliniske prøver, den foreslåede metode genindvinder mere end 95% af neutrofiler fra luftvejene sekretion prøver, der er fortyndet 1.000-fold med milliliter af rent saltvand. Af recirkulerende koncentreret outputstream til den oprindelige stikprøve reservoir, leveres en høj koncentration, recovery og renhed af immunceller; recirkulation anses et trade-off for single-run sprøjte-baseret funktion inertial mikrofluidik. Lukket kredsløb driften af spiral mikrofluidik giver leukocytter uden fysiske eller kemiske forstyrrelser, som det fremgår af phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA)-induceret elastase frigivelse af sorterede neutrofiler.
Introduction
Da cellerne er indkapslet i en stor mængde slim i luftvejene sekreter, er funktionel vurdering af leukocytter ved en in vitro- assay blevet forhindret. Dithiothreitol (DTT) er den mest almindelige lysisbuffer at adskille og homogeniseres sputum cytologiske analyse og påvisning af mæglere samtidig tolerable levedygtighed af isolerede celler1,2. Dog kan DTT interferere med overflade-bundet antigener af luftvejene neutrofiler, hvilket resulterer i afbrydelse af neutrofile funktion såsom elastase og myeloperoxidase (MPO) frigive2,3. Derfor er få undersøgelser af menneskers luftveje neutrofile funktion blevet gennemført med perifert blod neutrofiler, som ikke kan afsløre de fysiologiske egenskaber af pulmonal4. I mellemtiden, inertial mikrofluidik har gjort fremskridt i isolere celler fra forskellige patient biomatrices5,6. Ligevægt mellem inertial lift styrker og Dean træk justerer partikel/celle efter deres størrelse, som giver mulighed for etiket-fri partikel adskillelse7. Vores gruppe tidligere indført præparationsmetode prøve for cirkulerende tumor celler8,9, patogener i blod8, celler fra en suspension kultur10,11, 12, og polymorfnukleære leukocytter (PMNs) fra blod13,14.
Her introducerer vi en protokol for at forberede immun celler fra patientens luftveje sekreter med lukket kredsløb inertial mikrofluidik for en downstream i vitro assay, såsom neutrofile elastase (NE) assay. Denne metode giver både høj koncentration og nyttiggørelse, især når der findes en betydelig overlapning i lateral retning af den celle/partikel hvorfra den celle/partikel-af-interesse er at blive fjernet, der er almindeligt observeret i kliniske prøver. Af recirkulerende indre væg (IW)-fokuseret store partikler eller celler tilbage til input prøveglas, partikel eller celle-af-interesse koncentrerer sig i den oprindelige reservoir, mens baggrunden væsker med små mucin aggregater passere gennem affald reservoiret. Trods de heterogene fluidic egenskaber af kliniske prøver, den foreslåede metode genopretter konsekvent over 95% af neutrofiler fra luftvejene sekretion prøver, der er fortyndet 1.000-fold med en ren saltvandsopløsning (~ 1 mL). Derimod præsenterer metoden lysis en bred vifte PMNs genfindingsprocent afhængigt af prøven tilstand. Den foreslåede protokol indfanger leukocytter i en etiket-fri måde med ingen fysiske eller kemiske forstyrrelser, som giver mulighed for at høste sarte celler fra klinisk udfordrende biometri med minimalt invasive procedurer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samlingen prøven blev godkendt af University of Pittsburgh institutionelle Review Board (IRB # PRO16060443, PRO10110387). Alle forsøg udføres under en biosikkerhed kabinet med de korrekte personlige værnemidler.
1. enhed fabrikation og bløde litografi
Bemærk: Standard bløde litografi teknikker15,16 blev brugt til at oprette Polydimethylsiloxan (PDMS) microchannel.
- Bland PDMS forløber i forholdet 10:1 base og hærdning agent.
- Hæld 30 g af PDMS forløber blanding på mikro-bearbejdet aluminium mold (Se figur 1 for dimensioner) og 20 g af PDMS forløber blandingen på 100 mm petriskål.
Bemærk: Petriskålen bruges til at lave den tyk film af PDMS (~ 3 mm) for det bærende lag. Det bærende lag af PDMS giver ensartede fysiske overflade egenskaber i hele mikrofluidik. Alternativt, en tynd PDMS film på glas dias kan bruges. Den master mold med specifik kanal dimensioner var designet og fremstillet af mikro-fræsning i aluminium arket. Den spiral kanal anvendes i denne undersøgelse var en 8-loop spiral microchannel med et indløb og to forretninger, med radius stiger fra 8 mm til 24 mm for effektiv størrelse-baseret adskillelse. - Placere formen og petriskålen i et vakuum ekssikkator til degas indtil ingen bobler er synlige på overfladen, typisk 5-10 min. Brug en hus-vakuum for ekssikkatoren.
- Frigive vakuum og sted formen og petriskålen i en 90 ° C ovn i 1 time.
Bemærk: En kogeplade eller andre varme værktøjer kan bruges i stedet for en ovn. - Fjern formen og petriskålen fra ovnen og lad det køle til stuetemperatur i 10 min.
- Forsigtigt skære konturen og punch væske adgang huller på enheden ved hjælp af en 2 mm puncher.
Bemærk: Størrelsen af punchen kan variere afhængigt af størrelsen af de rørledninger eller væske guide. - Overholder et bånd til kanal siden af enheden og tyk film af PDMS, og skræl forsigtigt med pincet til at fjerne støv.
- Behandle begge kanal siden af indretning og almindeligt PDMS med luft plasma og obligation med det rede bærende lag af plain PDMS (figur 1A).
- Placer en chip på 50 mm x 70 mm glas dias og placere det i en 70 ºC ovn i mindst 30 min til at forbedre bonding styrken.
2. trakeal sekretion samling fra mekanisk ventilerede patienter
Bemærk: Trakeal sekret kan være fremstillet af mekanisk ventilerede patienter under normal rutinemæssig luftvejs pleje ved hjælp af en protokol, der er ændret i forhold til konventionelle metoder til at rumme standard, voksen ventileret patienten. Prøver var de identificeret og sendes straks til forarbejdning.
- Hvis trakeal aspiration er angivet, skal du bruge et kateter til at udtrække luftveje sekreter.
- Rykke kateteret omhyggeligt halvvejs ind i den endotrakealtube og indgyde 5 mL 0,9% sterilt normale saltvand fra en fyldt 10 mL sprøjte.
- Når kateteret er avanceret fuldt, eller modstand er opfyldt, Aspirér sekreter og indsamle i en steril sputum samling beholder.
- Indsamle 10 mL af luftrør sekret i en steril sputum container og placere den på is. Sende prøver straks til forarbejdning.
3. trakeal sekretion prøveforberedelse
Bemærk: Alle forsøg skal udføres under en biosikkerhed kabinet med de korrekte personlige værnemidler.
- Sprede 1 mL af luftvejene udskillelse prøverne i 9 mL fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved hjælp af en plast 10 mL sprøjte (for en 10 x fortynding). Brug en stump pipette til at homogenisere Slim prøven.
- Stamme fortyndingsvæsken med en 40 µm nylon celle si at fjerne store bidder eller blodpropper, som kan blokere mikrofluidik adgang hul eller kanalen. Prøven anbringes på is efter forarbejdning.
- Sprede fortyndingsmiddel af hver prøve ved hjælp af en 100 x mængden af PBS buffer, hvilket resulterer i en 1.000 x fortyndet suspension. Prøven anbringes på isen under handlingen hele dissociation.
4. eksperimentel opsætning
Bemærk: Alle forsøg skal udføres under en biosikkerhed kabinet med de korrekte personlige værnemidler.
- Samle PDMS chip med væske guide at anvende ensartet flow til hver af de fire spiral microchannels (figur 1B).
Bemærk: Fire kanaler blev brugt til at øge overførselshastigheden af parallelization, samt optimering af volumen og celle tætheden af den resulterende suspension. Den flydende guide er designet og fremstillet med en stereolithography type 3D printer med klare harpiks. Indløbet og udgangsporten af væske guide bruger kvindelige Luer stik for at lette forbindelsen og stabil forsegling under operationen. - Tilslut en 1/16-tommer mandlige Luer stik til fjorden, den indre stikkontakt (IW) og ydre væg (OW) udgangsporten af væske guide og Tilslut en silikoneslanger til prøven suspension.
- Indsæt stump tips til hver ende af fjorden og forretninger at nå bunden af prøven reservoir.
- Tilslut den peristaltiske pumpe med inlet-slangen.
- Placer ende af fjorden rør og IW outlet rør i stikprøven reservoir og placere slutningen af OW outlet rør i den affald reservoir (figur 1 c, D).
- Placer 50 mL tube filtrerede PBS uden calcium og magnesium i prøven reservoir.
- Begynde at pumpe på en lav gennemstrømningshastighed (~ 1 mL/min.) til prime enheden.
Bemærk: Når boblerne er fanget i den engelske kanal, skubbe toppen af kanalen med pincet til at destabilisere og fjerne luftbobler. Når enheden er fuldt fyldt med bufferopløsning, ændre PBS røret for at forberede luftvejene sekretion prøveglas. - Når prøven placeres i stikprøven reservoir, tænd den peristaltiske pumpe og indstille flowet på 4 mL/min. (figur 1 c, D).
- Når prøven volumen når den udpegede volumen (~ 1 mL), stoppe driften og afbryde silikoneslanger.
Bemærk: Den foreslåede metode er mere effektive til at reducere en stor mængde af det fortyndingsmiddel (> 50 mL) til en micro-centrifugerør volumen (~ 1 mL) (figur 2).
5. strømmen flowcytometri analyse
Bemærk: Hvis du vil sammenligne dissociation metoder (mikrofluidik og lysis), flowcytometri med immunofluorescens blev brugt.
- Tilføje fluorescein isothiocyanat (FITC) - konjugeret mus-anti-humant CD66b monoklonalt antistof og allophycocyanin (APC) - konjugeret mus-anti-humant CD45 monoklonalt antistof til indledende suspensioner (trin 3.3) og deraf følgende suspensioner (trin 4.9) (200 µL hver antistof) i forholdet 1:25 v/v.
- Inkuber prøver ved 4 ° C i mørke i 30 min.
- Analysere begge prøver på en flow forskellige at kvantificere PMNs.
Bemærk: Den befolkning, der er FITC-APC dobbelt positive, CD66b positive og CD45 positive blev anset for at være neutrofiler. Recovery blev beregnet som forholdet mellem cellen total antal input og den resulterende suspension.
6. NE Release analyse
Bemærk: For at sammenligne funktionaliteten af den isolerede neutrofile af metoden mikrofluidik og lysis en NE assay kit blev brugt.
- Tilføje PMA (findes i analysen kit) til hver resulterende suspension (fremstillet ved trin 4.9) til en slutkoncentration på 50 nM.
- Inkuber prøver ved 37 ° C i 2 timer.
- Der centrifugeres suspensioner ved 300 x g i 10 min.
- Overfør 10 µL af hver supernatanten til en 96-brønd plade (findes i analysen kit).
Bemærk: En 96-brønd mikrotiterplade med en flad bund og sort polystyren kan bruges som godt. - Tilføje 90 µL fortyndede analysebuffer (findes i analysen kit) til hver brønd.
- Tilsæt 10 µL af elastase substrat (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, findes i analysen kit).
- Inkuber i 1,5 timer ved 37 ° C.
- Læs den 96-brønd plade ved hjælp af en fluorometer på en excitation boelgelaengden 485 nm og en emission boelgelaengden 525 nm.
Bemærk: Niveau af NE blev divideret med PMN Greven fra flow flowcytometri analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi opnåede gennemsigtig immun-celle suspensioner med begge DTT mucolysis og mikrofluidik dissociation (figur 3A). Mikrofluidik dissociation indsamlet 4.40 x 105 PMNs i gennemsnit (2.1 x 104 til 5,60 x 105 PMNs, n = 6) fra luftvejene sekretion prøverne fortyndes 1.000-fold (50 mL samlede volumen) i 1 mL ren suspension. I forhold til den oprindelige fortyndingsmiddel, 94.0% PMNs (CD66b+/CD45+) blev genfundet i en lille mængde, konsekvent over 6 kliniske prøver. Men metoden DTT mucolysis viste en 53,5% genanvendelse i gennemsnit med betydelig prøve til prøve variationer (30,8-96,0%) (Figur 3B).
Dernæst blev udgivelsen af elastase undersøgt med en kommerciel NE assay kit som en proof of concept. Uden eksterne stimulation, den prøve, der tilberedes af metoden slimløsnende viste en højere NE niveau end prøve fra metoden mikrofluidik. PMA blev føjet til de resulterende suspensioner fra både mikrofluidik og slimløsnende dissociation metoder til at udløse den NE udgivelse. Vi har testet hver metode med luftvejene udskillelse prøverne fra 6 forskellige patienter. Immunceller adskilt med mikrofluidik præsenteret intakt funktionalitet, viser en øget mængde af NE frigivelse af PMA stimulation. På den anden side celler udarbejdet af metoden slimløsnende dissociation viste en inkonsekvent stigning på NE release (figur 3 c).
Figur 1: Spiral mikrofluid enhed og eksperimenterende indstillinger. Fotografere billeder af (A) spiral mikrofluidik og (B) enheden samlet med fluidic adapteren. (C) skematisk diagram over lukket loop adskillelse ved hjælp af spiral inertial mikrofluidik. Af recirkulerende partikel/celle koncentreret stream (IW outlet) tilbage til den oprindelige stikprøve reservoir, immun-relaterede celler var koncentreret i en lille mængde mens baggrunden væske indeholdende mucin aggregater og mindre RBC blev løbende fjernet gennem den affald rør tilsluttet OW outlet. (D) eksperimentel opsætning og fluorescerende billedet af en 10 µm partikel, bane (grønne) og outlet af spiral kanal (øverst til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk diagram af luftvejene sekretion prøveforberedelse ved hjælp af lukkede kredsløb inertial mikrofluidik. Klinisk induceret luftvejene sekretion spredt mekanisk i 1.000 x mængde stødpudeopløsning. Fortyndingsvæsken er koncentreret af mikrofluidik, hvilket resulterer i ~ 1 mL cellesuspension med klare baggrunden. Tilpasset med tilladelse fra Ryu et al., Copyright (2017) American Chemical Society17. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative sammenligninger af DTT slimløsnende metode til metoden mikrofluid dissociation. (A) trakeal sekreter prøve (venstre) og mikroskopiske billede efter mikrofluid dissociation. (B) fotografisk billede af de oprindelige og deraf følgende suspensioner. (C) sammenligning af PMN genfindingsprocent mellem metoderne slimløsnende og mikrofluidik. (D) sammenligning af NE udgivelse af adskilte neutrofiler mikrofluidik og DTT slimløsnende metoder før og efter PMA stimulation. NE frigivelse var betydeligt udløst af PMA på prøve fra mikrofluid adskillelse (p < 0,0001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I inertial mikrofluidik lokalisere partikel og celler på en bestemt lateral position i en mikro-kanal er baseret på deres størrelse5,18,19,20. På grund af den kombinerede effekt af dekanen træk kraft og inertial lift kraften i buede microchannel, store partikler eller neutrofile (> 10 µm) er placeret inde i kanal og små partikler, Slim aggregater og snavs mindre end 6 µm er placeret uden for kanalen på visse strømningshastighed betingelser10,11,13,14.
Men der er et trade-off mellem koncentration og inddrivelse af adskillelse ved brug af mikrofluidik, især når adskillelse størrelsesområde for partikel eller cellen i interesse overlapper med andre celler/partikler. For at opnå en høj koncentration af sorterede partikler og celler, rækken adskillelse skal være smalle og kræver en finjustering med mikroskopiske observation for hver prøve køre; Dette begrænser brugen af inertial mikrofluidik på heterogene biometri, såsom luftveje sekreter.
Her introducerer vi en klinisk luftveje sekreter prøve forberedelse metode til in vitro- assays ved hjælp af lukkede kredsløb inertial mikrofluidik (figur 1B, C). Handlingen lukket kredsløb ved recirkulation af partikel/celle gennem en fokusering outlet opnået både høj koncentration faktorer og høj genfindingsprocent. OW outlet flyder ind i affald røret, og IW outlet føres kontinuerligt til den oprindelige prøveglas. Celler større end 10 µm i diameter forbliver i den oprindelige stikprøve rør, således øge celle tæthed af prøven, mens baggrund væsken er elimineret til affald røret. Høj fortynding sats tillader clearance af baggrunden væske, herunder debris og slim. Også, uanset tilstand af patienten prøve den foreslåede metode kan ensartet adskille og isolere immunceller.
DTT er en udbredt mucin lysisbuffer, der kløver disulfid obligationer i proteoglycan sammenlægning til at adskille celleindhold af planteslim1,21,22. Dog griber DTT efter sigende ind i de hvide blodlegemer overflade antigener, som kan påvirke leukocyt funktion2. I vores undersøgelse blev cellulære indholdet inddrives af DTT dissociation inkonsekvent eksempler, på grund af uensartet slimløsnende effektivitet og tilstopning af filteret. Dette bliver mere kritisk for udarbejdelsen af indledende prøver med små mængder og forholdsvis tyk luftvejene udskillelse prøverne. På den anden side aktiveret metoden ved hjælp af mikrofluidik konsekvent inddrivelse af celleindhold i heterogene patientprøver (figur 3 c). Som vist i figur 3B, kunne vi konsekvent isolere celleindholdet af luftvejene sekretion i en ren buffer uanset den oprindelige stikprøve tilstand, dvs, blodige, vedholdende eller våde. Sammenlignet med den konventionelle metode, har den foreslåede metode mindre snavs i den gendannede prøve, som minimerer mulige indblanding af vragrester i downstream biokemiske analyser.
NE udgivelse blev undersøgt for at vurdere den funktionelle integritet af erobrede neutrofiler ved begge berigelse metoder (figur 3D). Neutrofiler fjerne udenlandske organiske molekyler gennem NE frigive23,24,25. PMA er almindeligt anvendt til at aktivere neutrofiler in vitro-26. Celler isoleret af mikrofluidik og metoderne slimløsnende (DTT) blev stimuleret med 50 nM af PMA. Vi har testet hver metode med menneskers luftveje udskillelse prøverne (mærket som P173, P174, P176, P177, P181 og P182). Prøver koncentreret af mikrofluidik viste en stigning i NE af PMA stimulation for alle 6 prøver. Derimod kunne kun 3 af DTT behandlet prøver fremkalde øget NE aktivitet efter PMA stimulation. Derudover neutrofiler isoleret af metoden DTT slimløsnende viste meget højere baseline aktivitet end neutrofiler isoleret af mikrofluidik. Disse resultater viste mulige kemiske forstyrrelser af den NE maskiner, dvs., afbrydelse af overfladen bundet antigen2,3, hvilket tyder på, at metoden mikrofluidik er en forbedret metode med hensyn til bevarelse af de neutrofile funktion end DTT homogenisering. Den foreslåede dissociation metode også opererer i en automatiseret og fuldt indeholdt måde, minimere eksponering af patientprøver med potentielle farer af det ydre miljø.
Den foreslåede metode kræver imidlertid en høj gennemstrømning og dermed en stabil fluidic forbindelse. Også, på grund af den iboende udsving i den peristaltiske cirkulationspumpe, IW outlet dimension skal være større end OW outlet dimensionen, ellers overførselshastighed kan være kompromitteret. Vi forventer, at den foreslåede metode vil give højere overførselshastighed, hvis der er en cirkulationspumpe, der kan give en mere stabil strømningshastighed.
Ved at give en dissociation protokol for at fange neutrofiler fra kliniske luftveje sekreter, er metoden præsenteret i denne undersøgelse forventes at udvide anvendelsesområdet for klinisk forskning i lungesygdomme, såsom lungebetændelse, astma, cystisk fibrose, og kronisk obstruktiv lungesygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har indgivet en patentansøgning på den teknologi, der er beskrevet her.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH/NIAID (R21AI119042) samt NIH U24 prøve besparende assay program (U24-AI118656).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
References
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, Suppl 4. 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D.
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
