Summary
Vi præsenterer her, en protokol for forberedelse og stereotaxisk administration af allogene humane lymfocytter i immundefekte mus transporterer orthotopic menneskelige primær hjernetumorer. Denne undersøgelse giver et proof-of-concept for både gennemførligheden og den antitumor effekt af intrabrain-leveret cellulære immunoterapi.
Abstract
Glioblastom multiforme (GBM), den mest hyppige og aggressive primære hjerne kræft hos voksne, er generelt forbundet med en dårlig prognose, og knappe effektive behandlingsformer har været foreslået i det sidste årti. Blandt de lovende kandidater til at designe nye terapeutiske strategier, cellulære immunoterapi har været målrettet for at fjerne meget invasiv og kemo-radioresistant tumorceller, sandsynligvis involveret i en hurtig og fatal tilbagefald af denne kræft. Således administrationer af allogene GBM-reaktiv immun celle effektorer, såsom menneskelige Vϒ9Vδ2 T-lymfocytter, i nærheden af tumor vil repræsenterer en enestående mulighed for at levere effektiv og koncentreret terapeutiske agenter direkte ind i den site af hjernen maligniteter. Vi præsenterer her, en protokol for forberedelse og stereotaxisk administration af allogene humane lymfocytter i immundefekte mus transporterer orthotopic menneskelige primær hjernetumorer. Denne undersøgelse giver en prækliniske proof-of-concept for både gennemførligheden og den antitumor effekt af disse cellulære immunoterapi, der er afhængige af stereotactic injektioner af allogene humane lymfocytter i intrabrain tumor senge.
Introduction
GBM (der klasse IV astrocytoma), er den mest hyppige og aggressive primære hjerne kræft hos voksne. På trods af aggressive behandlinger, der kombinerer kirurgi og radio-kemoterapi, forbliver GBM forbundet med en meget dårlig prognose (median overlevelse på 14,6 måneder og en 2-årsmortalitet > 73%)1. Dette er beviset interstatslig handelspraksis at få effektive terapeutiske fremskridt er blevet valideret over de sidste ti år2. Blandt kandidaterne til design af mere effektive terapeutiske strategier3,4,5udforskes immunoterapi6 i øjeblikket for at spore og fjerne meget invasiv og radio/kemo-resistente tumor celler, mistænkt for deres vigtige bidrag til hurtig og fatal tumor tilbagefald7. Forskellige potentielle immunologiske mål blev identificeret og foreslåede for immunoterapi, der involverer fysiske eller modificerede αβ eller ϒδ T lymfocytter GBM-specifikke tumor antigener eller stress-induceret molekyler8,9, 10. Mulighed for at administrere valgte GBM-reaktiv immun celle effektorer repræsenterer en enestående mulighed for at levere forhøjede mængder af effektor lymfocytter direkte i stedet for resterende malignitet. For at støtte denne strategi, har vi for nylig vist, at modeller baseret på immundefekte mus transporterer orthotopic primære menneskelige GBM xenografts trofast sammenfatte udviklingen af hjernetumorer i GBM patienter9,11. Desuden, disse modeller blev brugt til at vise den stærke antitumor effektiviteten af adoptively overførte allogene menneskelige Vϒ9Vδ2T lymfocytter.
Denne protokol beskriver de kritisk eksperimenterende trin for at opnå stereotactic immunoterapi af hjernetumorer, såsom GBM, baseret på adoptiv overførsel af allogene T-lymfocytter. Artikel viser: (i) forstærkning af terapeutiske allogene immun effektor T-lymfocytter, såsom menneskelige Vϒ9Vδ2T lymfocytter; (ii) udarbejdelse af disse effektor T lymfocytter til injektion; (iii) proceduren for stereotactic administration i hjernen, i nærheden af svulsten. Denne artikel giver også indsigt i funktionen af disse cellulære effektorer efter stereotactic injektion.
Den terapeutiske tilgang præsenteres her er baseret på indsprøjtning af 20 x 106 effektor-celler pr. dosis for hver hjerne tumor-bærende immundefekte mus. En første i vitro ekspansion skridt er forpligtet til at producere store mængder af immunceller. Derfor, ikke-specifik celle udvidelser udføres ved hjælp af phytohemagglutinin (PHA-L) og bestrålet allogene feeder celler: perifert blod mononukleære celler (PBMC) fra raske donorer og Epstein Barr Virus EBV-transformeret B-lymphoblastoid celle linjer (BLCLs), stammer fra PBMC ved in vitro- infektion med EBV-holdige kultur supernatanten fra linjen silkeabe B95-8 celle, i nærværelse af 1 µg/mL ciclosporin-A.
GBM-reaktiv effektor immunceller sammenholdes og valgt fra in vitro- assays9. Disse effektor celler er aktiveret og forstærkes ved hjælp af standardprotokoller, ifølge deres natur (f.eks., human Vγ9Vδ2 T lymfocytter9 eller menneskelige anti-herpes virus αβ T lymfocytter12) med en Minimumsrenhed på > 80%, som rutinemæssigt kontrolleret af cytometric analyse. Celle ekspansion proceduren beskrevet nedenfor gælder for forskellige menneskelige lymfocyt delmængder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De følgende procedure der involverer dyrs emner blev udført efter institutionelle retningslinjer (aftale #00186.02, regionale etiske komité i Pays de la Loire [Frankrig]). Menneskelige PBMC blev isoleret fra blod indsamlet fra informeret raske donorer (Etablissement Français du Sang Nantes, Frankrig). Alle trin er udført under sterile forhold.
1. ikke-specifikke udvidelse af cytotoksiske effektor T lymfocytter
- Forberede og bestråle feeder celler på 35 Gy. Stimulering af 2 x 105 - 4 x 105 effektor celler, forberede 10 x 106 PBMC og 1 x 106 BLCLs fra tre særskilte, raske donorer.
- Resuspend både feeder celler og effektor celler med 15 mL RPMI suppleret med 10% varme-inaktiverede FCS, 2 mM L-glutamin, penicillin (100 IE/mL), og streptomycin (0,1 µg/mL) og 300 IU/mL rekombinant IL-2.
- Tilføje PHA-L i en endelig koncentration på 1 µg/mL, blandes omhyggeligt og distribuere 150 µL af cellesuspension pr. brønd i 96-brønd rundbundede plader.
- Der inkuberes ved 37 ° C og med 5% CO2 i en fugtig atmosfære.
- Dagligt tjek pladen indtil store celle klumper form i kultur wells (~ dag 7).
- Overføre cellerne i en kultur målekolbe på 1 x 106 celler/mL i frisk næringssubstratet.
- Bestemme den samlede celle nummer ved at tælle (2 x om ugen) og vedligeholde dem på 1 x 106 celler/mL i frisk næringssubstratet.
Bemærk: Effektor immunceller skal være klar til den terapeutiske administration på en hvilende tilstand (normalt 3 uger efter første forstærkning stimulus). Renhed og reaktivitet af disse effektor celler skal være kontrolleret før i vivo injektioner (f.eks.med in vitro- assays).
2. præ-operativ effektor celler forberedelse
- Efter at have kontrolleret effektor celletal, indsamle effektor cellerne i en 50 mL tube ved centrifugering (300 x g for 5 min).
Bemærk: For at kompensere for tab, forberede et overskud af celler (f.eks., 50 x 106). - Forsigtigt fjerne supernatanten og resuspend celler i 15 mL steril PBS og centrifugeres i 5 min. ved 300 x g til at udføre vask.
- Omhyggeligt og helt fjerne supernatanten og derefter resuspenderes celle i 1 mL steril PBS.
- Overføre de resuspenderede celler i en 1,5 mL microtube til centrifugering ved 300 x g i 5 min.
- Omhyggeligt og helt Fjern supernatanten ved pipettering langsomt.
- Resuspenderes celle i 8 µL sterilt PBS pr. mus.
Bemærk: Dette er et kritisk skridt. - Måle volumen af cellesuspension ved hjælp af en mikropipette. Om nødvendigt tilføje steril PBS (20 x 106 celler i 15 µL af PBS pr. dosis) og blandes omhyggeligt.
- Check, ved hjælp af en mikropipette, at det endelige rumfang pr. mus er mellem 15 og 20 μL (nødvendigvis < 20 µL).
- Hold celler på is indtil stereotactic injektion.
Bemærk: mere end 3-h timepoints var ikke testet.
3. stereotactic injektion
-
Udstyr set-up
- Samle og kalibrere et lille dyr stereotactic ramme ifølge producentens anvisninger til at sikre nøjagtigheden af intrakranielle injektioner (f.eks., sprøjte størrelse, ønskede volumen og hastighed af indsprøjtning).
Bemærk: En langsom infusion sats anbefales (dvs.2-3 µL/min). - Installere materiale under en mikrobiel sikkerhed kabinet (MSC) at bevare steriliteten af instrumenterne og beskytte mus fra infektioner.
Bemærk: sted "isotermisk blokke" i et vandbad ved 37 ° C. Dette system begrænser hypotermi af mus under operationen. Varme puder, som er nødvendige for post proceduremæssige pleje, må bruges under kontinuerlig temperaturovervågning.
- Samle og kalibrere et lille dyr stereotactic ramme ifølge producentens anvisninger til at sikre nøjagtigheden af intrakranielle injektioner (f.eks., sprøjte størrelse, ønskede volumen og hastighed af indsprøjtning).
-
Præoperativ animalske forberedelse
- Bedøver en mus med en intraperitoneal injektion af ketamin (10 mg/mL) og xylazin (0,1 mg/mL) på 10 µL/g kropsvægt af musen.
- Udføre en tå knivspids test for at sikre komplet anæstesi og analgesi af dyret.
Bemærk: Enhver bevægelse er en angivelse af ikke-dyb analgesi og, hvis det sker, et par minutter er nødvendig før du gentager handlingen. - Når musen er korrekt bedøvede, bruge saks til at fjerne skind fra operationsstedet (mellem de to ører, op til næsen).
-
Præoperativ celle forberedelse
- Omhyggeligt resuspend celler med en pipette (flere gange) før hver injektion til at forhindre enhver celle sammenklumpning.
- Forsigtigt trække den krævede suspension cellevolumen (15-20 µL) i 22-G mikrosprøjte at undgå aspiration af bobler.
Bemærk: Denne celle-loading skridt ind i mikrosprøjte er vigtigt at minimere afvigelser i injicerede mængder. Genindlæs celler for hver enkelt injektion mellem procedurer til at forhindre enhver celle sammenklumpning og sikre et lige antal effektor celler administration i kohorten. - Anbring sprøjten i tilpasset sprøjten pumpe.
-
Proceduremæssige pleje
- Desinficere operationsstedet med swabs vædet i povidon-jod 5% opløsning mindst 3 x.
- Placer en smørende oftalmologiske salve i musens øjne til at forhindre enhver udtørring af hornhinder.
- Position bedøvede musen på stereotactic rammen, på en varm isotermisk blok dækket med en steril plastikfolie at holde musens temperatur under operation og begrænse dødeligheden.
Bemærk: Musens næse og tænder bør være korrekt placeret over tand bar, at sikre passende respiratorisk flow under proceduren. - Når musen er placeret over linjen tand, stramme øre barer fast under musens ører til at immobilisere hovedet.
Bemærk: Vær forsigtig, ikke skader trommehinder eller at kompromittere respiration. - Gøre en 1-2 cm midterlinjen sagittal hud indsnit med steril saks langs den øverste del af kraniet fra forreste til bageste at eksponere kraniet.
- Identificere skæringspunktet mellem de sagittal og koronale suturer (Bregma) kan fungere som pejlemærker for stereotactic lokalisering inden injektion (vist i figur 1).
- Sted mikrosprøjte over dette punkt.
- Flytte mikrosprøjte 2 mm højre laterale og 0,5 mm forreste af Bregma.
- Ved hjælp af en microdrill, lave et lille hul i kraniet med en steril borehoved forudbestemt koordinater. Vær omhyggelig med at forblive overfladisk for at undgå enhver traumatisk skade i hjernen.
Bemærk: I denne protokol, immun celler blev injiceret i en etableret tumor (en uge efter tumor celle indsprøjtning). Huden skal være genåbnet (AR) og injektionen udføres på de samme koordinater bruges til tumor celle implantation (hullet er generelt stadig til stede op til 2 uger efter injektionen). Koordinater blev udvalgt til indsprøjtning tumor og effektor celler i hjernen parenkym13,14.
-
Indsprøjtning af immun effektor celler
- Omhyggeligt indsætte mikrosprøjte i det borede hul, og bevæger sig langsomt, videresende nål 3 mm ned i dura og derefter bagud 0,5 mm til en endelig dybde 2,5 mm før injektion effektor celler.
- Køre effektor celle indsprøjtning på 2-3 µL/min og overvåge mus langs injektion tid.
- Når injektionen er færdig, hæve nålen for kun 1 mm og holde Mikrosprøjte på plads til et ekstra minut før langsomt trække helt mikrosprøjte, for at forebygge enhver lækage fra webstedet infusion.
Bemærk: Efter fjernelse af dyr fra den stereotactic enhed, ren straks injektion udstyr til kommende eksperimenter.
-
Postoperativ pleje og opfølgning på mus
- Fjerne dyret fra stereotactic rammen og straks anvende povidon-jodopløsning 5% på webstedet indsnit og lukke huden med en passende kirurgisk sutur.
- Anvende 2% lidokain gel direkte på såret og administrere 0,15 µg/g med buprenorphin ved en subkutan injektion for post proceduremæssige analgesi.
- Sted tilbage bedøvede musen til sit bur over en varmepude sat til 37 ° C for at opretholde en passende mus kropstemperatur og undgå enhver hypotermi.
Bemærk: Separat bolig er ikke nødvendigt. - Overvåge musen, indtil det er fuldt tilbagebetalt fra anæstesi og overføre det til en bolig værelse.
Bemærk: Til dato, denne protokol er godt understøttet, da få uforudsete komplikationer er opstået (< 5% af injicerede mus). - Dagligt overvåge mus og aflive dem når faldende sundhed tegn observeres (f.eks., foroverbøjet kropsholdning, bevægelseshæmmede, udmattelse eller omfattende vægttab [≥ 15%]).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne undersøgelse beskriver strategi med adoptiv overførsel af cellulære immun effektor celler i hjernen tumor-bærende mus, baseret på stereotactic injektioner udføres direkte i tumor seng.
For at minimere enhver risiko for hjerneskade er forbundet med en stor Injektionsvolumen, skal effektor cellesuspension koncentreres (20 x 106 celler i 15-20 µL af PBS). For at kontrollere, om denne celle koncentration trin kan påvirke levedygtigheden af effektor celler, blev disse celler udarbejdet efter den beskrevne protokol og indlæst i mikrosprøjte. Effektor celler blev indsamlet straks, eller 10 min efter indlæses i mikrosprøjte. Cellerne var farves med propidium Iodid (PI), en fluorescerende DNA intercalating agent, ikke der er permeant til levende celler og analyseret ved flowcytometri på forskellige timepoints (0, 24 og 72 timer). Resultaterne viser, at forberedelse og læsning i mikrosprøjte ikke væsentligt påvirker levedygtigheden af effektor celler i mindst 24 timer (figur 2A og 2B). På 72 timer konstateredes en lille, men væsentlig, stigning af PIpositive celler (14% i forhold til 11% for losset celler). På en lignende måde, blev den antitumor reaktivitet af effektor celler, der er udarbejdet og vedligeholdes på is i 3 timer analyseret. Effektor celler blev cocultured med hjerne tumorceller i 4 timer i tilstedeværelse af en anti-CD107a mAb. Opregulering af aktivering markør CD107a, svarer til den værdi i kontrolelementet betingelser, angiver, at reaktiviteten af effektor celler ikke påvirkes af forberedelse og læsning i mikrosprøjte (figur 2 c).
For at vurdere, om effektor celler overleve og flytte i hjernen parenkym efter deres samhandel tumorsygdomme implantation, 20 x 106 effektor injiceres celler i tumor site af mus transporterer en hjernetumor (GBM-111). En uge senere, blev hjerner indsamlet, faste, sektioneret og farvede for hæmatoxylin og eosin safran farvning (HES) og anti-menneskelige CD3 mAb (IHC). HES farvning identificeret struktur af hjernetumorer (figur 3, venstre panel). CD3 farvning identificeret og lokaliseret effektor immune T-lymfocytter (her, menneskelige Vϒ9Vδ2 T-celler) (figur 3, højre panel). Interessant, blev effektor T lymfocytter opdaget omkring tumor (figur 3, øverste højre panel), i tumor core (figur 3, midterste højre panel), men også i de kontralaterale halvkugle (figur 3, nederste højre panel). Desuden blev funktionen af humane T lymfocytter isoleret fra mus hjernen 48 timer efter deres injektion (4 x 106 αβ T celler), der udgør 2% af hjernecellerne, analyseret. Resultaterne viser at indsamlede hjerne-indsprøjtning effektor allogene αβ T celler udvide og formere sig ved en ikke-specifik PHA-feeder celler aktivering udføres i nærværelse af IL-2 (figur 4).
Sammen, viser disse resultater, at effektor T celler udarbejdet og administreres under disse procedurer overleve i timevis i hjernen og kan patruljere inden for tumor og sund hjerne væv. Disse procedurer har været brugt til at vurdere den antitumor effektivitet af terapeutiske stereotactic forvaltninger af allogene menneskelige hvile Vϒ9Vδ2 T-celler til at styre udviklingen af menneskelige GBM hjerne tumorer9,11. Disse undersøgelser beviser at injektioner af allogene menneskelige effektor T-lymfocytter i tumor bed væsentligt forbedre overlevelse af mus transporterer hjernetumorer. Interessant, overlevende mus ikke bære påviselige tumorceller, der således angiver en komplet tumor afvisning.
Figur 1 : Billede af de vigtigste anatomiske landemærker på musen kraniet. Dette omfatter sagittal (rød linje) og koronale (blå linje) suturer og deres skæringspunktet (Bregma) bruges til at orientere injektionsstedet. Skalalinjen er indiceret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Overlevelse og aktivering af forberedt effektor T lymfocytter. Effektor celler (her, hvile menneskelige perifere Vϒ9Vδ2 T-celler) blev forstærket og tilberedt efter den beskrevne procedure. Farvning af lymfocytter med propidium Iodid (PI), en DNA intercalating fluorescerende stof, der ikke er permeant til levende celler, og funktionelle aktivering blev udført. (A) dette panel viser en repræsentativ plot af fremad (FSC-H) versus side (SSC-H) scatter gating af effektor lymfocytter (venstre panel). Histogrammet viser PI farvning af gated kontrol lymfocytter (højre panel). Andelen af PIpositive lymfocytter er indiceret. (B) dette panel viser andelen af døde lymfocytter (PIpositive) indsamlet straks (lys blå linje) eller efter 10 min (mørk blå linje) i mikrosprøjte, målt på den angivne timepoints. Som kontrol, aflæsset rede celler blev brugt (grå linje). (n = 3; betyde ± SD; IF = ikke betydelig.) (C) CD107a overflade mobilisering blev målt ved flowcytometri på enten Vδ2positive kontrol celler (uforberedt) eller forberedt lymfocytter vedligeholdes på is (forberedt + 3 h) efter en coculture med target menneskelige primære hjerne tumorceller. Andelen af lymfocytter er angivet i hver cytometric kvadrant. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Påvisning og lokalisering af effektor T-lymfocytter i hjernen tumor-bærende mus. En uge efter glioblastom hjerne tumor implantation, effektor immunceller (her, hvile menneskelige perifere Vϒ9Vδ2 T-celler) blev injiceret ind i hjerner af mus. En uge efter den immunterapeutisk behandling, blev hjerner indsamlet, fast og snit. Hjernen sektioner var farvet for Immunhistokemi analyse (hæmatoxylin, eosin og safran [HES] farvning) (venstre panel) eller farves med antihumant CD3 antistof (højre panel). De viste resultater er repræsentant for tre uafhængige forsøg. Skalalinjen er indiceret.
Figur 4 : Aktivering af effektor T lymfocytter indsamlet fra hjernen af behandlede mus. Hvilende humane T lymfocytter (her, 4 x 106 menneskelige αβ T lymfocytter) blev injiceret ind i hjerner af NSG mus. Efter 48 timer, blev hjerner indsamlet og adskilles. Andelen af menneskelige hjerne-infiltrerer T lymfocytter blev målt ved flowcytometri ved hjælp af et anti-menneskelige CD3 antistof (nederst). De indsamlede celler var seedet (10 celler/brønd) i 96-brønd rundbundede plader og stimuleret (PHA-feeder celler og IL-2) i 20 dage (16 fordobling cyklusser). Bemærk, på dagen 10, 13,3 x 106 af humane T lymfocytter blev indhentet (højre panel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En adoptiv overførsel af valgt naturlig eller manipuleret immun effektor celler udgør en lovende tilgang til effektiv behandling af tumorer, såsom infiltrativ hjernen kræft, pasning af begrænse reactivities mod ikke-transformeret celler15, 16,17,18. Det centrale nervesystem, som omfatter hjernen, har imidlertid en særlig immunstatus, navnlig på grund af eksistensen af blod - hjerne barrieren og manglen på en klassisk lymfe dræning system19,20. Disse fysiologiske funktioner påvirker væv handel og muligvis svække systemisk injektioner af immunceller. For at overvinde disse hindringer, er intraparenchymal injektioner udtømt på princippet om, at antitumor celler leveres temmelig lokalt, tæt til tumor site, hvad angår mikrokugler, som indeholder farmakologiske stoffer21, 22. på den ene side begrænsede fortynding af lymfocytter i orglet kan forbedre deres antitumor effektivitet, men det kan også forstærke skadelige mekanisk eller tumor tilpasning effekter, såsom tissular komprimering, som er ved at udvikle langs hjernen tumorvækst. Dette indebærer, at denne procedure kræver små mængder af immunterapeutisk injektioner. Problemet er endnu mere kritisk i eksperimentel dyremodeller i hvilke hjerne tumorer kan være kirurgisk skåret ud. I denne artikel beskrives en terapeutisk tilgang til udarbejdelse og lokale levering af hjernen tumor-specifik cellulær effektorer, baseret på stereotactic injection(s) af allogene humane T lymfocytter.
Denne undersøgelse viser forberedelsen og stereotaxisk levering af allogene menneskelige Vϒ9Vδ2 T-lymfocytter i immundefekte NSG mus med menneskelige GBM xenografts. Den første fase af denne protokol beskriver en enkel procedure for uddybning af allogene T lymfocytter fra PBMC af raske donorer, ved hjælp af en standard uspecifik PHA-foderautomater-IL2 stimulation, der producerer store mængder af ren effektor T lymfocytter, så deres terapeutiske udnyttelse23,24. Anden etape af denne artikel fokuserer på forberedelsen af hvilende T-lymfocytter suspensioner på dagen af stereotaxisk administration. Særlig fokus var lagt på dette vigtige skridt, der kræver en høj cellulære tæthed, der ikke bør påvirke levedygtigheden og funktionen af de valgte effektor T-lymfocytter. Endelig vedrørende i vivo eksperimenter, forberedelse af effektor T lymfocytter og deres injektion i tumor kerne er forbundet med deres udbredelse, ikke kun inden for tumor men også i de omkringliggende hjernen væv, fremhæve deres særlig evne til at patruljere og spore invasive tumorceller. Vigtigere, bevarer disse forberedelse og injektion metoder disse T-lymfocytter evne til at være aktiveret i hjernen på en specifik anerkendelse af hjernen tumorceller. Helt, disse overbevisende egenskaber sikre evne af T-lymfocytter til specifikt og effektivt målrette og fjerne dybt infiltrativ hjerne tumorceller, som er kendetegnende for GBM25. Af note, en særlig pleje skal tages under injektion og fjernelse af mikrosprøjte at minimere enhver hjerne læsion eller effektor celler lækager.
Sidst beskrives i denne artikel en effektiv procedure for at levere store mængder af allogene menneskelige anti-tumor lymfocytter, såsom hvile menneskelige Vϒ9Vδ2T lymfocytter, i nærheden af hjernetumorer. Vigtigst, denne terapeutiske procedure ikke er ledsaget med negative virkninger for de overførte T-lymfocytter (fx, levedygtighed, reaktivitet) eller på hjernen væv. Nylige undersøgelser, baseret på murine orthotopic modeller af primære menneskelige GBM, har vist, at Vϒ9Vδ2T lymfocytter effektivt målrette GBM celler, herunder tumorceller, som har dybt infiltreret hjernen parenkym9,11. Disse elementer åbne muligheder for udvikling af nye adoptiv T lymfocytter overførsel procedurer, der kunne anvendes i første omgang i mus transporterer orthotopic hjernetumorer og derefter, i kliniske undersøgelser i GBM patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke personalet i Universitetshospital animalske faciliteten (UTE) af Nantes for dyrehold og pleje, cellulære og tissular imaging core facilitet af Nantes Universitet (MicroPICell) til billedbehandling, og funktionen flowcytometri (Cytocell) fra Nantes for deres ekspert teknisk bistand. Dette arbejde blev finansieret af INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du kræft (Inka #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO interregionale 2017) og det europæiske konsortium ERA-Net Transcan2 (Immunoglio). Holdet er finansieret af Fondation pour la Recherche Médicale (DEQ20170839118). Dette arbejde blev realiseret i forbindelse med LabEX IGO og IHU-Cesti programmer, støttet af National forskning agenturet Investissements d'Avenir via programmer ANR-11-LABX-0016-01 og ANR-10-IBHU-005, henholdsvis. Projektets IHU-Cesti understøttes også af Nantes Metropole og Pays de la Loire-regionen. Forfatterne takke Chirine Rafia for at yde hjælp i rette håndskriftet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
References
- Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet? Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
- Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
- Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
- Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
- Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
- Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
- Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
- Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
- Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
- Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
- Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
- Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
- Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
- Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
- Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
- Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
