Summary
Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van cellulaire immuuntherapie intrabrain-geleverd.
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM), de meest frequente en agressieve primaire hersenenkanker in volwassenen, is over het algemeen geassocieerd met een slechte prognose en schaarse efficiënte therapieën zijn voorgesteld in het afgelopen decennium. Onder de veelbelovende kandidaten voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische strategieën, cellulaire immuuntherapie zijn doelwit geweest om te elimineren zeer invasieve en chemo-radioresistant tumorcellen, waarschijnlijk betrokken in een snelle en dodelijke terugval van deze vorm van kanker. Dus, haveninterfaces van allogene GBM-reactieve immuun cel effectoren, zoals menselijke Vϒ9Vδ2 T-lymfocyten, in de nabijheid van de tumor zou Hiermee geeft u een unieke kans om het leveren van efficiënte en hooggeconcentreerde therapeutische agenten rechtstreeks in de site van hersenen maligniteiten. Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een preklinisch bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van deze cellulaire immuuntherapie die afhankelijk zijn van stereotactische injecties van allogene menselijke lymfocyten binnen intrabrain tumor bedden.
Introduction
GBM (die graad IV astrocytoom), is de meest frequente en agressieve primaire hersenenkanker bij volwassenen. GBM blijft ondanks agressieve behandelingen die een combinatie van chirurgie en radio-chemotherapie, gekoppeld aan een zeer slechte prognose (mediane overleving van 14,6 maanden en een 2-jaar-sterfte > 73%)1. Dit bewijzen dat gedurende de laatste tien jaar2paar efficiënte vooruitgang op therapeutische gebied zijn gevalideerd. Onder de kandidaten voor het ontwerp van meer effectieve therapeutische strategieën3,-4,5, worden immuuntherapie6 momenteel onderzocht om te volgen en te elimineren zeer invasieve en radio/chemo-resistant tumor cellen, verdacht voor hun belangrijke bijdrage aan de snelle en dodelijke tumor herval7. Diverse immunologische doelwit werden geïdentificeerd en voorgestelde voor immuuntherapie, waarbij natuurlijke of gewijzigde αβ of ϒδ T lymfocyten zoals GBM-specifieke tumor-antigenen of stress-geïnduceerde moleculen8,9, 10. De mogelijkheid tot het beheren van geselecteerde GBM-reactieve immuun cel effectoren vertegenwoordigt een unieke gelegenheid om verhoogde hoeveelheid effector lymfocyten leveren rechtstreeks op de site van residuele maligniteit. Ter ondersteuning van deze strategie, hebben wij onlangs aangetoond dat modellen op basis van immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic primaire menselijke GBM xenografts getrouw de ontwikkeling van hersentumoren in GBM-patiënten9,11 recapituleren. Deze modellen werden bovendien gebruikt om aan te tonen van de sterke antitumorale efficiëntie van adoptively overgedragen allogene menselijke Vϒ9Vδ2T lymfocyten.
Dit protocol beschrijft de kritische experimentele stappen voor het bereiken van stereotactische immuuntherapie van hersentumoren, zoals GBM, gebaseerd op de adoptieve overdracht van allogene T-lymfocyten. Het artikel toont: (i) de amplificatie van therapeutische allogene immuun effector T lymfocyten, zoals menselijke Vϒ9Vδ2T lymfocyten; (ii) de opstelling van deze effector T-lymfocyten voor injectie; (iii) de procedure voor de stereotactische administratie binnen de hersenen, in de buurt van de tumor. Dit artikel bevat ook inzicht in het gedrag van deze cellulaire effectoren na stereotactische injectie.
De hier gepresenteerde therapeutische benadering is gebaseerd op de injectie van 20 x 106 effector cellen per dosis voor elke brain tumor-dragende immunodeficiëntie muis. Een eerste in vitro uitbreiding stap is vereist voor de productie van grote hoeveelheden van immuuncellen. Dus, niet-specifieke cel uitbreidingen zijn uitgevoerd met behulp van phytohemagglutinin (PHA-L) en bestraalde cellen van allogene feeder: perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van gezonde donoren en Epstein Barr Virus EBV-getransformeerd B-lymphoblastoid cel lijnen (BLCLs), door in vitro infectie met EBV-bevattende cultuur supernatant van de cellijn Hapalomys B95-8, in aanwezigheid van 1 µg/mL cyclosporin-A. PBMCs afgeleid
GBM-reactieve effector immuuncellen worden vergeleken en geselecteerd uit in vitro testen9. Deze effector cellen worden geactiveerd en gebruikt standaard protocollen, volgens hun aard (bijvoorbeeld, menselijke Vγ9Vδ2 T-lymfocyten9 of menselijke anti-herpes virus αβ T lymfocyten12) met een minimale zuiverheidsgraad van > 80%, als routinematig versterkt gecontroleerd door analyse van de cytometrische. De cel expansie procedure hieronder geldt voor de diverse menselijke lymfocyt deelverzamelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De volgende procedure waarbij dierlijke onderwerpen werd uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen (overeenkomst #00186.02; regionale ethische commissie van de Pays de la Loire [Frankrijk]). Menselijke PBMCs werden geïsoleerd uit het bloed verkregen van geïnformeerde gezonde donoren (Etablissement Français du Sang Nantes, Frankrijk). Alle stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden.
1. aspecifieke expansie van cytotoxische Effector T lymfocyten
- Bereiden en bestralen feeder cellen op 35 Gy. Voor de stimulatie van 2 x 105 - 4 x 10,5 effector cellen, 10 x 106 PBMCs en 1 x 106 BLCLs uit drie verschillende, gezonde donoren te bereiden.
- Resuspendeer zowel feeder cellen als effector in 15 mL RPMI aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd FCS, 2 mM L-glutamine, penicilline (100 IU/mL), streptomycine (0,1 µg/mL) en 300 IU/mL recombinante IL-2 cellen.
- PHA-L toevoegen om een eindconcentratie van 1 µg/mL, meng zorgvuldig en distribueren van 150 µL van de celsuspensie per putje in 96-wells-platen voor U-bodem.
- Incubeer bij 37 ° C en met 5% CO2 in een bevochtigde sfeer.
- Dagelijks controleren de plaat tot grote cel samengeklonterd vorm in de cultuur-putten (~ dag 7).
- Spoel de cellen in een maatkolf van de cultuur bij 1 x 106 cellen/mL verse kweekmedium.
- De cel Totaal aantal bepalen door het tellen van (2 x per week) en handhaven op 1 x 106 cellen/mL verse kweekmedium.
Opmerking: Effector immuuncellen klaar moeten zijn voor de therapeutische administratie in een rusttoestand (meestal 3 weken na de eerste amplificatie prikkel). De zuiverheid en de reactiviteit van deze effector cellen moeten worden gecontroleerd vóór de in vivo injecties (b.v.met in vitro testen).
2. pre-operatieve Effector cellen voorbereiding
- Na controle van de telling van de cel effector, verzamelen de effector cellen in een 50 mL-buis door middel van centrifugeren (300 x g gedurende 5 minuten).
Opmerking: Ter compensatie voor enig verlies, bereiden een overmaat van cellen (b.v., 50 x 106). - Zorgvuldig Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 15 mL steriele PBS en Centrifugeer gedurende 5 min op 300 x g uit te voeren van het wassen.
- Zorgvuldig en volledig Verwijder het supernatant en resuspendeer vervolgens de cel pellet in 1 mL steriele PBS.
- Overdracht van de geresuspendeerde cellen in een 1.5-mL microtube voor centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant door pipetteren langzaam zorgvuldig en volledig.
- Resuspendeer de pellet cel in 8 µL van steriele PBS per muis.
Opmerking: Dit is een cruciale stap. - Het volume van de celsuspensie meten met behulp van een micropipet. Indien nodig, voeg steriel PBS (20 x 106 cellen in 15 µL van PBS per dosis) en meng zorgvuldig.
- Controleren, met behulp van een micropipet, die het eindvolume per muis tussen 15 en 20 μL (absoluut < 20 µL ligt).
- Houd de cellen op het ijs tot stereotactische injectie.
Opmerking: meer dan 3-h timepoints werden niet getest.
3. stereotactische injectie
-
Apparatuur set-up
- Monteren en kalibreren van een klein dier stereotactische frame volgens de instructies van de fabrikant om de juistheid van intracraniële injecties (b.v., spuit de grootte, gewenste volume en snelheid van injectie).
Opmerking: Een langzame infusiesnelheid wordt aanbevolen (dat wil zeggen, 2-3 µL/min). - Installeer het materiaal onder een microbiële veiligheidskast (MSC) te behouden de steriliteit van de instrumenten en ter bescherming van de muizen van infecties.
Opmerking: plaats "isothermische blokken" in een waterbad bij 37 ° C. Dit systeem beperkt de onderkoeling van muizen tijdens de operatie. Verwarming pads, die nodig voor post procedurele zorg zijn, moet worden gebruikt tijdens de voortdurende temperatuurbewaking.
- Monteren en kalibreren van een klein dier stereotactische frame volgens de instructies van de fabrikant om de juistheid van intracraniële injecties (b.v., spuit de grootte, gewenste volume en snelheid van injectie).
-
Pre-operatieve dierlijke voorbereiding
- Anesthetize een muis met een intraperitoneale injectie van ketamine (10 mg/mL) en xylazine (0,1 mg/mL), bij 10 µL/g van het lichaamsgewicht van de muis.
- Het uitvoeren van een teen snuifje test om ervoor te zorgen de volledige narcose en analgesie van het dier.
Opmerking: Elke beweging is een indicatie van de niet-diep analgesie en, als dit het geval is, een paar minuten voordat de bewerking herhaald zijn verplicht. - Zodra de muis is goed verdoofd, gebruik schaar om de vacht van de chirurgische site (tussen de twee oren, tot de neus).
-
Pre-operatieve cel voorbereiding
- Zorgvuldig resuspendeer de cellen met een pipet (meerdere malen) vóór elke injectie om te voorkomen dat een willekeurige cel samendoen.
- Zorgvuldig trekken het vereiste cel schorsing volume (15-20 µL) in de 22-G-microsyringe om te voorkomen dat het streven van bubbels.
Opmerking: Deze stap van de cel-laden in de microsyringe is belangrijk om te minimaliseren van de verschillen in ingespoten volumes. Herlaad cellen voor elke individuele injectie tussen procedures ter voorkoming van een willekeurige cel samendoen en om een even aantal effector cellen administratie in de cohort. - Dan, plaats de injectiespuit in het aangepast-spuitpomp.
-
Procedurele zorg
- Desinfecteren van de chirurgische site met swabs gedrenkt in Povidon-jodium 5% oplossing ten minste 3 x.
- Plaats een smerende ophthalmic zalf in de ogen van de muis om te voorkomen dat eventuele drogen van het hoornvlies.
- Standpunt de narcose muis op het stereotactische frame, op een warme isothermische blok bedekt met een steriele plastic wrap ter handhaving van de muis temperaturen tijdens de operatie en beperking van de sterfte.
Opmerking: De neus en de tanden van de muis moeten worden op de juiste manier gepositioneerd boven de balk, tand, zodat adequate respiratoire stroom tijdens de procedure. - Zodra de muis wordt geplaatst boven de bar van de tand, draai de oor bars stevig onder van de muis oren te immobiliseren van het hoofd.
Opmerking: Wees voorzichtig om geen schade toebrengen aan de trommelvliezen of tot compromissen van de ademhaling. - Maak een 1-2 cm middellijn Sagittaal huid incisie met een steriele schaar langs het bovenste deel van de schedel van anterior to posterior bloot van de schedel.
- Identificeren van het snijpunt van de Sagittaal en coronale hechtingen (Bregma) om te dienen als monumenten voor stereotactische lokalisatie vóór de injectie (afgebeeld in Figuur 1).
- Plaats de microsyringe boven dit punt.
- Verplaats de microsyringe 2 mm rechts laterale en 0,5 mm anterior van de Bregma.
- Maak een microdrill met een klein gaatje in de schedel met een steriele boor op vooraf bepaalde coördinaten. Wees voorzichtig blijven oppervlakkige teneinde eventuele traumatische letsel van de hersenen.
Opmerking: In dit protocol, immune cellen werden ingespoten binnen een gevestigde tumor (een week na tumor cel injectie). De huid moet heropende (litteken) en de injectie wordt uitgevoerd met dezelfde coördinaten gebruikt voor de tumor cel implantatie (het gat is meestal nog aanwezig omhoog tot 2 weken na de injectie). Coördinaten werden geselecteerd voor het injecteren van de cellen van de tumor en effector in de hersenen parenchym13,14.
-
Injectie van immuun effector cellen
- Zorgvuldig plaatst u de microsyringe in het geboorde gat en langzaam, de naald 3 mm naar beneden in de dura en vervolgens achterwaarts 0.5 mm tot een definitieve diepte van 2,5 mm vóór het injecteren van de effector cellen toekomen.
- De injectie van de cel effector op 2-3 µL/min uitvoeren en controleren van de muizen langs de injectie tijd.
- Zodra de injectie voltooid is, trekken de naald voor slechts 1 mm en bewaar de microsyringe op plaats voor één extra minuut langzaam intrekking volledig de microsyringe, ter voorkoming van lekkages van de infusie-site.
Opmerking: Na het verwijderen van het dier van de stereotactische apparaat, schone onmiddellijk de injectie apparatuur voor aankomende experimenten.
-
Post-operatieve zorg en opvolging van muis
- Het dier uit het stereotactische frame verwijderen en onmiddellijk Povidon-jodium 5% oplossing van toepassing op de site van de incisie en sluit de huid met een passende chirurgische hechtdraad.
- Toepassing van 2% lidocaïne gel direct op de wond en 0,15 µg/g van buprenorfine beheren door een subcutane injectie voor post procedurele analgesie.
- Plaats terug de narcose muis naar de kooi boven een verwarming pad ingesteld op 37 ° C te handhaven van de lichaamstemperatuur van een passende muis en om te voorkomen dat eventuele onderkoeling.
Opmerking: Aparte behuizing is niet nodig. - Volgen van de muis totdat het is volledig hersteld van anesthesie en overbrengen naar een kamer behuizing.
Opmerking: Tot op heden, dit protocol wordt ook ondersteund als paar onvoorziene complicaties zijn opgetreden (< 5% van de geïnjecteerde muizen). - Dagelijks volgen van de muizen en euthanaseren hen wanneer afnemende gezondheid symptomen worden waargenomen (b.v., gebogen houding, verminderde mobiliteit, prostration of significante lichaam gewichtsverlies [≥ 15%]).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze studie beschrijft de strategie voor de adoptieve overdracht van cellulaire immuun effector cellen binnen de hersenen van tumor-uitvoering muizen, op basis van stereotactische injecties uitgevoerd rechtstreeks in het bed van de tumor.
Om elk risico van hersenletsel die is gekoppeld aan een grote geïnjecteerde volume, moet de effector celsuspensie worden geconcentreerd (20 x 106 cellen in 15-20 µL van PBS). Om te controleren of deze cel concentratie stap van invloed kan zijn op de levensvatbaarheid van de cellen effector, waren deze cellen bereid volgens het protocol beschreven en in de microsyringe geladen. De effector cellen werden verzameld onmiddellijk, of 10 minuten na het laden van hen in de microsyringe. De cellen werden gekleurd met propidium jodide (PI), een fluorescente DNA intercalating agent thats niet permeant om levende cellen en geanalyseerd door stroom cytometry op verschillende timepoints (0, 24 en 72 uur). Uit de resultaten blijkt dat de voorbereiding en het laden in de microsyringe niet noemenswaardig verstoord de levensvatbaarheid van de cellen effector gedurende ten minste 24 uur (figuur 2A en 2B). Na 72 uur, was een lichte, maar niet-significante, toename van PIpositieve cellen (14% vergeleken met 11% voor gelost cellen) waargenomen. Op een vergelijkbare manier werd de antitumorale reactiviteit van effector cellen die waren voorbereid en onderhouden op het ijs gedurende 3 uur geanalyseerd. Effector cellen werden cocultured met tumor hersencellen voor 4 uur in aanwezigheid van een anti-CD107a mAb. De opregulatie van de activering markering CD107a, vergelijkbaar met de waarde die is verkregen in de controlevoorwaarden, geeft aan dat de reactiviteit van effector cellen niet wordt beïnvloed door de voorbereiding en het laden in de microsyringe (figuur 2C).
Om te beoordelen of effector cellen overleven en verplaatsen binnen de hersenen parenchym na hun intra-tumoral implantatie, 20 x 106 effector waren cellen geïnjecteerd in de site van de tumor van muizen dragen een hersentumor (GBM-111). Een week later, werden de hersenen verzameld, vast, verdeelde en gebeitst voor safran haematoxyline en eosine-kleuring (HES) en anti-menselijke CD3 mAb (IHC). HES kleuring geïdentificeerd de structuur van de hersentumoren (Figuur 3, linkerpaneel). De CD3 kleuring geïdentificeerd en gelokaliseerd de immuun effector T-lymfocyten (hier, menselijke Vϒ9Vδ2 T-cellen) (Figuur 3, rechter paneel). Interessant, werden effector T lymfocyten ontdekt rond de tumor (Figuur 3, bovenste rechter paneel), in de kern van de tumor (Figuur 3, middelste rechterpaneel), maar ook in het contralaterale halfrond (Figuur 3, het rechterpaneel onder). Bovendien was de functie van menselijke T lymfocyten geïsoleerd van de muis hersenen 48 uur na de injectie (4 x 106 αβ T-cellen), die 2 procent van de hersencellen vertegenwoordigen, geanalyseerd. De resultaten wijzen erop dat de verzamelde hersenen-geïnjecteerd effector allogene αβ T cellen uit te breiden en op een niet-specifieke PHA-feeder cellen activering uitgevoerd in het bijzijn van IL-2 (Figuur 4 verspreiden).
Deze resultaten tonen samen, dat effector T cellen voorbereid en beheerd onder deze procedures urenlang in de hersenen overleven en in de tumor en gezonde hersenen weefsels patrouilleren kunnen. Deze procedures zijn voor de beoordeling van de antitumorale efficiëntie van therapeutische stereotactische administraties van allogene menselijke rust Vϒ9Vδ2 T cellen gebruikt om te controleren van de ontwikkeling van menselijke GBM hersenen tumoren9,11. Deze studies bewijzen dat injecties van allogene menselijke effector T lymfocyten in het bed van de tumor een aanzienlijke verbetering van de overleving van muizen uitvoering van hersentumoren. Interessant, voerde overlevende van de muizen niet detecteerbare tumorcellen, dus een volledige tumor afwijzing die aangeeft.
Figuur 1 : Beeld van de belangrijkste anatomische bezienswaardigheden op de muis schedel. Het gaat hierbij om Sagittaal (rode lijn) en coronale (blauwe lijn) hechtingen en hun doorsnede (Bregma) gebruikt om te oriënteren op de site van injectie. De bar van de schaal wordt aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Survival en activering van bereid effector T lymfocyten. Effector cellen (hier rust menselijke perifere Vϒ9Vδ2 T-cellen) werden versterkt en bereid volgens de beschreven procedure. Kleuring van lymfocyten met propidium jodide (PI), een intercalating van fluorescente stof die is niet permeant om te leven van cellen en functionele activering DNA werden uitgevoerd. (A) dit paneel toont een representatieve plot van voorwaartse (FSC-H) versus kant (WS-H) scatter gating van effector lymfocyten (deelvenster links). Het histogram geeft de PI kleuring van gated control lymfocyten (rechtervenster). Het percentage van PIpositieve lymfocyten wordt aangegeven. (B) dit paneel toont het percentage van dode lymfocyten (PIpositieve) onmiddellijk verzameld (licht blauwe lijn) of na 10 min (donker blauwe lijn) in het microsyringe, gemeten op de aangegeven tijdstippen. Als besturingselement, gelost bereid cellen werden gebruikt (grijze lijn). (n = 3; betekenen ± SD; ns = niet significant.) (C) CD107a oppervlakte mobilisatie werd gemeten door stroom cytometry op beide Vδ2positieve controle cellen (onbereid) of bereid lymfocyten gehandhaafd op ijs (bereid + 3 h) na een coculture met de hersenen van de primaire tumor doelcellen. Het percentage van lymfocyten wordt aangegeven in elk kwadrant van de cytometrische. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Opsporen en lokaliseren van effector T lymfocyten in het brein van tumor-dragende muizen. Een week na glioblastoma brain tumor implantatie, effector immuuncellen (hier rust menselijke perifere Vϒ9Vδ2 T-cellen) waren geïnjecteerd in de hersenen van muizen. Een week na de immunotherapeutische behandeling, waren de hersenen verzameld, vaste en gesegmenteerd. Secties van de hersenen waren gekleurd voor analyse van immunohistochemistry (Haematoxyline eosine en kleuring van "Safran" [HES]) (linkerdeel) of gebeitst met anti-menselijke CD3 antilichaam (rechtervenster). De resultaten die worden weergegeven zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. De bar van de schaal wordt aangegeven.
Figuur 4 : Activering van effector T lymfocyten verzameld uit het brein van behandelde muizen. Rust menselijke T-lymfocyten (hier, 4 x 106 menselijke αβ T lymfocyten) waren geïnjecteerd in de hersenen van muizen NSG. Na 48 uur, werden de hersenen verzameld en losgekoppeld. Het percentage van de menselijke hersenen-infiltreren T lymfocyten werd gemeten door cytometry van de stroom met behulp van een anti-mens CD3 antilichaam (onderkant). De verzamelde cellen waren (10 cellen per putje) zaadjes in 96-wells-platen U bodem en gestimuleerd (PHA-feeder cellen en IL-2) voor 20 dagen (16 verdubbeling cycli). Opmerking, op dag 10, 13,3 x 106 van menselijke T-lymfocyten (rechtervenster) werden verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een adoptief overdracht van geselecteerde native of gemanipuleerde immuun effector cellen vertegenwoordigt een veelbelovende aanpak om efficiënt het behandelen van tumoren, zoals infiltratieve hersenen kanker, het verzorgen van de beperking van de reactivities tegen niet-getransformeerd cellen15, 16,17,18. Het centrale zenuwstelsel, die bestaat uit de hersenen, heeft echter een bijzondere immuunstatus, met name als gevolg van het bestaan van de bloed - hersenbarrière en het ontbreken van een klassieke lymfedrainage systeem19,20. Deze fysiologische functies beïnvloeden weefsel mensenhandel en systemische injecties van immuuncellen in gevaar kunnen brengen. Om te overwinnen deze belemmeringen, werden intraparenchymal injecties onderzocht op het principe dat antitumorale cellen liever lokaal worden afgeleverd, nauw bij de tumor site, wat betreft de microsferen waarin farmacologische stoffen21, 22. aan de ene kant, de beperkte verdunning van lymfocyten in het orgel hun antitumorale efficiëntie kan verbeteren, maar het kan ook schadelijke mechanische of tumor aanpassing effecten, zoals tissular compressie, die langs hersenen ontwikkelt zich versterken tumorgroei. Dit betekent dat deze procedure kleine volumes immunotherapeutische injecties vereist. Deze kwestie is nog kritischer in experimentele diermodellen in welke hersenen tumoren chirurgisch kunnen niet worden weggesneden. Dit artikel beschrijft een therapeutische benadering voor de voorbereiding en de lokale levering van hersenen tumor-specifieke cellulaire effectoren, op basis van stereotactische injection(s) van allogene menselijke T-lymfocyten.
Deze studie toont de voorbereiding en de stereotaxic levering van allogene menselijke Vϒ9Vδ2 T-lymfocyten in immunodeficiëntie NSG muizen uitvoering van menselijke GBM xenografts. De eerste fase van dit protocol behelst een eenvoudige procedure voor allogene T lymfocyten van PBMCs van gezonde donoren frequentiebanden te versterken, met behulp van een standaard niet-specifieke PHA-feeders-IL2 stimulatie die grote hoeveelheden van pure effector T lymfocyten produceert, waardoor hun therapeutische gebruik23,24. De tweede fase van dit artikel richt zich op de voorbereiding van T-lymfocyten schorsingen rustend op de dag van de stereotaxic administratie. De nadruk werd gelegd op deze belangrijke stap die vereist een hoge cellulaire dichtheid die geen afbreuk aan de levensvatbaarheid en de functie van de geselecteerde effector T-lymfocyten doen mag. Tot slot, met betrekking tot de in vivo experimenten, de voorbereiding van effector T lymfocyten en hun injectie in de kern van de tumor is geassocieerd met de verspreiding daarvan, niet alleen binnen de tumor maar ook in de omliggende weefsels van de hersenen, markeren hun bijzonder vermogen om te patrouilleren en het bijhouden van invasieve tumorcellen. Nog belangrijker is, behoudt deze voorbereiding en injectie methoden het vermogen van deze T-lymfocyten te worden geactiveerd binnen de hersenen op een specifieke erkenning van tumor hersencellen. Over het geheel genomen deze dwingende kenmerken zorgen voor de mogelijkheid van T lymfocyten te specifiek en efficiënt richten en elimineren van diep infiltratieve tumor hersencellen die een keurmerk van GBM25. Van de nota, een speciale zorg moet worden genomen tijdens de injectie en de verwijdering van de microsyringe tot een minimum beperken van een laesie van de hersenen of effector cel lekken.
Kortom, beschrijft dit artikel een efficiënte procedure voor het uitbrengen van grote hoeveelheden van allogene menselijke anti-tumor lymfocyten, zoals menselijke Vϒ9Vδ2T lymfocyten, rust in de omgeving van hersentumoren. Nog belangrijker is, deze therapeutische procedure niet gepaard gaat met schadelijke effecten op de overgedragen T-lymfocyten (b.v., levensvatbaarheid, reactiviteit) of op de weefsels van de hersenen. Recente studies, gebaseerd op lymfkliertest orthotopic modellen van primaire menselijke GBM, hebben aangetoond dat Vϒ9Vδ2T lymfocyten efficiënt GBM cellen richten, met inbegrip van tumorcellen die hebben diep geïnfiltreerd de hersenen parenchym9,11. Deze elementen opent kansen voor de ontwikkeling van nieuwe adoptief T lymfocyten overdracht procedures die kunnen worden toegepast in de eerste plaats in muizen uitvoering orthotopic hersentumoren en, vervolgens, in klinische studies bij GBM-patiënten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken het personeel van het universitair ziekenhuis dier faciliteit (UTE) van Nantes voor veeteelt en zorg, de cellulaire en tissular imaging core faciliteit van de Universiteit van Nantes (MicroPICell) voor de beeldvorming en de Cytometry faciliteit (Cytocell) vanuit Nantes voor hun deskundige technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO interregionale 2017) en het Europese ERA-Net Transcan2-consortium (Immunoglio). Het team wordt gefinancierd door de Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Dit werk werd gerealiseerd in het kader van de LabEX IGO en de IHU-Cesti programma's, ondersteund door de nationale onderzoek bureau Investissements d'Avenir via de programma's ANR-11-LABX-0016-01 en ANR-10-IBHU-005, respectievelijk. Het IHU-Cesti project wordt ook ondersteund door Nantes Metropole en de regio Pays de la Loire. De auteurs bedanken Chirine Rafia voor het verstrekken van hulp bij het corrigeren van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
References
- Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet? Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
- Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
- Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
- Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
- Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
- Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
- Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
- Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
- Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
- Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
- Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
- Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
- Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
- Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
- Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
- Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
