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Artigo de método

Intravenosa e Intra-amniótica no Utero transplante no modelo murino

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DOI:

10.3791/58047

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9 de outubro de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of General, Thoracic, and Fetal Surgery, Center for Fetal Research, Children's Hospital of Philadelphia, 2Division of Plastic Reconstructive Surgery, Center for Fetal Research, Children's Hospital of Philadelphia

Neste artigo

Resumo

Descreveremos um protocolo para a realização de um transplante no utero (IUT) através de vias intravenosa e intra-amniótica de injeção no modelo murino. Este protocolo pode ser usado para introduzir células, vetores virais e outras substâncias em único ambiente fetal imune-tolerantes.

Resumo

Transplante de in utero (IUT) é um modo único e versátil de terapia que pode ser usado para introduzir células-tronco, vetores virais ou quaisquer outras substâncias no início da gestação. A lógica por trás de IUT para fins terapêuticos baseia-se o pequeno tamanho do feto, a imaturidade imunológica fetal, a acessibilidade e natureza proliferativa de células estaminais ou progenitoras fetais e o potencial para tratar uma doença ou do início dos sintomas antes do nascimento. Aproveitando essas propriedades no desenvolvimento normais do feto, a entrega de células-tronco hematopoiéticas (HSC) através de uma IUT tem o potencial para tratar doenças hematológicas congénitas, tais como a doença falciforme, sem a necessária transplantes de mieloablativo ou imunossupressora condicionamento necessário para HSC pós-natal. Da mesma forma, a acessibilidade de células progenitoras em múltiplos órgãos, durante o desenvolvimento potencialmente permite um direcionamento mais eficiente de células tronco/progenitoras seguindo uma IUT de vetores virais para terapia do gene ou genoma de edição. Além disso, IUT pode ser usado para estudar os processos normais de desenvolvimento incluindo, mas não se limitando a, o desenvolvimento da tolerância imunológica. O modelo murino fornece um meio valioso e acessível para entender o potencial e as limitações da IUT antes da pré-clínicos estudos animais grandes e uma eventual aplicação clínica. Aqui, descrevemos um protocolo para a realização de uma IUT no feto através de vias intravenosa e intra-amniótica murino. Este protocolo tem sido usado com sucesso para elucidar as condições necessárias e mecanismos subjacentes no utero o transplante de células-tronco hematopoiéticas, indução de tolerância e no utero terapia de gene.

Introdução

Recentes avanços no diagnóstico e rastreio pré-natal tem trazido à luz da possibilidade de tratar o feto para um número de doenças congênitas que não tem as opções de tratamento pós-natal adequada e resultar em significativa morbidade e mortalidade. Especificamente, no utero o transplante de células-tronco hematopoiéticas (IUHCT) e edição de terapia/genoma gene têm potencial para tirar proveito das propriedades do desenvolvimento normais do feto para tratar doenças congênitas hematológica, imune e genética os transtornos mais eficientemente do que o transplante de HSC pós-natal e edição de genoma/terapia do gene podem fazer1,2. Especificamente, devido ao pequeno tamanho do feto, a célula do doador ou dose de vetor viral pode ser maximizado pelo peso do destinatário. Além disso, a imaturidade imunológica do feto permite doadores de linfócitos deve ser injetado sem a mieloablativo e imunossupressoras condicionamento que é exigido nos protocolos de transplante pós-natal. Da mesma forma, carregando um transgene terapêutico ou tecnologia de edição de genoma de vetores virais podem ser injetados sem uma resposta imune limitante para o transgene produto ou o vetor viral. Finalmente, a acessibilidade e a natureza proliferativa de células tronco/progenitoras fetais pagar a possibilidade de uma mais eficiente transdução de células progenitoras de destino, bem como certos modos de genoma edição (dirigido por homologia reparação) que necessitam de ciclismo células ocorra de forma eficiente. O modelo murino serve como um meio perspicaz e acessível para abordar questões importantes em biologia de células-tronco e Imunologia antes de fazer experiências em modelos pré-clínicos de animais grandes e, como tal, tem servido como o modelo principal em que IUHCT e no útero terapia genética têm sido exploradas1,2,3.

Apesar de muitas variáveis desempenham um papel importante no sucesso de IUHCT e no utero gene terapia/genoma edição em modelos animais murino e grandes, uma variável-chave é o método de entrega dos linfócitos ou vetor viral. A entrega de grandes doses de linfócitos de doadores com um efeito de primeira passagem ocorra no fígado fetal, o órgão hematopoiético aquando do IUHCT, foi mostrada para ser instrumental na obtenção de níveis de macrochimeric de enxertia em mouse e modelos animais grandes4 ,5. Isto foi conseguido através de uma injeção de doador células através da veia vitelínico no modelo de rato e através de uma injeção intra cardíaca no modelo canino. A rota de injeção também desempenha um papel fundamental no direcionamento de células progenitoras de órgãos diferentes durante o desenvolvimento. Por exemplo, uma injeção intravenosa através da veia vitelínico tem demonstrada eficientemente transduce cardiomyocytes e hepatócitos após um final de gestação injeção6,7. Alternativamente, uma injeção intra-amniótica de vetores virais permite a segmentação dos órgãos que estão expostos fisicamente baseados no dobradura/desenvolvimento embrionário no momento da injeção8. Isto é melhor exemplificado pela segmentação do epitélio respiratório através de uma injeção intra-amniótica no final da gestação para aproveitar normal "respirar" movimentos fetais, que expõe o trato respiratório para o vetor viral no amniótico fluido de9. Estes dois modos de IUT, por via venosa através da veia vitelínico e intra-amniótica, foram a base para várias experiências passadas e em curso no nosso laboratório. Neste protocolo, descrevemos em detalhe os métodos para a realização de IUT intravenosa e intra-amniótica no modelo murino.

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Protocolo

Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso no Hospital de Filadélfia infantil e institucional Cuidado Animal.

1. criação de pipetas de injeção

  1. Usando um extrator vertical micropipeta, puxe uma pipeta conta de 100 µ l (Fig. 1A - 1C). Calibre o extrator micropipeta para que a extremidade pontiaguda é > 1 cm de comprimento.
    Nota: Inicialmente, as configurações do extrator devem ser ajustadas para um comprimento ideal. Um ajuste de calor maior fará com que a ponta mais longa, e um ajuste de tração maior fará com que o diâmetro da ponta mais estreita.
  2. Corte a extremidade pontiaguda para que ele seja ≥ 1 cm de comprimento. Certifique-se que o diâmetro interno na ponta da agulha está entre 70 µm e 100 µm e é inversamente proporcional ao comprimento da extremidade afilada.
    Nota: O diâmetro interno também depende da calibração do extrator a micropipeta. Consulte as instruções do fabricante do puxador vertical micropipeta ou qualquer tipo de extrator de micropipeta preferencial.
  3. Depois de se assegurar que a agulha tem o diâmetro interno correto, crie o chanfro de 15 a 20 graus por afiar a ponta usando um chanfrador micropipeta com um diamante afiar roda (Fig. 2A - 2C). Certifique-se de descansar a ponta suavemente sobre a roda sem muita pressão, para diminuir as chances de quebrar ou rachar a ponta.
    Nota: Um pincel pode ser usado para limpar quaisquer resíduos que se acumula na ponta da agulha.
  4. Avaliar a ponta sob um microscópio e certifique-se de que a ponta é redonda sem fichas ou rachaduras. Reavalie o diâmetro interno para certificar-se que é entre 70 µm e 100 µm (Figura 2D - 2 H).
  5. Desenhar linhas sobre o resto da agulha para designar a 5 µ l de volume entre elas (p. ex., agulhas com um diâmetro interno de 1,3 mm devem ter linhas desenhadas em incrementos de 3,77 mm).
  6. Autoclave a prévia de agulhas para uso em cirurgia e tratá-los com luvas estéreis.

2. injeções no utero

  1. Preparar os necessários instrumentos em autoclave-los antes do tempo. Incluem os instrumentos essenciais, tais como o suporte da agulha de microinjector, um motorista de agulha cirúrgica, um par de pinças Adson, um par de tesouras curvas regulares de tecido, uma seringa de insulina 1 mL, um par de aplicadores de ponta de algodão, uma pipeta de transferência, um tubo cónico de 50 mL e um pacote de sutura de Poliglactina 910 4-0.
  2. Usando uma técnica estéril, fixar o suporte da agulha a agulha e conecte-a microinjector.
    Nota: As configurações do nitrogênio comprimido usado são como se segue: injetar 4-6 libras por polegada quadrada, contrapeso 0 psi. Dependendo do que está sendo injetado, especificamente, a viscosidade do injectate, bem como o tamanho da micropipeta, os tempos de injeção variam entre 0,3 - 1,5 s.
  3. Limpe a ponta da agulha de todos os possíveis restos pela elaboração de 5-10 µ l de estéril 1x tampão fosfato salino (PBS) e em seguida limpando. Repita este x 2-3.
  4. Prepare grávidos ratos fêmeas de 2 a 6 meses de idade para a cirurgia de corte seus abdomens com uma tesoura. Tenha cuidado para não danificar os mamilos. Administre analgésicos orais (por exemplo, 100 µ l de 1,5 mg/mL suspensão oral de meloxicam por rato).
  5. Começa a encher a agulha com o material desejado (células/vetor/drogas) com o volume desejado. Tenha cuidado para não quebrar a ponta da agulha enquanto abastecia a agulha.
    Nota: O volume de injeção por feto varia de acordo com o delineamento específico. 20 µ l funciona bem para injetar um grande número de células (ou seja, até 107 células na veia vitelínico. Por exemplo, nós entregamos a 1 x 107 toda medula óssea células isoladas de C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ["B6 verde fluorescente da proteína (GFP)"] ratos através da veia vitelínico em fetos de Balb/c-14 dia gestacional. Para injeções de vetor viral, uma única injeção de 10 µ l de um vetor diluído 1:1 com PBS funciona bem.
  6. Para calibrar o tempo de injeção, siga os seguintes passos.
    1. Empurre o modo botão x 3 sobre o microinjector para ir a tela de calibração de injeção. Ajustar o tempo de injeção, adicionando a intervalos de 10 ou 100 ms e empurrar o modo botão 2x.
    2. Aperte o botão de equilíbrio e empurrar o pedal uma vez. Agora empurre o pedal novamente e avaliar como muito volume é esvaziada fora a agulha por impulso. Se não calibrada para o volume desejado de 5-20 µ l por pedal impulso, repita as etapas 2.6.1 e 2.6.2.
      Nota: Em geral, é bom calibrar cada impulso para entregar metade do volume total do destino de cada vez. Enquanto é possível injetar mais de 30 µ l ou mesmo 40 µ l de volume total, não geralmente vamos ao longo de 20 µ l por feto, por via venosa ou intra-amniótica.
  7. Preencha a agulha até o nível desejado.
  8. Começa a oferecer anestesia para o mouse, ajustando o medidor de fluxo de oxigênio para 1 L/min e o vaporizador de isoflurano para 3%.
  9. Confirme se o mouse é anestesiado, verificando a ausência do pedal reflexo. Transferi o mouse para uma almofada de aquecimento em uma posição supina.
  10. Aplica gel lubrificante de olho para evitar a dessecação da córnea. Prenda o mouse no lugar gravando os membros superiores e inferiores à almofada.
  11. Prepare o abdômen com clorexidina esfoliação, seguida de álcool e injetar um anestésico local (por exemplo, 100 µ l de bupivacaína 0,25%) por via subcutânea(Figura 3).
  12. Com uma tesoura, faça uma incisão de pele de 1-2 cm para que a borda inferior não é mais do que 1 cm para o introitus; a fáscia por baixo é muito fina e translúcida.
  13. Identifica a linha média da fáscia que é mais transparente do que a área circundante. Tenha cuidado para não machucar os navios epigástrico que se encontram em ambos os lados da linha média. Os navios epigástrico devem ficar feridos, mantenha a pressão com aplicadores de ponta de algodão para estancar o sangue.
  14. Usando a pinça Adson, belisque a fáscia sem pegar qualquer um dos órgãos como o intestino, bexiga ou fetos subjacentes. Abra a fáscia com tesouras, tomando cuidado para não danificar qualquer um dos órgãos. Uma vez em segurança, no abdômen, estender a incisão fascial. Torná-lo não é mais do que a incisão da pele.
  15. Use aplicadores de ponta de algodão para mover os intestinos para a parte superior do abdômen, expondo assim o útero gravid. Entrega o útero fora da incisão, cuidadosamente, identificando os ovários direito e esquerdos para garantir que todos os fetos são contados (Figura 3B).
  16. Coloque o útero esquerdo volta para o abdômen, de modo que apenas o útero certo é exposto; Isto impede a dessecação do útero e aquece os fetos não injectada.
  17. Segure a mais lateral feto/bolsa amniótica entre o polegar e o dedo indicador da mão não-dominante do operador (Figura 3C). Sempre seja gentil quanto não causa nenhum dano para os fetos.
  18. Posicione o microscópio de dissecação (uma ampliação de 10x é ideal) e ajustar o foco para que o feto está em exibição. Ajuste a iluminação para uma melhor visualização.
  19. Identificar a parte que será injectada (veia vitelínico, âmnio). Para injeções intravenosas, visualize tanto as veias vitelínico e suas anastomoses primeiro. Para injeções intra-amniótica, Oriente o feto com o lado direito no modo de exibição.
  20. Alcançar o espaço do alvo com a agulha, conforme descrito abaixo.
    1. Para uma injeção intravenosa, proceda como a seguir.
      1. Girar o útero para que a veia vitelínico que está sendo injectada é paralela à ponta da agulha; tenha em mente que as injeções devem ser feitas para a anastomose das duas veias.
      2. Colocar a agulha sobre o útero em um ângulo de 5° e perfurar a parede uterina. Agora que a dica é entre a parede uterina e o saco amniótico, coloque a ponta diretamente em cima da veia vitelínico.
      3. Em um ângulo quase tangencial, deslizar a agulha sobre a veia até o bisel perfura e avança para o recipiente; Isto é evidente por um flash de sangue visto na ponta da agulha (Figura 3-D).
        Nota: Acessar a veia pode levar algumas tentativas, como a agulha não pode perfurar a veia com o primeiro deslize sobre a veia.
    2. Para uma injeção intra-amniótica, proceda como a seguir.
      1. Rode o saco amniótico e encontrar um local desprovido de vasos para perfurar.
      2. Aponte a agulha perpendicular à parede uterina e perfurar o útero, o saco vitelino e em seguida o saco amniótico. Tenha cuidado para não perfurar qualquer tecido fetal. Certifique-se que a agulha se passou entre os membros como isto confirma que a agulha está no saco amniótico. Então prosseguir com a injeção.
  21. Injete o volume apropriado de material desejado (normalmente 10-20 µ l) pressionando o pedal.
    Nota: Porque o injector deve manter a visualização da ponta da agulha através do microscópio em todos os momentos, uma segunda pessoa deve ler as marcas da agulha para quantificar a quantidade injetada e informar o injector como muito volume é deixada para injetar. Uma discussão antes da injeção entre o injetor e o assistente é importante para evitar qualquer confusão e atraso. Isto é especialmente importante para injeções intravenosas, porque uma posterior remoção da agulha permitirá um refluxo de sangue venoso para o agulha e o resultado em uma dosagem imprecisa.
  22. Retire a agulha do local da injeção, uma vez que o volume desejado é entregue. Como pode haver algum sangramento do navio punção site com injeções intravenosas, mantenha a pressão com o lado da agulha para 10-15 s para parar o sangramento.
  23. Prossiga para o próximo feto. Continue até que todos os fetos do corno uterino direito foram injetados.
  24. Retirar o corno uterino esquerdo do abdome e substituir o corno uterino bem para dentro da cavidade peritoneal.
    Nota: Ocasionalmente, a agulha deve ser recarregado com o injectant.
  25. Uma vez que todos os fetos foram injetados, substitua o útero no abdômen (Figura 3E). Certifique-se de evitar a Volvo uterina ou intestinal.
  26. Com uma pipeta de transferência descartável, coloque aproximadamente 2 mL de 1X PBS no abdômen para substituir quaisquer perdas insensíveis.
  27. Feche a fáscia e o abdômen em uma camada contínua usando as de 910 suturas Poliglactina 4-0 para evitar ferir os órgãos subjacentes durante o encerramento (Figura 3F - 3G).
  28. Remova a fita e transferir o mouse para uma gaiola debaixo de uma lâmpada de calor. Tenha cuidado para não colocar a lâmpada de calor demasiado perto para o mouse. Certifique-se que a gaiola tem roupa de cama, comida e água.
    Nota: Também pode ser utilizada uma câmara quente controlada termostaticamente. O rato está acordado quando está ereto e ambulante.
  29. Observar o mouse diariamente e dar a medicação para a dor, conforme necessário.
    Nota: Nós rotineiramente dar meloxicam no pós-operatório dias 1 e 2 e às vezes no dia 3 se o mouse mostra sinais de dor.
  30. Se fazer uma cirurgia de lote com o mesmo material de injeção, limpe a agulha de injeção com PBS estéril. Se injetar com um material diferente, descarte a agulha em um recipiente de objectos cortantes e usar uma agulha nova.
    Nota: Recomendamos que promover os filhotes com mães portadoras imediatamente após o nascimento, caso a barragem monta uma resposta imune aos anticorpos injectant e transferências para o filhotes através do leite.

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Resultados

Sobrevivência e enxertia são importantes medidas de sucesso para experimentos IUHCT. Consoante os pontos de extremidade específicos de um experimento, fetos que receberam um IUHCT podem ser analisados pré-natal por uma cesariana ou pós-natal. Em média, as taxas de sobrevivência após injeções intravenosas variam de 75 a 100%. As taxas de sobrevivência após injeções intra-amniótica tendem a mais sorte do que injeções intravenosas, cerca de 85-100%.

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Discussão

No útero o transplante é uma terapia potencial para muitas desordens congênitas que pode ser diagnosticada no início da gestação. O modelo murino de IUT permite que os pesquisadores para explorar o ambiente fetal ou para experimentar com diferentes terapias. Dependendo do que está sendo injetado e o que está sendo invadido, por via venosa ou intra-amniótica no utero transplante pode fornecer uma entrega confiável de um injectant para o espaço desejado.

Quando o direcionamento...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
LuvasCardinal Health2D73DP65
Adson Fórceps c/ dentesFine Science Tools11027-12
Adson Fórceps w/o dentesFine Science Tools11006-12
Tesoura curvaFine Science Tools14075-11
Tesoura PesadaFine Science Tools14002-13
Agulha DriverFine Science Tools12005-15
Vicryl 2.0EthiconJB945
Pipeta de TransferênciaMedlineGSI135010
Aplicadores com Ponta de AlgodãoMedlineMDS202000
Tubo cônico de 50 mLFischer Scientific14-432-22
Fita3M1527-1
Lubrificante para os olhosMajor LubriFresh0904-6488
Almofada de aquecimentoK& H3060
EstereomicroscópioLeicaMZ16
InjetorNarishigeHI01PK01
Tubos capilares de vidroKimble71900-100
Extrator de micropipeta verticalSutter InstrumentsP-30
Microeletrodo BevelerSutter InstrumentsBV-10
IM-300 Microinjetor PneumáticoNarishigeIM-300
Seringa de Insulina BD Filtro 305935
Genesee Scientific25-244
Compac5 Máquina de AnestesiaVetEquip Compac5901812 
IsofluranoPiramal Cuidados IntensivosNDC 66794-017-25
N2 gásAirgasNI 125
O2 gásAirgasOX 125
Ad-GFP vetor viralPenn Vector CoreH5'.040.CMV.eGFP

Referências

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