Descreveremos um protocolo para a realização de um transplante no utero (IUT) através de vias intravenosa e intra-amniótica de injeção no modelo murino. Este protocolo pode ser usado para introduzir células, vetores virais e outras substâncias em único ambiente fetal imune-tolerantes.
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Artigo de método
Intravenosa e Intra-amniótica no Utero transplante no modelo murino
Neste artigo
Resumo
Resumo
Transplante de in utero (IUT) é um modo único e versátil de terapia que pode ser usado para introduzir células-tronco, vetores virais ou quaisquer outras substâncias no início da gestação. A lógica por trás de IUT para fins terapêuticos baseia-se o pequeno tamanho do feto, a imaturidade imunológica fetal, a acessibilidade e natureza proliferativa de células estaminais ou progenitoras fetais e o potencial para tratar uma doença ou do início dos sintomas antes do nascimento. Aproveitando essas propriedades no desenvolvimento normais do feto, a entrega de células-tronco hematopoiéticas (HSC) através de uma IUT tem o potencial para tratar doenças hematológicas congénitas, tais como a doença falciforme, sem a necessária transplantes de mieloablativo ou imunossupressora condicionamento necessário para HSC pós-natal. Da mesma forma, a acessibilidade de células progenitoras em múltiplos órgãos, durante o desenvolvimento potencialmente permite um direcionamento mais eficiente de células tronco/progenitoras seguindo uma IUT de vetores virais para terapia do gene ou genoma de edição. Além disso, IUT pode ser usado para estudar os processos normais de desenvolvimento incluindo, mas não se limitando a, o desenvolvimento da tolerância imunológica. O modelo murino fornece um meio valioso e acessível para entender o potencial e as limitações da IUT antes da pré-clínicos estudos animais grandes e uma eventual aplicação clínica. Aqui, descrevemos um protocolo para a realização de uma IUT no feto através de vias intravenosa e intra-amniótica murino. Este protocolo tem sido usado com sucesso para elucidar as condições necessárias e mecanismos subjacentes no utero o transplante de células-tronco hematopoiéticas, indução de tolerância e no utero terapia de gene.
Introdução
Recentes avanços no diagnóstico e rastreio pré-natal tem trazido à luz da possibilidade de tratar o feto para um número de doenças congênitas que não tem as opções de tratamento pós-natal adequada e resultar em significativa morbidade e mortalidade. Especificamente, no utero o transplante de células-tronco hematopoiéticas (IUHCT) e edição de terapia/genoma gene têm potencial para tirar proveito das propriedades do desenvolvimento normais do feto para tratar doenças congênitas hematológica, imune e genética os transtornos mais eficientemente do que o transplante de HSC pós-natal e edição de genoma/terapia do gene podem fazer1,
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Protocolo
Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso no Hospital de Filadélfia infantil e institucional Cuidado Animal.
1. criação de pipetas de injeção
- Usando um extrator vertical micropipeta, puxe uma pipeta conta de 100 µ l (Fig. 1A - 1C). Calibre o extrator micropipeta para que a extremidade pontiaguda é > 1 cm de comprimento.
Nota: Inicialmente, as configurações do extrator devem ser ajustadas para um comprimento ideal. Um ajuste de calor maior fará com que a ponta mais longa, e um ajuste de tração maior fará com que o diâmetro da ponta mais estreita. - Corte....
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Resultados
Sobrevivência e enxertia são importantes medidas de sucesso para experimentos IUHCT. Consoante os pontos de extremidade específicos de um experimento, fetos que receberam um IUHCT podem ser analisados pré-natal por uma cesariana ou pós-natal. Em média, as taxas de sobrevivência após injeções intravenosas variam de 75 a 100%. As taxas de sobrevivência após injeções intra-amniótica tendem a mais sorte do que injeções intravenosas, cerca de 85-100%.
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Discussão
No útero o transplante é uma terapia potencial para muitas desordens congênitas que pode ser diagnosticada no início da gestação. O modelo murino de IUT permite que os pesquisadores para explorar o ambiente fetal ou para experimentar com diferentes terapias. Dependendo do que está sendo injetado e o que está sendo invadido, por via venosa ou intra-amniótica no utero transplante pode fornecer uma entrega confiável de um injectant para o espaço desejado.
Quando o direcionamento.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Luvas | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Fórceps c/ dentes | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Fórceps w/o dentes | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Tesoura curva | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Tesoura Pesada | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Agulha Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Pipeta de Transferência | Medline | GSI135010 | |
| Aplicadores com Ponta de Algodão | Medline | MDS202000 | |
| Tubo cônico de 50 mL | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Fita | 3M | 1527-1 | |
| Lubrificante para os olhos | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Almofada de aquecimento | K& H | 3060 | |
| Estereomicroscópio | Leica | MZ16 | |
| Injetor | Narishige | HI01PK01 | |
| Tubos capilares de vidro | Kimble | 71900-100 | |
| Extrator de micropipeta vertical | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microeletrodo Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Microinjetor Pneumático | Narishige | IM-300 | |
| Seringa de Insulina | BD | Filtro 305935 | |
| Genesee Scientific | 25-244 | ||
| Compac5 Máquina de Anestesia | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurano | Piramal Cuidados Intensivos | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gás | Airgas | NI 125 | |
| O2 gás | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP vetor viral | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
Referências
- Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
- Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoieti....
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Reimpressões e permissões
