Artigo de método

Ensaio de triagem à base de SA-β-galactosidase para a identificação de medicamentos Senoterapêuticos

DOI:

10.3791/58133

⸱

28 de junho de 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine and the Center on Aging, The Scripps Research Institute, 2Department of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, University of Minnesota, 3Institute on the Biology of Aging and Metabolism, University of Minnesota

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A senescência celular é o fator-chave no desenvolvimento de patologias crônicas relacionadas à idade. A identificação da terapêutica que visam as células senescentes mostra a promessa de estender o envelhecimento saudável. Aqui, nós apresentamos um ensaio novo à tela para a identificação do senotherapeutics baseado na medida da atividade associada da senescência β-galactosidase em únicas pilhas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A senescência celular é uma das marcas de envelhecimento conhecidas por influenciar negativamente uma vida saudável. Drogas capazes de matar células senescentes especificamente na cultura celular, denominado senolíticos, pode reduzir a carga celular senescente in vivo e estender healthspan. Foram identificadas várias classes de senolíticos até à data, incluindo inibidores da HSP90, inibidores da família Bcl-2, piperlongumina, um peptídeo inibitório FOXO4 e a combinação de Dasatinib/quercetina. A detecção de SA-β-GAL em um aumento do pH lisossomal é um dos melhores marcadores caracterizados para a detecção de células senescentes. Medições de células ao vivo de atividade de β-galactosidase (SA-β-GAL) associada à senescência usando o substrato fluorescente C12FDG em combinação com a determinação do número total de células usando um corante de Hoechst de intercalação de DNA abre a possibilidade de tela para medicamentos senoterapêuticos que reduzem a atividade geral de SA-β-GAL por morte de células senescentes (senolíticos) ou suprimindo SA-β-GAL e outros fenótipos de células senescentes (senomorphics). O uso de uma plataforma de aquisição e análise de imagens fluorescentes de alto conteúdo permite a triagem rápida e de alta produtividade de bibliotecas de medicamentos para efeitos em SA-β-GAL, morfologia celular e número de células.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A senescência celular foi descrita pela primeira vez por Leonard Hayflick e Paul Moorhead, que mostraram que as células normais tinham uma capacidade limitada de proliferar na cultura1. As células senescentes não proliferam apesar da presença de nutrientes, fatores de crescimento e falta de inibição de contato, mas permanecem metabolicamente ativos2. Esse fenômeno é conhecido como senescência replicativa e foi atribuído principalmente ao encurtamento do telômero, pelo menos nas células humanas3. Estudos adicionais mostraram que as células também podem ser induzidas a sofrer senescência em resposta....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O uso de animais foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Scripps Florida.

1. geração de fibroblastos embrionários senescentes murinos (MEF) – 12-15 dias

  1. Isole o tipo selvagem e o Ercc1-/- mefs dos ratos fêmeas grávidos no dia embrionário 13 (E13) como descrito previamente33.
    Nota: todas as etapas seguintes são executadas em uma capa da cultura do tecido circunstâncias assépticas e usando instrumentos estéreis.
  2. Resect a cabeça do embrião acima dos olhos.
  3. Retire o tecido vermelho (coração e fígado) e use-os para genotipagem, se necessár....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A atividade de SA-β-GAL pode ser detectada em células induzidas a continuamente por várias formas de exaustão replicativa, estresse genotóxico e oxidativo, à ativação do oncogene23,25,38. No modelo atual utilizando células de fibroblastos embrionárias com deficiência de camundongo Ercc1, as condições de crescimento normoxicas (20% O2) foram suficientes para induzir a senescênc.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SA-β-GAL é um biomarcador bem definido para a senescência celular originalmente descoberta por Dimri et al. (1995) mostrando que os fibroblastos humanos senescentes aumentaram a atividade da SA-β-GAL quando analisados em pH 623 em comparação com as células proliferantes. Entretanto, os ensaios in vitro e in vivo para SA-β-GAL foram estabelecidos para diferentes tipos de células e tecidos25,39,40........

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo NIH Grants AG043376 (Project 2 e Core A, PDR; Projeto 1 e núcleo B, LJN) e AG056278 (projeto 3 e núcleo A, PDR; e projeto 2, LJN) e uma concessão da Fundação de Glenn (LJN).

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEM Corning10-013-CVmédio
Ham's F10Gibco12390-035soro
fetalbovino Tissue Culture Biologics101soro
1x aminoácidos não essenciaisCorning25-025-Claminoácidos
bafilomicina A1 Inibidor lisossômicoSigmaB1793
C12FDGSetareh Biotech7188substrato b-Gal
Hoechst 33342 Life TechnologiesH1399Agente de intercalação de DNA
17DMAGSelleck Chemical LLC50843HSP90 inibidor
InCell6000 Sistema de Imagem CelularGE HealthcareSistema de Imagem de Alto Conteúdo
médio

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Ensaio de SA beta GalactosidaseTriagem de F rmacos Senol ticosDetec o de C lulas SenescentesImagem de Alto Conte doFluoresc ncia de C12FDGColora o com Hoechst 33342Tratamento com Bafilomicina A1Fibroblastos Embrion rios MurinosTriagem de Biblioteca de F rmacosIdentifica o de Compostos Senoterap uticos

Artigos relacionados