Correlativo luz microscopia eletrônica de varredura (CLEM) para rastreamento e Imaging proteína Viral associado estruturas nas células Cryo-imobilizado

Resumo

Um método de microscopia de elétron luz correlativo (CLEM) é aplicado às estruturas intracelulares induzida por vírus imagem através de microscopia eletrônica (EM) em células que são previamente selecionadas pela microscopia de luz (LM). LM e eme são combinados como uma abordagem de imagem híbrida para alcançar uma visão integrada das interações do vírus-anfitrião.

Resumo

Devido a sua alta resolução, microscopia de elétron (EM) é uma ferramenta indispensável para virologistas. No entanto, uma das principais dificuldades ao analisar as células infectadas por vírus ou transfectadas através EM são a baixa eficiência de infecção ou de transfeccao, dificultando o exame dessas células. Para superar esta dificuldade, microscopia de luz (LM) pode ser realizada primeiramente para alocar a subpopulação de células transfectadas ou infectadas. Assim, aproveitando-se do uso de proteínas fluorescentes (FPs) fundiu a proteínas virais, LM é usado aqui para gravar as posições das células "positivo-transfectadas", expressando uma FP e crescendo num suporte com um alfanumérico padrão. Posteriormente, as células são transformadas posteriormente para EM através de pressão alta (HPF) de congelamento, congelar a substituição (FS) e a incorporação de resina. A etapa de congela ultra-rápida garante preservação excelente da membrana das células selecionadas que pode ser analisado a nível ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Aqui, é fornecido um fluxo de trabalho passo a passo correlativo luz microscopia de elétron (CLEM), descrevendo a preparação da amostra, imagiologia e correlação em detalhe. O delineamento experimental também pode ser aplicado para resolver muitas questões de biologia celular.

Introdução

A ideia de combinar duas modalidades de microscopia para obter uma melhor imagem de um processo biológico específico é muito antiga. Assim, o primeiro estudo sobre vírus usando "microscopia correlativa" foi publicado em 1960 como duas publicações separadas^1,2. Nesse estudo, os autores analisaram as alterações na morfologia do núcleo induzido por adenovírus, por meio de duas técnicas de microscopia. Na primeira publicação, observações de microscopia de elétron (EM) descrevendo os detalhes morfológicos associados com infecção por adenovírus foram relatados¹. Em uma segunda publicação, as diferentes estruturas observadas por EM foram correlacionadas com imagens de microscopia de luz (LM) de padrões de coloração histoquímicos, para definir a natureza das estruturas anteriormente observado por EM².

Nesses primeiros estudos, no entanto, as suas observações foram realizadas usando diferentes células infectadas preparadas como experimentos independentes. A "correlação", na verdade, era como a combinação de informações provenientes de duas modalidades de imagem para compreender um determinado fenômeno, comparando todos os resultados que foram obtidos com ensaios diferentes a fim de compreender um dado biológico processo.

Hoje em dia, a termo correlativo a microscopia, também conhecido como correlativo luz e microscopia eletrônica de varredura (CLEM), é aplicada a um número crescente de métodos (revisto em referências^3,4,5), com as características comuns que ambas as técnicas de imagem (LM e eme) são realizadas na mesma amostra. A combinação de ambos os métodos resulta, desse modo, em uma análise multimodal, multi-escala e multi-dimensional de que amostra³. As vantagens são que a LM pode fornecer uma visão ampla de muitas células diferentes, permitindo a identificação de subpopulações de células expressando uma proteína ou as proteínas de interesse dentro de uma população celular heterogênea. EM supera o limite de resolução de LM, proporcionando uma maior resolução de imagem de um determinado evento intracelular. Além disso, EM permite a visualização do contexto não-fluorescente subcellular, incluindo todas as organelas de membrana acoplada, grandes complexos macromoleculares (por exemplo, ribossomos, centríolos, etc) e elementos do citoesqueleto, desse modo fornecendo informações espaciais adicionais, o chamado "espaço de referência"⁶e dando o contexto para o spot fluorescente detectado pelo LM.

Durante os últimos anos, CLEM tornou-se uma ferramenta poderosa, não só para a célula biólogos⁵, mas também para virologistas (revistas em referência⁷) dispostos a entender as interações vírus-célula complexas que levam a uma propagação de vírus de sucesso. Assim, compreender como vírus modificam as membranas celulares e organelas para benefício próprio é essencial para desenvolver medicamentos antivirais para erradicar o vírus patogénicos.

Aqui, um método de CLEM é descrito que permite a detecção por LM de celulas que expressam proteínas virais fundidas a uma proteína fluorescente (FP). Estas células são posteriormente cryo-imobilizado e mais preparado para análise ultraestrutural através de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para ganhar novos insights sobre como a expressão destas proteínas rearranjar as membranas intracelulares (Figura 1). CLEM tem sido realizado com células quimicamente fixas na maioria dos estudos de virologia publicadas a data^{8,9,10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19}. Isto é principalmente devido à necessidade de inactivar material infeccioso por razões de segurança biológica em nível de biossegurança-2 e -3 laboratórios (BSL-2 e BSL-3), onde crio-imobilização de células geralmente não é possível. Para aquelas perguntas que exigem uma óptima preservação das membranas celulares, vitrificação através de alta pressão a frio (HPF) é, no entanto, altamente recomendada²⁰. Nesses casos, o protocolo de CLEM descrito aqui pode ser aplicado. Curiosamente, especialmente quando se trabalha com amostras infecciosas, HPF pode ser realizada em amostras que foram anteriormente quimicamente inativadas, por exemplo em laboratórios BSL-2 e BSL-3. A combinação de fixação química, seguida por HPF é uma possibilidade para lucrar pelo menos parcialmente, com as vantagens de crio-preservação métodos^21,22.

Figura 1 : Representação esquemática do fluxo de trabalho para a análise das células através de CLEM. As células crescem em discos safira estampados primeiro são analisadas por LM para localizar células expressando FPs antes da sua transformação para EM. Uma vez localizado, as células são imediatamente fixadas pelo HPF e FS para posteriormente ser incorporado em resina. Após a polimerização da resina, o suporte onde células estavam crescendo (= discos safira) deve ser retirado do bloco de resina. O bloco contendo as células incorporadas é cortado para um pequeno trapézio do qual as células restantes, expressando FPs, são seccionadas com uma faca de diamante. Seções ultra-finas são recolhidas em grades de slot e analisadas pela TEM para obter informação ultraestrutural dessas células. Esta figura é adaptada e modificada com autorização de referência²⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. preparação da safira estampada discos para cultura de células

1. Transferi os discos safira padronizados (ver Tabela de materiais), com um alfanumérico padrão gravado em uma de suas superfícies, em um tubo de centrifugação cônico de 15 mL.
   Nota: Como alternativa, os discos safira convencional 0,05 mm grosso sem alfanumérico padrão podem ser usados em que um padrão de referência é criado por carbono, revestindo-os com uma grade de localizador no topo. Para este objectivo, eles devem ser limpos com álcool antes de aplicar o padrão de carbono.
2. Lave-as com etanol. Abra as pernas de fora em uma placa de Petri com papel de filtro e deixe-os secar. Colocá-los em uma lâmina de vidro separados uns dos outros usando uma pinça longa magro.
3. Verifique com um microscópio invertido (ampliação de 4x) se o padrão de coordenadas é legível em cada disco de safira.
   Nota: Se este não for o caso, inverter os safira discos com a ajuda de uma pinça.
4. Armazene os discos safira em uma placa de Petri.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

2. célula cultura com discos safira estampados

1. Esterilize os discos safira estampados com um ultravioleta (UV) crosslinker por 5 min.
2. Leve os discos de safira para a biossegurança de cultura celular do armário. Esterilize as pinças longas com etanol no armário a biossegurança.
3. Adicione metade do meio de cultura celular (ver Tabela de materiais) para um prato de cultura de células. Transferi os discos safira cuidadosamente com uma pinça longa para o prato de cultura de células.
4. Semente de 1 x 10⁵ Huh7-Lunet células, estàvel expressando o polymerase T7 resuspended na outra metade do meio de cultura celular, para o prato de cultura.
   Nota: Calcular o número de células a ser semeado de tal forma que, no ponto final do experimento, a confluência de célula deve ser não mais de 20 a 30%. Densidade de pilha alta vai dificultar a deslocalização das células em estágios posteriores pela EM. Além disso, acabou-confluência pode resultar no desprendimento de células a partir de discos de safira.
5. Verificar que os discos safira continuam no fundo do prato a cultura e que as coordenadas alfanuméricas ainda legíveis com o microscópio invertido.
   Nota: Se os discos flutuam em meio de cultura de células, use a pinça longa para empurrar os discos para a parte inferior e, eventualmente, para lançá-los de volta para a orientação correta.
6. Transfect as células no dia seguinte, como já relatado em referências^21,23 , seguindo as instruções do fabricante do agente do transfection.

3. LM imagem de células crescendo em discos safira estampados

1. Os discos de safira no ponto final do experimento de transferência para uma placa de metal de imagens contendo 30 – 50 µ l / posição de pH indicador livre médio e reduzir a fluorescência de fundo inespecífica.
   Nota: A placa de metal, descrita aqui (Figura 2) foi concebida no workshop europeu laboratório de Biologia Molecular (EMBL). Na ausência de um prato ou uma semelhante, pratos de cultura de célula de vidro-fundo podem ser também usados para LM. É importante mudar o meio de cultura celular normal para meio sem indicador de pH. Observe também que os longos tempos de exposição devem ser evitados porque eles podem causar fotobranqueamento, levando a acúmulo de (ROS) de espécies reativas de oxigênio e danos fisiológicos das células^24,25.
2. As células sob um microscópio de fluorescência widefield invertida da imagem.
   Nota: Quando utilizar uma proteína verde fluorescente (GFP)-etiquetada proteína, conforme os resultados representativos, 450 – 490 nm e 500 – 550 nm filtros excitação e emissão, respectivamente, deve ser usada.
3. Adquira primeiro uma imagem de baixa ampliação (10 – 20 X) das células para alocar células expressando FPs. Record as coordenadas dos discos safira modelados onde localizam-se as células de interesse usando microscopia de interferência diferencial (DIC) de contraste.
   Nota: Costura várias áreas pode ajudar a ter uma melhor visão da localização da célula/células de interesse. Observe que também a microscopia de contraste de fase pode ser opcionalmente usada aqui.
4. Adquira imagens de alta ampliação (fluorescência e DIC) (63 – 100 X, objectivos de imersão de óleo) das célula ou células mesmas discernir melhor a Localização subcellular da proteína de interesse dentro do espaço intracelular.
   Nota: Imagens DIC fornecem informações contextuais. Esta informação é frequentemente crítica para correlacionar imagens LM com micrografias EM adiante, porque a correlação final é mais precisa com pontos "anatômicos" da célula. Como alguns discos safira podem quebrar durante a cryo-imobilização, é altamente recomendável para preparar triplica por condição. Além disso, algumas células desapegar dos discos durante HPF e as etapas subsequentes do presente protocolo, enquanto a ultraestrutura de outras células pode conter artefatos em consequência de danos a congelar. Portanto, pelo menos duas áreas dos discos devem ser fotografadas através de LM para garantir que, no final, haverá células suficientes para ser analisado. Importante, nestas duas áreas devem estar em lados opostos do disco. Desta forma, o bloco de resina, onde as células são incorporadas pode ser cortado em duas metades e seções dessas áreas podem ser obtidas.

Figura 2 : Esquema para o tratamento de imagens de LM de células crescendo em estampados discos safira. (A) os discos safira são transferidos com a ajuda de uma pinça fina para uma placa de imagem. (B-C) Este prato foi especialmente concebido para o workshop EMBL, em Heidelberg para se encaixar o microscópio de luz, onde os discos de safira podem ser fotografados com meio de cultura celular sem indicador de pH. Consiste em uma lâmina de metal, 75 milímetros x 25 mm x 1, com quatro e cinco furos moídos nele com uma broca de 3 mm para ajustar o tamanho dos discos safira. Além disso, pequenos sulcos foram moídos em cada lado dos furos em um ângulo de 90°. Estes buracos mais fácil acessar os discos com pinça quando manipulá-los. Para permitir condições óptimas de imagem as lamelas de vidro n º 0 (0,085 para 0,13 mm de espessura) foram coladas abaixo os furos com cola UV e colocadas sob luz UV para endurecer. (D) imagem de alta magnificação do disco safira modelado representando as coordenadas alfanuméricas que estão gravadas em sua superfície. Os discos de safira estampados são comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Cryo-imobilização de células crescendo na Sapphire estampado discos através de HPF

1. Coloque os "A" e "B" suportes de alumínio para HPF (ver Tabela de materiais) em uma placa de Petri com papel de filtro embebido com 1-hexadecene. Mergulhe os discos safira padronizados contendo as células em uma placa de Petri com 1-hexadecene.
   Nota: Mova os discos um pouco para lavar o meio de cultura celular.
2. Monte os discos safira entre um "A" e um portador de alumínio "B" no porta-HPF como segue (Figura 3B). Na parte inferior, coloque um portador de "B" com seu lado liso voltado para cima. Coloque os discos safira deste lado liso com as células para cima. Adicione uma "A" transportadora com sua profundidade de 0, 1mm enfrentando as células.
   Nota: Porque os discos safira estampados são mais espessas do que os discos convencionais de safira, a transportadora comercialmente disponível "A" (projetada para ser usado com discos safira não-padrão de 0,05 mm) teve que ser cortado até 0,05 mm em deste lado de 0,2 mm de profundidade no EMBL oficina para caber no porta-HPF(Figura 3). Para este objectivo, a "A" transportadora é inserida a extremidade de um tubo de metal para que seu lado de 0.2 mm é exposto e permanece parado enquanto cortá-la. O corte para baixo lado então é lixado para que é plana. Alternativamente, um portador de alumínio especial pode ser usado em cima do disco de safira padronizado (comercialmente disponíveis, consulte a Tabela de materiais), sendo neste caso o HPF "sanduíche" composta por apenas o disco de safira e desta transportadora.
3. Feche o suporte da máquina HPF e congelar as células.
   Nota: Este protocolo é específico para uma determinada máquina HPF. Outras máquinas de HPF podem ser usado como alternativa^6,26. Em qualquer caso, por favor esteja ciente da existência de máquinas de nova geração dos fornecedores.
   Atenção: Utilize óculos de segurança e auricular de proteção auditiva.
4. Coloque o "sanduíche" congelado em uma caixa de poliestireno com nitrogênio líquido para armazenamento temporário.
   Atenção: Utilize óculos de proteção e entrar em contato com os oficiais de segurança local a ser informado sobre os potenciais perigos ao manusear o nitrogênio líquido.
   1. Para evitar confusão, coloque cada "sanduíche" em um tubo de microcentrifugadora separadas de 0,5 mL (dentro da caixa de poliestireno) marcado com um número.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Se a substituição de congelamento (FS) não pode ser executada imediatamente, as amostras podem ser armazenadas em crio-tubos (com um buraco no topo) dentro de caixas, que são mantidas em um rack em um nitrogênio líquido criogênico dewar (ver Tabela de materiais). Este contêiner de nitrogênio líquido deve ser localizada em uma sala com sensores de gás oxigênio, para evitar asfixia no caso de uma deficiência de oxigênio.
      Atenção: Todos os procedimentos descritos a seguir (passos 5 e 6) devem ser realizados em uma armário de biossegurança. Além disso, a maioria dos reagentes utilizados são perigosas. Antes de usá-los, é obrigatório ler cuidadosamente o Material Safety Data Sheets fornecidas pelos fabricantes, bem como perguntar os oficiais de segurança sobre as regras locais para garantir a segurança da manipulação. Para o descarte correto destes materiais usados, bem como o uso adequado dos equipamentos descritos abaixo, também é necessário consultar os procedimentos de segurança e saúde do Instituto local.

Figura 3 : Esquema da Assembleia da safira estampada discos entre dois suportes de alumínio para HPF. (A) fraque vistas de uma operadora convencional "A", que tem de ser cortado na parte mais profunda de 0,2 mm a 0,05 mm. (B) o disco de safira grosso 0,16 mm com o alfanumérico padrão gravado na superfície é montada em dois suportes de alumínio para HPF , como segue: O disco de safira é colocado no lado liso de uma operadora "B" com as células para cima. Uma picada "Uma" transportadora com sua profundidade de 0, 1mm enfrentando as células é colocada em cima para fechar o "sanduíche de HPF". Os portadores de alumínio e os discos safira estampados são comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. FS de células Cryo-fixo

1. Encha a máquina FS (ver Tabela de materiais) com nitrogênio líquido. Definir a temperatura de-90 ° C e espere que a máquina atinja esta temperatura.
2. Prepare o suporte de FS contendo 0,2% de tetróxido de ósmio (OsO₄) (v/v), 0,1% acetato de uranilo (UA) (p/v) em acetona destilada vidro enquanto a máquina FS está a arrefecer.
   Nota: Para preparar, (por exemplo) 12 mL de meio de FS, misture 600 µ l de 4% OsO₄com 0,012 g de urina em um recipiente de vidro pequeno. Dissolva esta mistura em um dispositivo de banho ultra-sônico por 5 min. Adicione 11,4 mL de acetona vidro-destilada com uma pipeta e misture bem.
3. Encher tubos de 1,5 mL microcentrifuga com 200-500 µ l de meio de FS, feche a tampa e transferi-los para a máquina de FS. Espere 10 minutos para o meio de FS refrigerar para baixo.
4. Transferi os sanduíches"congelados" que contém os discos safira com células em nitrogênio líquido, usando uma pinça longa refrigerada, para os tubos contendo o meio de FS.
   Atenção: Utilize óculos e luvas de cryo-protetor.
   Nota: O HPF "sanduíches" poderia ser desmontada espontaneamente durante sua manipulação. Neste caso, certifique-se de que os discos de safiras congelados são transferidos para os tubos do microcentrifuge. Os portadores de alumínio podem ser descartados.
5. Execute o FS como segue até o próximo dia²⁷: de-90 ° C a-80 ° C durante 8 h; de-80 ° C a-50 ° C para 8 h; de-50 ° C a-20 ° C durante 2 h; de-20 ° C a 0 ° C por 2 h.

6. resina incorporação de congelamento substituído amostras

Cuidado: Todos os procedimentos descritos abaixo devem ser realizados em uma armário de biossegurança. Além disso, a maioria dos reagentes utilizados são perigosas. Antes de usá-los, é obrigatório ler cuidadosamente o Material Safety Data Sheets fornecidas pelos fabricantes, bem como perguntar os oficiais de segurança sobre as regras locais para garantir a segurança da manipulação. Para o descarte correto destes materiais usados, bem como o uso adequado dos equipamentos descritos abaixo, também é necessário consultar os procedimentos de segurança e saúde do Instituto local.

1. Retire os espécimes substituídos da máquina FS e colocá-los no gelo por 20 min.
2. Manter as amostras à temperatura ambiente por 20 min e lave-as (3 vezes, 10 min cada) com acetona vidro-destilada. Descarte as transportadoras de alumínio com uma pinça longa se eles ainda estão em tubos de microcentrifuga após o FS.
3. Infiltrar-se as células (sobre os restantes discos safira) em uma série de resina epóxi de quatro etapas usando incubação do 1h em 25%, 50% e 75% de resina em vidro-destilada acetona, seguida de incubação durante a noite com 100% de resina. Troca a resina 100% no dia seguinte por 1h.
4. Cuidadosamente coloque os discos safira em escoamento anéis montados no reagente banhos preenchidos com resina 100%. Estes anéis são utilizados como moldes de polimerização para 10 discos safira.
   Nota: Os discos de safira devem ser completamente pressionados ao fundo com as coordenadas para cima em uma forma legível. Isto pode ser verificado com a ajuda de um binóculo anexado a um extractor de fumos. Alternativamente, um binóculo dentro de um armário de biossegurança pode ser usado em vez disso. Importante, há um número (1-10) gravado na parte inferior dos reagentes que ajudam a identificar as amostras.  Além disso, para identificação das amostras, uma etiqueta de papel poderia ser incluída no bloco de resina.
5. Polimerizar as amostras na estufa a 60 ° C por 48 h.

7. remoção de discos safira padronizadas de blocos de resina polimerizada

1. Remova os blocos de resina dura que contém as células do forno.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Se não, deixe o esfriar de blocos até à temperatura antes de cortá-los.
2. Corte os moldes de encastre com uma lâmina de barbear para ter acesso a blocos de resina. Remova os blocos de resina cilíndrica usando uma pinça.
   Nota: Se uma etiqueta de papel não tenha sido incluída em resina bloquear antes de polimerização, o número dos blocos com um marcador permanente e armazená-los em tubos de 1,5 mL microcentrifuga. O protocolo pode ser pausado aqui.
3. Mergulhe a ponta do bloco de resina que contém o disco de safira em uma caixa de poliestireno contendo nitrogênio líquido até parar "borbulhando". Em seguida, mergulhe a ponta do bloco de resina em ebulição H₂O.
4. Repita as duas etapas anteriores, tantas vezes quanto necessário até que o disco safira cai fora do bloco de resina.
   Atenção: Utilize óculos e luvas de cryo-protetor.
   Nota: Se isso não funcionar, use uma lâmina de barbear para remover um pouco da resina polimerizada em torno dos discos antes de tentar novamente. O protocolo pode ser pausado aqui.

8. desbaste e corte ultrafino para TEM como alvo

1. Identifica a área na face do bloco de resina, onde as células de interesse estão presentes, examinando o rosto de bloco com o binóculo de um ultramicrotome.
   Nota: A impressão negativa do padrão coordenada dos discos safira padronizados é retida na face do bloco. Isto permite a identificação da área onde as células de interesse estão localizadas para o aparamento de alvo. As imagens de LM devem ser invertidas verticalmente para facilitar a descoberta da mesma posição da face do bloco.
2. Aparar a monocamada celular incorporado que contém as célula/células de interesse para uma pequena pirâmide plana com a forma de um trapézio (~ 200 µm x 250 µm tamanho médio) com uma lâmina de barbear limpa.
3. Obter seções ultra-finas de 70 nm das células incorporadas com uma faca de diamante de 35°.
4. Coloca as seções nas grades de slot EM com a ajuda de pinças de microfuros.
   Nota:: o uso de malha grades devem ser evitadas porque as seções poderiam ser mascaradas pelas barras de grelha.
5. Armazene as grades em uma caixa de grade.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

9. TEM análise de seções ultra-finas

1. Coloque a grade do slot no suporte do microscópio de elétron da transmissão. Adquira imagens de baixa ampliação (visão geral), onde o perfil completo de célula da célula de interesse é visível.
   Nota:: as célula ou células de interesse pode ser encontradas voltar usando os perfis de célula e as localizações das células para o outro como referências, comparando as opiniões DIC adquirido antes por LM.
2. Adquira imagens de alta ampliação das célula ou células de interesse, para tentar encontrar, ao nível ultraestrutural, características que correspondem aos sinais fluorescentes observados anteriormente por LM.
   Nota: Imagens de montagem podem ser obtidas em alta ampliação para ter uma visão geral em alta resolução das célula ou células de interesse. Além disso, muitas vezes é necessário adquirir imagens da mesma célula em seções de série consecutivas para ser capaz de reconstruir a célula em 3D antes de comparar as imagens de fluorescência.

Resultados

Usando o procedimento aqui apresentado (Figura 1), células Huh7-Lunet estàvel expressando o T7-RNA polimerase foram semeadas em discos safiras estampados e posteriormente transfected com um plasmídeo expressando dois domínios do vírus da hepatite C (HCV) proteínas não-estruturais NS5A, marcados com GFP (GFP-D1-pTM_AH) (Figura 4). No dia seguinte, os discos safira padronizados, onde as células estavam crescendo, foram retirados os pratos de cultura celular e fotografados por meio de LM (Figura 4, Figura 2). Essas células expressando o AH-D1-GFP foram identificadas pela presença de fluorescência verde no citosol e gravadas para salvar suas posições dentro do padrão de coordenada dos discos safira (figuras 5A, 5B). Imediatamente após o seu exame de LM, os safira discos contendo as células de interesse foram montadas entre duas operadoras de alumínio (Figura 3) e submetidos a cryo-imobilização HPF. As células foram então congelar substituídos e posteriormente incorporado em uma resina epóxi.

Após a remoção dos discos safira de blocos de resina polimerizada, a impressão do alfanumérico padrão era visível na face do bloco, que permitiu recuperar as áreas onde se localizavam as células de interesse. O resto do bloco de resina foi aparado fora para gerar um pequeno trapézio abrigando as células de interesse. Seções ultra-finas seriais foram obtidas a partir deste trapézio, coletadas nas grades de slot EM e mais analisadas pela TEM (Figura 5-C). Nota que obter manualmente seriais seções consecutivas, embora viável²⁸ é de trabalho intensivo e exige pessoal bem treinado e qualificado. Também é importante que as células têm uma confluência de baixa quando submetido a este protocolo de CLEM (Figura 5A) a fim de garantir um rápido reconhecimento da mesma célula anteriormente identificado por LM. Caso contrário, ter maior confluência de célula pode dramàtica abrandar a localização bem-sucedida de células ao nível EM.

Análise de temperatura de várias seções ultra-finas da célula de interesse (figuras 5, 5E), expressando o AH-D1-GFP, revelaram a presença em seu espaço intracelular de grandes acumulações de vesículas de morfologia variável, delimitada a partir da cercando o citosol por uma único lipídica (Figura 5E).

Figura 4 : Representação esquemática do fluxo de trabalho seguido para executar o exemplo de CLEM retratado em Figura 5 . Células Huh7-Lunet estàvel expressando o T7-RNA polimerase foram transfectadas com um plasmídeo de DNA codificação a hélice anfipática (AH) e o domínio 1 (D1) de proteína de HCV NS5A, marcados no seu C-terminal com GFP (pTM_AH-D1-GFP). A expressão desta parte da proteína NS5A é controlada transcricionalmente por um promotor T7 (T7 Pm) e translationally por um elemento de IRES (local de entrada do Ribossoma interno) de virus, (EMCV) encefalomiocardite, indicada por uma estrutura secundária. Células de transfeccao pós (24 hpt) 24 h crescendo padronizado discos safira e expressando o AH-D1-GFP foram detectados pelo LM e imediatamente submetido ao HPF-FS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Exemplo de um procedimento de CLEM. (A) Huh7-Lunet células estàvel expressando o polymerase T7 analisado por microscopia de fluorescência para alocar células GFP-positivo cultivadas em discos safira estampados, 24h depois do transfection com o plasmídeo pTM_AH-D1-GFP. (B) imagem de ampliação mais elevada de uma única célula selecionada dentro do retângulo tracejado branco para ser analisado por CLEM. Imagem de temperatura (C) de uma seção ultrafino da mesma célula após HPF, FS e incorporação de resina. (D) representação esquemática de seções ultra-finas de série 70-nm em uma grade de slot EM que contém a célula de interesse. (E) à esquerda: súmulas TEM duas seções da célula de interesse. À direita: imagens de temperatura alta ampliação das áreas intracelulares selecionadas em retângulos amarelos à esquerda, revelando o elevado número de vesículas delimitadas do citosol através de uma membrana única. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A metodologia de CLEM apresentada aqui para estudar o impacto de uma expressão de proteínas virais na membrana celular tem sido usada com sucesso antes elucidar o VHC associada a replicação de estruturas, principalmente membrana dupla vesículas (DMVs)²¹, bem como para Determine os blocos de construção críticos necessários para formar essas estruturas induzida pelo HCV²³. Observe que, no nosso primeiro trabalho usando CLEM para estudo de replicação do HCV²¹, aplicou-se uma versão ligeiramente modificada do protocolo descrito aqui. Nesse estudo, grossa e safira discos convencionais de 0,05 mm, sem alfanumérico padrão, foram utilizadas, em que um padrão de referência foi criado por carbono, revestindo-os com uma grade de localizador no topo (ver Tabela de materiais). Esta versão do protocolo atual pode ser eventualmente aplicada, com a vantagem de que a "A" transportadora para HPF pode ser usada diretamente, sem a necessidade de cortá-la como na Figura 3. Alternativamente, como mencionado no protocolo, um mais grosso "Por" portador pode ser utilizado (ver Tabela de materiais) com discos safira estampados, sem a necessidade de uma operadora "B".

Curiosamente, este protocolo pode ser aplicado não só para estudar amostras de BSL-1, tais como células transfectadas com proteínas virais como descrito aqui e alhures^19,23, mas também para estudar células infectadas por vírus. Apesar de trabalhar com patógenos humanos é geralmente restrito aos laboratórios BSL-2 e BSL-3, em alguns países é ainda possível realizar cryo-imobilização nestas condições de biossegurança. Nessas BSL-2 e BSL-3 laboratórios onde vitrificação não é possível, devido os regulamentos locais ou a ausência de uma máquina de HPF, células infectadas por vírus podem ser ainda preparadas usando este método se fixação química com aldeídos é efectuada antecipadamente, ou seja, antes deixando as instalações BSL-2 ou BSL-3. Além disso, aldeídos precisam ser saciada imediatamente após a fixação, para manter a fluorescência, enquanto o resto do protocolo é idêntico ao descrito aqui. Esta técnica pode ser considerada redundante porque as células são fixadas duas vezes, quimicamente e através de vitrificação. No entanto, este protocolo duplo fixação leva realmente a uma preservação muito melhor das DMVs induzida pelo VHC em comparação com as DMVs encontradas nas células submetidas a fixação química sozinho²¹.

Para maiores modificações e solução de problemas o leitor são referidos as notas em toda a parte do protocolo deste manuscrito. Estas notas descrevem armadilhas a evitar, bem como alternativas para superar dificuldades putativos que possam surgir ao realizar este método.

O principal requisito para a aplicação desta técnica é uma máquina de HPF. Quando crio-imobilizando as células através de HPF não é viável (devido à ausência de uma máquina de HPF) ou não é necessário (quando a preservação da membrana não precisa ser o ideal), as células podem ser quimicamente fixa e posteriormente preparado e analisado por EM^{8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19}. Esta opção não requer o uso de discos safira, mas pratos de cultura celular com padrões em grade para relocação de células ou aglomerados de células. A principal vantagem da utilização desses pratos é seu maior diâmetro em comparação com discos safira, permitindo a seleção de áreas de superfície maiores. Assim, a aplicação do presente protocolo CLEM tem foi aplicada com sucesso para estudar o efeito de um composto de antiviral contra o HCV¹⁵ ou visualizar os rearranjos de membrana induzidos por proteínas não-estruturais de norovírus¹⁹. Outra questão que pode limitar o desempenho deste método é a ausência de um dispositivo comercial de FS. Neste caso, sistemas básicos de FS caseiros podem ser utilizados em vez disso. Apesar de dispositivos automáticos de FS podem reduzir a manipulação de percalços, dispositivos caseiros são usados com sucesso por exemplo no^{30 de Kent McDonald} e laboratórios de Paul Walther.

No que diz respeito a fixação química, o protocolo descrito aqui garante uma óptima preservação das estruturas intracelulares²⁰. Portanto, no caso dos dispositivos acima mencionados, HPF e FS disponíveis, vitrificante as células de interesse seria preferido.

Alternativas futuras para esta abordagem de CLEM incluem a possibilidade de utilizar este método não só para adquirir informações 2D ao nível ultraestrutural, mas também para ganhar 3D informações sobre a arquitetura de membrana e organela alterações causadas por vírus. Os métodos EM 3D-, incluindo tomografia de elétrons (ET) e microscopia eletrônica varredura de feixe de íon focalizado (FIB-SEM) (extensivamente descrito em²⁹), poderiam ser também aplicados às células que foram preparadas seguindo este protocolo atual^{21, 31}. Além disso, 3D poderiam ser igualmente obtidas informações a nível de LM, quando usando um microscópio confocal, que permite a aquisição de z-pilhas. Na verdade, esta opção é altamente recomendada quando uma correlação precisa entre LM e EM conjuntos de dados desejada (veja por exemplo¹⁷). As informações incluídas na aids z-pilhas 3D para melhorar a correlação com as imagens 2D de temperatura. Assim, em tal cenário, a melhor montagem LM e EM imagens pode ser seleccionada e em seguida submetida a um dos softwares disponíveis, como o plugin CE-CLEM do gelado (http://icy.bioimageanalysis.org/)³² ou o plugin de Marco as correspondências de correlação Imagem J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), resultando na geração de sobreposição de imagens LM-EM.

Quando são necessárias informações temporais para entender a cinética de um determinado evento, imagem de lapso de tempo pode ser usada para monitorar a dinâmica das células vivas, em combinação com EM. Durante o evento de interesse, as células são fixadas imediatamente, gerando um instantâneo"congelado" que pode ser posteriormente analisado através EM, fornecendo informações ultraestrutural detalhadas sobre aquele momento particular no momento da imobilização. Para obter esse "congelado instantâneo", após a observação em tempo real, as células podem ser quimicamente fixos³³ ou cryo-imobilizado⁶. Como muitos processos celulares ocorrem mais rapidamente do que os processos de difusão de fixação química, se possível, congelação ultra rápida deve ser executada. No entanto, é importante ter em conta que as máquinas HPF diferem em seu tempo eficaz resolução³⁴.

Além disso, embora este protocolo foi projetado para a incorporação de células em uma resina epóxi, células podem ser incorporadas também em resinas de baixa viscosidade, tais como Lowicryls, LR ouro branco ou LR. A utilização destes meios de incorporação permite preservar a antigenicidade^35,36, bem como a fluorescência^37,38 e, portanto, são utilizados principalmente para pós-incorporação na seção immunolabeling^{39 , 40} e na seção CLEM^41,42,,^43,44, onde a LM é feito após a incorporação. Ambas as abordagens (imuno-EM e na seção de CLEM) devem ser cruciais para os experimentos em que estruturas não-característica podem ser facilmente encontradas através de temperatura e/ou como um controle contra miscorrelation entre LM e EM sinais. Da mesma forma, etiquetando com anticorpos que podem ser visualizados por ambas as modalidades de imagem (LM e eme) pode ser realizado⁴⁵ para, por exemplo, identificar células transfectadas em LM (pré-incorporação de palco) e alcançar uma localização muito mais precisa do Sinal de GFP via sua rotulagem específica por imuno-EM (fase pós-incorporação). Deve ser levado em conta, no entanto, esse permeabilização seja efectuada antes do LM para permitir o acesso dos anticorpos para o espaço intracelular, o que pode resultar em uma sub-óptima preservação da arquitetura celular a nível EM. Curiosamente, este protocolo também é bem adequado para multi cor de experiências que podem ser obtidos com o uso de outras marcas fluorescentes, além de GFP (como mostrado aqui). Em conclusão, há muitas possibilidades putativos de adaptar este protocolo, tanto sobre o LM e/ou dos lados do EM, dependendo as perguntas que estão sendo abordadas. Para obter uma descrição abrangente dos outros protocolos alternativos, o leitor é referido^5,46. Independentemente de como as modalidades de microscopia são combinadas, juntos o resultado é um ganho de informações, permitindo-na compreender melhor como os vírus e suas proteínas interagem com seus anfitriões na vida real.

O passo mais crítico dentro deste método é a coleção de seções seriais das células de interesse. Como destacado na seção resultados representativos, isto requer pessoal especializado, bem como muita paciência. Importante, esta etapa é essencial para encontrar as células volta ao nível EM por duas razões. Em primeiro lugar, neste tipo de protocolo de CLEM usando pré-incorporação LM, as coordenadas são somente visíveis a nível de LM e na face do bloco de resina após a incorporação. No entanto, eles não serão visíveis nas seções pela TEM. Portanto, aparando alvejado na face do bloco para baixo para as regiões de interesse (ROIs) deve ser realizado cuidadosamente com uma lâmina de barbear para garantir que as seções que são posteriormente obtidas contêm as células expressando um determinado FP. Em segundo lugar, "digitalização" várias seções é necessário encontrar a melhor sobreposição entre a LM e as aquisições EM. Em contraste com os métodos onde LM é realizada na fase pós-incorporação, neste caso a sobreposição EM LM-não é tão precisa. A precisão baixa sobreposição é devido a diferenças na resolução axial entre LM e EM, encolhimento durante o processamento da amostra de travessão e compressão durante o corte de⁴². No entanto, métodos eficientes de rastreamento, tais como o uso de Marcos, ajudam a encontrar as células de volta. Isso inclui a posição de uma célula para outra, bem como a forma das células e seu núcleo. A este respeito, conforme explicado no protocolo, o DIC imagens fornecem informações "anatômicos" das células que são críticos para melhorar a correlação. Alternativamente, os núcleos ou outros organelos celulares bem reconhecível (tais como mitocôndrias ou lipídicos gotículas) podem ser manchadas antes LM e usados como pontos de referência.

Finalmente, é digno de nota para mencionar que, embora este manuscrito é focado sobre a utilização desta técnica para estudos de virologia, o escopo deste projeto experimental pode ser expandido para abordar questões biológicas mais gerais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reticulador UV	Stratagene	400072	Stratalinker 1800, 230 Vac, equipado com lâmpadas UV de 254 nm, 8 Watts/cada.
Discos de safira padronizados	Escritório de Engenharia M. Wohlwend, Sennwald, Suíça	627	Eles têm um diâmetro de 0,3 mm e 0,16 mm de espessura, bem como um padrão alfanumérico gravado para permitir a realocação das células. Eles só podem ser encomendados por e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Pinças finas e longas	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	72919-SS	"Style SS", para o manuseamento de discos de safira.
Meio de cultura celular	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	41965-062	Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 2 mM de L-glutamina, aminoácidos não essenciais, 100 unidades de penicilina por ml, 100 µ g de estreptomicina por ml e 10% de soro fetal de bezerro (DMEM completo, veja abaixo). Embalagem contendo 10 frascos de 500 mL/cada.
L-glutamina	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	25030-123	Embalagem contendo 20 frascos de 100 mL/cada.
Aminoácidos não essenciais	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11140-068	Embalagem contendo 20 frascos de 100 mL/cada.
Penicilina/Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15140-163	Embalagem contendo 20 frascos de 100 mL/cada.
Soro fetal de bezerro	Sigma Aldrich, St. Louis, MI, EUA	F7524	Frasco de 50 mL
Microscópio invertido	Olympus Deutschland, Hamburgo, Alemanha	CKX41	É um microscópio invertido com opções de cabeça trinocular e capacidade de atualização de fluorescência.
Células Huh7-Lunet expressando de forma estável a RNA-polimerase T7	Disponível no laboratório do Prof. Dr. Ralf Bartenschlager	Não disponível	Entre em contato com o Prof. Bartenschlager em: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.
Reagente de transfecção Mirus TransIT-LT1	Mirus Bio LLC, Madison, EUA	MIR 2304	Reagente de transfecção de DNA de amplo espectro, baixa toxicidade. Frasco de 0,4 mL
Microscópio de fluorescência de campo amplo invertido	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Alemanha	Zeiss Observer.Z1	Microscópio de fluorescência invertida para experimentos envolvendo culturas de células vivas.
1-hexadeceno	Merck, Darmstadt, Alemanha	8220640100	Frasco de suportes de alumínio de 100 mL
"A para frezing de alta pressão (HPF)	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Suíça	241	Este é o suporte que foi usado para este protocolo e tem 2 profundidades diferentes de 0,1 e 0,2 mm. Só pode ser encomendado por e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Suportes de alumínio "B" para HPF	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Suíça	242	Este é o suporte que foi usado para este protocolo. Tem 0,3 mm de espessura. Eles só podem ser encomendados por e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Suporte de alumínio "A" para HPF (especial para trabalhar com discos de safira estampados)	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Suíça	737	Este é o suporte que pode ser usado sozinho com o disco de safira padronizado (como alternativa ao protocolo atual), sem a necessidade de um suporte "B" ou a edição do suporte "A". Tem 0,84 mm de espessura. Só pode ser encomendado por e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Discos de safira	Escritório de Engenharia M. Wohlwend, Sennwald, Suíça	405	Esses discos de safira são os "convencionais", com 0,3 mm de diâmetro e espessura de 0,05 mm . Eles também podem ser usados para CLEM como uma alternativa em vez de discos de safira padronizados.
Grades de busca	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Filadélfia, EUA	LF135-	Estas grelhas de malha 135 são utilizadas para criar um padrão alfanumérico em discos de safira "convencionais" (descritos acima) através de revestimento de carbono, para que possam ser utilizadas para CLEM. 100 grelhas/frasco.
Máquina HPF	ABRA Fluid AG, Widnau, Suíça	HPM 010	Esta máquina HPF foi usada para este protocolo.
Máquina HPF	Leica Microsystems, Viena, Áustria	EMPACT 2	"EMPACT 2", como alternativa ao uso da máquina HPM que foi utilizada neste protocolo (descrito acima).
Tubos criogênicos	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	Z763667-500EA	Para armazenamento a longo prazo de amostras crio-imobilizadas em nitrogênio líquido. Pacote contendo 500 criogeniais.
Dewar de nitrogênio líquido	Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Alemanha	GZ-05094-60	Para armazenamento a longo prazo de amostras crio-imobilizadas em nitrogênio líquido, equipadas com crio-racks com capacidade para 1600 tubos criogênicos.
Máquina de substituição automática por congelamento (AFS)	Leica Microsystems, Viena, Áustria	EM AFS2	Esta máquina executa técnicas de substituição por congelamento e redução progressiva de temperatura (PLT) e permite a incorporação e polimerização de resinas em baixa temperatura.
Tetróxido de ósmio (OsO4)	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EUA	19150	Solução aquosa a 4%, uma caixa contendo 10 ampolas de 2 ml.
Acetato de uranila (UA)	Serva, Heidelberg, Alemanha	77879.01	Frasco contendo 25 grs de (UA)-2 H2O.
Sonicator	Bandelin Electronic, Berlim, Alemanha	329	"Sonorex Super RK 31" é um banho de limpeza ultrassônico de alta potência para solução de limpeza aquosa que é usado neste protocolo para misturar OsO4 e Ua ao preparar o meio FS.
Acetona destilada em vidro	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	10015	Frasco de 100 mL
Estereomicroscópio	Leica Microsystems, Viena, Áustria	Leica M80	Estereomicroscópio de rotina para inspeções diárias, equipado com uma câmara para captura de imagens.
Resina epóxi	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	14120	Embed 812 é um kit que contém vários componentes que devem ser misturados nas proporções dadas pelos fabricantes.
Fluxo através de anéis	Leica Microsystems, Viena, Áustria	16707157	Pacote contendo 100 peças.
Banhos de reagentes	Leica Microsystems, Viena, Áustria	16707154	Pacote contendo 100 peças.
Ultramicrótomo	Leica Microsystems, Viena, Áustria	Leica EM UC7	Ultramicrótomo para preparação de seções semifinas e ultrafinas à temperatura ambiente.
Faca de diamante Ultra 35 °	Diatome Ltd., Nidau Suíça	AGG339-735	Esta faca tem um comprimento de borda de 3 mm.
Pinças ultrafinas	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EUA	E78318	"Style 3X", para manusear grelhas EM.
Grades de slot EM	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EUA	G2010-	100 grades/frasco.
Caixa de armazenamento de grade EM	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	71155	Tem capacidade para 100 grades.