Fixação pulmonar pressão constante para avaliação de enfisema em camundongos

Resumo

É apresentado aqui um protocolo útil para a fixação do pulmão que cria uma condição estável para a avaliação histológica de espécimes do pulmão de um modelo do rato do enfisema. A vantagem principal deste modelo é que pode fixar muitos pulmões com a mesma pressão constante sem colapso ou deflação do pulmão.

Resumo

O enfisema é uma característica significativa da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Os estudos que envolvem um modelo emphysematous do rato exigem a fixação óptima do pulmão para produzir espécimes histológicos de confiança do pulmão. Devido à natureza da composição estrutural do pulmão, que consiste em grande parte de ar e tecido, há um risco de que ela desmorona ou desestica durante o processo de fixação. Existem vários métodos de fixação pulmonar, cada um dos quais tem suas próprias vantagens e desvantagens. O método de fixação pulmonar aqui apresentado utiliza pressão constante para possibilitar a avaliação tecidual ideal para estudos utilizando um modelo de pulmão de camundongo emphysematoso. A principal vantagem é que ele pode corrigir muitos pulmões com a mesma condição de uma só vez. Os espécimes pulmonares são obtidos de camundongos crônicos expostos ao fumo do cigarro. A fixação pulmonar é realizada por meio de equipamentos especializados que possibilitam a produção de pressão constante. Esta pressão constante mantem o pulmão em um estado razoavelmente inflado. Assim, este método gera um espécime histológico do pulmão que é adequado para avaliar o enfisema leve induzido por fumaça de cigarro.

Introdução

A DPOC é uma das principais causas mundiais de óbito¹. A fumaça do cigarro é a causa mais importante da DPOC, mas os mecanismos de patogênese permanecem incompletamente definidos. A DPOC demonstra duas características principais, incluindo a limitação progressiva do fluxo aéreo e uma resposta inflamatória anormal do pulmão. A desordem emphysematous ocorre freqüentemente nos pulmões de pacientes de DPOC². Os achados patológicos do enfisema são caracterizados pela destruição da parede alveolar³. Várias espécies animais têm sido utilizadas para gerar modelos de DPOC in vivo (ou seja, cães, cobaias, macacos e roedores)⁴. No entanto, o mouse se tornou o mais comumente usado na construção de modelos de DPOC. Isso tem muitas vantagens, incluindo seu baixo custo, capacidade de ser geneticamente modificada, extensa disponibilidade de informação genômica, disponibilidade de anticorpos e capacidade de usar uma variedade de cepas de mouse⁵. Presentemente, não há nenhum modelo do rato que possa imitar as características cheias da DPOC humana; assim, os pesquisadores individuais devem escolher qual modelo é mais adequado para a pesquisa específica de DPOC⁶. O modelo do rato emphysematous é um de muitos modelos do rato de DPOC que estão atualmente disponíveis. Modelos adicionais incluem o modelo de exacerbação do camundongo, modelo de comorbidades sistêmicas e modelo de suscetibilidade à DPOC⁷.

O modelo emphysematous do rato pode ser gerado por diversos tipos de agentes exógenos, incluindo agentes químicos e exposição do fumo do cigarro⁴. A exposição química (por exemplo, a elastase) produz um tipo severo de enfisema, enquanto o fumo do cigarro resulta em enfisema leve^8,9. Acredita-se que a fumaça do cigarro seja a principal causa para a patogênese da DPOC; Portanto, a escolha da fumaça do cigarro como um meio para criar um modelo de mouse de DPOC é razoável¹⁰. Muitos estudos usaram fumaça de cigarro para criar enfisema no mouse. Por exemplo, Nikula et al. criaram com sucesso um modelo emphysematous do rato de B6C3F1 ratos fêmeas expondo os à fumaça de cigarro por 7 ou 13 meses¹¹. Nós igualmente estabelecemos um modelo emphysematous do rato através do marcador da senescência protein/SMP-30 ratos de KO¹². É crucial executar um método da fixação do pulmão que possa corretamente Visualizar este modelo suave do enfisema pela exposição do fumo do cigarro.

Vários métodos para fixação pulmonar foram estabelecidos¹³. No entanto, não há nenhum método padrão-ouro de fixação do tecido pulmonar para avaliação do enfisema¹⁴. Vários estudos deste laboratório mostraram que o sistema de fixação aqui apresentado é útil ao criar uma condição estável para avaliar o enfisema^{12,15,16,17,18.} A vantagem principal do sistema atual é que pode fixar muitos pulmões com a mesma circunstância em uma vez sem colapso ou deflação do pulmão. O sistema atual da fixação do pulmão usa algum equipamento especial que permita que os espécimes do pulmão sejam inflados em uma pressão constante apropriada por um período dado. Este equipamento especial consiste em três porções, incluindo um recipiente mais baixo, um recipiente superior, e uma bomba. Os espécimes pulmonares são colocados no recipiente inferior que está conectado a agentes de fixação pressurizados, resultando em uma diferença de pressão de 25 cmH₂o no nível de agentes entre os recipientes superior e inferior¹⁹.

Protocolo

Os seguintes métodos foram aprovados pelos comitês de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina da Universidade Juntendo. As directrizes para a conduta apropriada de experimentos animais, Conselho da ciência de Japão, junho 1, 2006 foram seguidas. Existem três etapas principais neste método: 1) dissecção do camundongo, 2) exsanguinação pulmonar e 3) fixação de tecidos pulmonares assistidos por equipamentos especializados. Tipicamente, os espécimes do pulmão são processados ao Embebimento após 48 h da fixação^{12,15,16,17,18}.

1. dissecção do rato

1. Meça o peso de corpo do rato, a seguir determine a quantidade de pentobarbital a administrar.
2. Injete pentobarbital via intraperitoneal em uma dosagem de 70 MGS/quilograma do peso corporal e confirme a anestesia pela ausência de reação à pitada do dedo do pé.
3. Injete a agulha em um ângulo de 45 ° até que penetre a pele e o músculo. Desenhe o êmbolo e confirme um vácuo de ar e, em seguida, injete o pentobarbital.
4. Confirme a anestesia pela ausência de movimento reflexo.
   Nota: usar o rato anestesiado em oposição a um rato eutanasiado é recomendado para a exsanguinação total do pulmão.
5. Corte a pele do rato e o músculo abdominal na linha medial, visando a área cefólica.
6. Corte lateralmente para fornecer um espaço de trabalho mais largo.

2. exsanguinação pulmonar

1. Exponha a camada de diafragma e perfure-a com fórceps.
2. Abra o espaço torácico e corte a área esternal, permitindo que os pulmões e o coração sejam vistos claramente.
3. Corte o coração no átrio esquerdo e no ventrículo direito.
4. Inserir uma cânula (24 G) na área do ventrículo direito e direcioná-la para a área cefólica até atingir a artéria pulmonar, como mostra a Figura 1.
5. Gire sobre a bomba e permita que o 1x fosfato-tampão salino (PBS) circule (aproximadamente 200 mL/h) até que todo o tecido do pulmão mude a uma cor branca.

3. fixação do tecido pulmonar

1. Retire a traquéia, pulmões e coração.
2. Libertar todos os três órgãos cortando os tecidos conjuntivos circundantes.
3. Amarre o brônquio principal direito com um fio de sutura e corte todos os lóbulos do pulmão direito.
4. (Opcional): os lóbulos do pulmão direito consistem em quatro partes. Corte estas peças do brônquio principal direito e divida as peças para processamento como amostras de tecido congelado.
5. Insira o coração e os lóbulos do pulmão esquerdo em agentes de fixação, localizados dentro de uma seringa de 10 mL.
   PRECAUÇÃO: os agentes de fixação são perigosos. Use equipamento de proteção adequado (por exemplo, luvas de borracha longas) e trabalhe em um quarto bem ventilado.
6. Criar uma condição de vácuo usando uma seringa de 10 mL para inflar o pulmão, como mostrado na Figura 2.
7. Inserir uma cânula (20 G) na traquéia e amarrar um nó.
8. Inflar o pulmão com agentes de fixação para verificar com vazamentos, usando uma seringa de 1 mL.
9. Transferência para equipamento de pressão de fixação pulmonar, conforme ilustrado na Figura 3.
10. Após períodos de fixação, retire a amostra de pulmão que amarra a traquéia com um nó.

Resultados

Conforme descrito anteriormente, o equipamento especializado, que gera pressão constante estendida, pode ser dividido em três partes (Figura 3A). A parte inferior é o ponto no qual se insere a amostra pulmonar (Figura 4a). O pulmão é conectado através de uma cânula (20 G) à ponta do fluxo de formalina usando um galo de parada de três vias (Figura 4B). A pressão é gerada a partir dos...

Discussão

O procedimento de fixação para os pulmões de roedores aqui apresentados não é novidade; no entanto, este sistema tem várias vantagens. Em primeiro lugar, pode fixar muitos pulmões (máximo de 20) com a mesma condição de uma só vez. A sociedade de patologia toxicológica afirma que a pressão para a instilação da gravidade varia de 22 – 25 cmH₂O²². Notavelmente, vários estudos têm realizado fixação pulmonar a uma pressão de 25 cmH₂O^13,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10% de formalina (solução tampão neutro de formalina)	Wako	060-01667
Pinça dobrada	Hammacher	HSC187-11
Cânula, tamanho 20G	Terumo	SR-FS2032
Cânula, tamanho 22G	Terumo	SR-OT2225C	Cânula para exsanguinar o pulmão
Fórceps	Hammacher	HSC184-10
Kimtowel	Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)	61000
Kimwipe	Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)	62011
Recipiente inferior (material de vidro acrílico)	Tokyo Science	Custom-made	Componente de equipamento de pressão
Bomba de rolo	Nissin Scientific Corp	NRP-75	Máquina de bomba para exsanguinar pulmão
Bomba de rolo RP-2000	Eyela (Tóquio Rikakikai Co. Ltd)	160200	Bomba de equipamento de pressão
Tubo de silicone Ø 9 mm	Sansyo	94-0479	Componente do equipamento de pressão
Somnopentyl (64,8 mg / mL)	Kyoritsu Seiyaku	SOM02-YA1312	Pentobarbital Tesoura cirúrgica de sódio
	Hammacher	HSB014-11
Fio de sutura, tamanho 0	Nescosuture	GA01SW
Seringa, 1 mL	Terumo	SS-01T
Seringa, 1 ml com agulha	Terumo	SS-01T2613S
Seringa, 10 mL	Terumo	SS-10ESZ
Torneira de três vias	Terumo	TS-TR1K01
Recipiente superior (material de vidro acrílico)	Tokyo Science	Componente de equipamento de pressão feito sob medida