Microfluídica interfaceamento com matrizes de microeletrodos para estudar comunicação Neuronal e propagação de sinal Axonal

Summary

Este protocolo visa demonstrar como combinar em vitro matrizes de microeletrodos com dispositivos microfluídicos para estudar a transmissão do potencial de ação em culturas neuronal. Análise de dados, ou seja, a detecção e caracterização de potenciais de ação, de propagação é realizada utilizando um novo avançado, ainda amigável e livremente disponível, ferramenta computacional.

Abstract

Matrizes de microeletrodos (MEAs) são amplamente utilizados para estudar a função neuronal em vitro. Estes dispositivos permitem simultânea gravação/estimulação não-invasiva da atividade eletrofisiológica por longos períodos. No entanto, a propriedade de sensoriamento de sinais de todas as fontes em torno de cada microeletrodos pode tornar-se desfavorável ao tentar compreender a comunicação e propagação em circuitos neuronais do sinal. Em uma rede neuronal, vários neurônios podem ser ativados simultaneamente e podem gerar potenciais de ação sobrepostas, dificultando a discriminar e controlar a propagação do sinal. Considerando esta limitação, nós estabelecemos uma configuração em vitro focada na avaliação eletrofisiológica comunicação, que é capaz de isolar e amplificar sinais axonal com alta resolução espacial e temporal. Por interfaceando dispositivos microfluídicos e MEAs, somos capazes de compartimentalizar culturas neuronal com um alinhamento bem controlado dos axônios e microeletrodos. Esta configuração permite gravações de propagação de pico com uma alta relação sinal-ruído ao longo de várias semanas. Combinado com algoritmos de análise de dados especializados, fornece quantificação detalhada de vários comunicação relacionados propriedades tais como a velocidade de propagação de falha de condução, taxa de queima, picos anterógrada e mecanismos de codificação.

Este protocolo demonstra como criar uma configuração de cultura neuronal compartimentada sobre MEAs integrada ao substrato, como cultura neurônios nesta configuração e como com êxito, gravar, analisar e interpretar os resultados de tais experiências. Aqui, nós mostramos como a configuração estabelecida simplifica a compreensão da comunicação neuronal e propagação de sinal axonal. Essas plataformas pavimentar o caminho para novos modelos em vitro com topografias de rede neuronal engenharia e controlável. Eles podem ser usados no contexto das culturas neuronais homogêneas, ou com configurações de cultura co onde, por exemplo, a comunicação entre os neurônios sensoriais e outros tipos de células é monitorizada e avaliada. Esta configuração fornece condições muito interessantes para estudar, por exemplo, neurodesenvolvimento, circuitos neuronais, informações de codificação, abordagens neurodegeneração e Epilepsias.

Introduction

Compreender a comunicação elétrica em circuitos neuronais é um passo fundamental para revelar a função normal e elaborar estratégias terapêuticas para tratar a disfunção. Os neurônios integram, computar e potenciais de ação (APs), que se propagam ao longo de seus axônios finos de relé. Técnicas eletrofisiológicas tradicionais (por exemplo, braçadeira do remendo) são técnicas poderosas para estudar a atividade neuronal, mas muitas vezes são limitadas para as maiores estruturas celulares, tais como o soma ou os dendritos. Técnicas de imagem para oferecer uma alternativa para estudar sinais axonal com alta resolução espacial, mas eles são tecnicamente difíceis de executar e não permita que a longo prazo as medidas¹. Neste contexto, a combinação de matrizes de microeletrodos (ama) e microfluídica pode dar um contributo poderoso em divulgar as propriedades fundamentais de transmissão de atividade e do sinal de neuron´s dentro de redes neuronais em vitro^{2 , 3}.

Tecnologia MEA baseia-se em gravações extracelulares de culturas neuronal. As principais vantagens desta metodologia eletrofisiológicos são sua capacidade de oferecer suporte a estimulação simultânea, a longo prazo e gravação em vários locais e em uma maneira não-invasiva de³. MEAs são feitos de biocompatíveis, altos microeletrodos condutivos e resistentes à corrosão incorporados em uma carcaça de vidro da bolacha. Eles são compatíveis com celulares convencionais cultura bio-revestimentos de, promovendo a adesão célula significativamente aumentam a resistência da selagem entre o substrato e as células^3,4. Além disso, eles são versáteis no design e podem variar em tamanho de microeletrodos, geometria e densidade. MEAs trabalham global, como vasos de cultura de células convencional com a vantagem de permitir simultâneas de imagem ao vivo e eletrofisiológica gravações/estimulação.

O uso da tecnologia MEA tem contribuído para o estudo das características importantes de redes neurais,⁵. No entanto, existem características inerentes que limitam o desempenho de MEAs para estudar comunicação e propagação de APs em um circuito neuronal. MEAs permitem gravações de simples células e estruturas subcelulares mesmo como axônios, mas quando comparado aos sinais somal, sinais axonal têm uma muito baixa relação sinal-ruído (SNR)⁶. Além disso, a característica de sensoriamento potenciais de campo extracelular de todas as fontes em torno de cada microeletrodos dificulta o rastreamento da propagação de sinal em um circuito neuronal.

Estudos recentes têm demonstrado, no entanto, que melhores condições de gravação podem ser conseguidas tendo os microeletrodos alinhados dentro de microcanais estreito no qual podem crescer axônios. Essa configuração fornece um aumento significativo do SNR tal que axonal sinais de propagação pode ser facilmente detectado^{7,8,9,10,11,12, 13}. A estratégia de aliar microfluidic dispositivos com tecnologia MEA cria um isolado eletricamente microambiente adequado para amplificar sinais axonal¹¹. Além disso, a presença de múltiplos microeletrodos sensoriamento ao longo de um disco é fundamental para detecção e caracterização de propagação do sinal axonal.

Tais plataformas em vitro com topografias altamente controlável rede neuronal podem ser adaptadas para muitas perguntas de pesquisa¹⁴. Essas plataformas são apropriadas para ser utilizados no contexto das culturas neuronais, mas podem ser expandidas para engenheiro configurações de cultura co, onde a comunicação entre os neurônios e outros tipos de células pode ser monitorizada e avaliada. Assim, esta configuração fornece condições muito interessantes para explorar uma série de estudos neurais relacionados como neurodesenvolvimento, circuitos neuronais, informações de codificação, neurodegeneração e Epilepsias. Além disso, sua combinação com modelos emergentes de de^15,de células-tronco pluripotentes induzidas humana¹⁶ pode abrir novos caminhos no desenvolvimento de terapias potenciais para doenças humanas que afetam o sistema nervoso.

Nosso laboratório está usando esta plataforma combinando microeletrodos com microfluídica (µEF) para compreender processos neuronais ao nível celular e rede e sua implicação na physio - e patológico sistema nervoso. Dado o valor de tal plataforma no campo da neurociência, o propósito do presente protocolo é demonstrar como criar uma cultura neuronal compartimentada sobre MEAs integrada ao substrato, como os neurônios de cultura nesta plataforma e como gravar com êxito, analisar e interpretar os resultados de tais experiências. Este protocolo certamente irá enriquecer a caixa de ferramentas experimental para culturas neuronal no estudo da comunicação neural.

Protocol

Todos os procedimentos que envolvam animais foram realizados de acordo com a União Europeia (UE) Directiva 2010/63/UE (transposta para a legislação portuguesa pelo Decreto-Lei 113/2013). O protocolo experimental (0421/000/000/2017) foi aprovado pelo Comitê de ética de ambos oficial autoridade portuguesa no bem-estar dos animal e a experimentação (Direção-Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV) e da instituição de acolhimento.

1. preparação de meios de cultura e outras soluções

Nota: Recentemente prepare as soluções de revestimento no dia de seu uso. As soluções de revestimento não utilizados e meios de cultura podem ser armazenados a-20 ° C ou 4 ° C, conforme detalhado abaixo.

1. Prepare-se 10 mL de um 0.05% (v/v), solução de trabalho de Poly(ethylene imine) (PEI).
   1. Prepare-se 20 mL da solução-mãe de PEI 0.25% (p/v), dissolvendo PEI purificado (ver Tabela de materiais) em água estéril.
   2. Dilua 2 mL de solução 0,25% (p/v) PEI em 8 mL de água destilada estéril. Misture bem e use. Solução não utilizada pode ser armazenada a 4 ° C.
2. Prepare-se 1 mL de uma solução de laminina 5 µ g/mL.
   1. Diluir 5 µ l de solução-mãe laminina 1 mg/mL em 995 µ l de meio basal (ver Tabela de materiais). Misture bem e use. Solução não utilizada pode ser armazenada congelados a-20 ° C por até 1-2 semanas.
3. Prepare 1 L de solução salina tampão HEPES Hank, equilibrada (H-HBSS).
   1. Prepare uma solução 1 M HEPES dissolvendo 11,9 g de pó HEPES em 50 mL de água ultrapura. Ajuste o pH para 7.2.
   2. Prepare a solução de H-HBSS (sem cálcio e magnésio), dissolvendo 5,33 mM de cloreto de potássio, 0,44 mM fosfato de potássio monobásico, cloreto de sódio 138 mM, 0.3 mM fosfato de sódio dibásico e glicose 5,6 mM em 800 mL de água ultrapura.
   3. Adicione 15 mL de solução 1 M de HEPES (concentração final de 15 mM).
   4. Ajustar o pH a 0,2-0,3 unidades abaixo o desejado pH 7,4 usando 1 N HCl ou 1 N NaOH. Adicione água ultrapura para perfazer o volume da solução final.
      Observe o pH tende a aumentar durante a filtração.
   5. Esterilize por filtração utilizando um 0,22 µm membrana de poly(ether sulfone) (PES) de porosidade.
4. Prepare-se 10 mL de H-HBSS contendo 10% inactivadas pelo calor de soro Fetal bovino (hiFBS).
   1. Dilua 1 mL de hiFBS em 9 mL de HBSS-H. Misture bem e use. Solução não utilizada pode ser armazenada a 4 ° C por 3-4 semanas.
5. Prepare-se 5 mL de 1,5 mg/mL solução de tripsina.
   1. Imediatamente antes do uso, dissolva 7,5 mg de tripsina em 5 mL de HBSS-H. Esterilize por filtração usando uma membrana PES de porosidade de 0,22 µm.
6. Prepare-se 50 mL de meio completado.
   1. Em um tubo cónico de 50 mL, misturar 48,5 mL de meio base (veja Tabela de materiais), 2% (v/v) suplemento B-27, 0.5 mM L-glutamina e 1% caneta/Strep (10.000 U/mL penicilina e estreptomicina 10.000 de µ g/mL). Complementado médio pode ser armazenado a 4 ° C por 3-4 semanas.

2. microfluídicos e preparação de dispositivos MEA

Nota: Execute etapas 2.1-2.11 no dia antes da semeadura de célula.

1. Dispositivos microfluídicos limpo para remover fabricação e outros detritos usando fita de vinil. Pressione suavemente a fita contra o dispositivo para alcançar todas as áreas do dispositivo.
2. Ar de plasma-limpar o MEA por 3 min (0,3 mbar) para limpar a superfície e torná-lo mais hidrofílico.
3. Brevemente submergir dispositivos microfluídicos em etanol a 70% e deixe-os secar ao ar livre dentro de uma capa de fluxo laminar.
4. Coloque cada MEA em uma estéril 90 mm placa de Petri e esterilizá-los por 15 min de exposição a luz ultravioleta (UV).
5. Revestir a superfície central MEA incubando com 500 µ l de solução de PEI 0.05% (v/v) pelo menos 1 h a 37 ° C.
   Nota: Conforme descrito por outros¹⁷, revestimento PEI de MEAs resulta em menor célula de cluster que o uso de revestimento poly(lysine).
6. Aspirar a solução de revestimento PEI da superfície MEA e lavar MEAs 4 x 1ml de estéril de água destilada. Tenha cuidado para não tocar na superfície MEA durante etapas de lavagem, pois isso pode danificar os eletrodos.
7. Guiado por um estereomicroscópio dentro de uma capa de fluxo laminar, centralize o chip MEA e adicionar 1 mL de água estéril para a área central de MEA.
8. Coloque o dispositivo microfluidic em cima da superfície MEA.
9. Alinhe cuidadosamente a microgrooves de dispositivo microfluidic com a grade de microeletrodos do MEA.
10. Quando corretamente alinhados, Aspire cuidadosamente o excesso de água sem tocar o MEA ou o dispositivo microfluidic.
11. Incube a µEFs durante a noite a 37 ° C, para secar e permitir a ligação completa. Para facilitar a ligação, pressione suavemente o dispositivo microfluidic contra o MEA.
    Nota: Execute a etapa 2.12 no dia da semeadura de célula.
12. Uma vez que as µEFs tenham secado completamente, carregar os poços microfluidic com 150 µ l de 5 µ g/mL de solução de revestimento de laminina e incubar a 37 ° C, durante pelo menos 2 h antes da semeadura de célula.
    Nota: Ao carregar µEF com solução de laminina, certifique-se de que a solução preenche o microgrooves. Use um aspirador para remover qualquer bolha de ar que pode estar presente dentro do microgrooves.

3. pré-frontal córtex dissecação

1. Prepare a área de dissecação para a remoção do embrião.
   1. Desinfecte a superfície de trabalho e os instrumentos cirúrgicos com etanol a 70%.
      Nota: Embora este dissecação não é um procedimento estéril, desinfecção ajuda a reduzir as chances de contaminação.
   2. Use uma fralda limpa descartável para limitar a área de dissecação e esquematizar os instrumentos cirúrgicos para a remoção do embrião.
   3. Preparar 4 pratos de Petri de 90 milímetros preenchido com H-HBSS frio e coloque-os em uma bandeja com gelo perto da área de dissecação.
2. Eutanásia em um rato Wistar tempo-grávida de E-18 por inalação de dióxido de carbono (CO₂).
3. Após a conclusão do procedimento, retire o animal da câmara de CO₂ e confirmar a morte por um método secundário de eutanásia, tais como perda de sangue.
4. Coloque o lado ventral animal a fralda descartável, pulverizar a parte inferior do abdome com 70% de etanol e, com a ajuda de pinças e tesoura, fazer uma U-forma cortar através da pele para expor o útero.
5. Cuidadosamente Retire os embriões no útero cortando qualquer tecido conjuntivo e colocá-los em um dos pratos Petri com H-HBSS frio.
6. Retire seu saco embrionário cada embrião e, com a ajuda de pinças e tesoura, decapitar o embrião.
7. A cabeça de embryo´s de transferência para uma segunda placa de Petri cheia de frio H-HBSS.
8. Repita as etapas 3.6-3.7 para cada embrião.
9. Disse o córtex pré-frontal.
   1. Transferi uma cabeça de embryo´s para um terceiro prato de Petri.
   2. Use um par de pinças para expor o cérebro.
   3. Remover o cérebro de sua cavidade e cubra-o com H-HBSS frio.
   4. Se estiver presente, remova e descarte os bulbos olfatórios. Dissecar o córtex pré-frontal e remover as meninges.
   5. Transferi os fragmentos do córtex pré-frontal para uma quarta placa de Petri preenchida com H-HBSS frio.
   6. Repita as etapas 3.9.1 - 3.9.5 para cada embrião.

4. cortical neurônios dissociação e cultura em µEF

Nota: Os procedimentos a seguir foram realizados dentro de uma capa de fluxo laminar, após 15 min de um ciclo de esterilização UV. Trabalho área de superfície, bem como todos os materiais colocados dentro do capô deve ser previamente desinfectado com etanol a 70%.

1. Conforme descrito na etapa 1.5, dissolver a tripsina previamente ponderada em 5 mL de H-HBSS e filtrar a solução.
2. Recolha os pedaços de córtex previamente dissecados em um total de 5 mL de HBSS-H. Transferi-los para um tubo cônico estéril 15 mL.
3. Adicione 2,3 mL de solução de tripsina acabadas de 1,5 mg/mL para o tubo contendo fragmentos do córtex.
4. A suspensão de misturar e incubar a 37 ° C por 15 min (brevemente agitar cada 5 min).
5. Parar a digestão do tecido e desbotar tripsina.
   1. Desprezar o sobrenadante contendo a tripsina. Adicionar 5 mL de H-HBSS contendo 10% hiFBS para inactivar a tripsina restante; Agite suavemente.
   2. Deixe fragmentos do córtex sossegar e em seguida, descartar o sobrenadante.
   3. Adicione 5 mL de HBSS-H para remover os resíduos de hiFBS. Deixe fragmentos do córtex assentar e descartar o sobrenadante.
   4. Lave novamente os fragmentos do córtex com 5 mL de HBSS-H.
   5. Deixe fragmentos do córtex assentar e descartar o sobrenadante. Adicione 5 mL de meio neuronal completado.
6. Mecanicamente, dissociar fragmentos do córtex de uma pipeta sorológica 5ml pipetando lentamente subindo e descendo para 10 - 15 vezes. Se necessário, repita o procedimento utilizando uma pipeta de pequeno calibre, até a suspensão de célula se torne homogênea.
7. Descarte os tecidos restantes indissociados filtrando a calha de suspensão celular um coador de célula 40 µm.
8. Contar as células viáveis e determinar a densidade de células.
   1. Em um microtubo, adicione 20 µ l de 0,4% (p/v) Trypan azul a uma suspensão de célula 20 µ l. Misturar bem a homogenate a solução e transferir 10 µ l para uma contagem câmara de Neubauer.
   2. Contar as células viáveis e determinar a densidade de células de células viáveis.
9. Ajustar a densidade da célula para 3,6 x 10⁷ células/mL (se necessário, centrifugar a suspensão de células).
10. Imediatamente antes da semeadura de célula, remova laminina revestimento de todos os poços do µEF. Pipete 50 µ l de meio completado a cada poço do compartimento µEF axonal.
11. Sementes de 5 µ l de suspensão de células no compartimento somal µEF. Incube a 37 ° C, durante 1 h, para permitir a fixação de células para o substrato.
12. Com cuidado, encha cada um bem de µEF com aquecido médio complementado. Transferi o µEF para uma incubadora de humidificador a 37 ° C, fornecido com 5% de CO₂.
    Nota: Para evitar a evaporação rápida de meio de cultura, coloque um microtubo aberto cheio de água dentro do prato de Petri carregando o µEF.
13. Manter as culturas durante o período necessário, substituindo 50% do meio de cultura todos os dias de segunda para terceira da cultura.
    Nota: Após os experimentos, a microfluídica pode ser separada da MEAs imergindo o µEF na água durante a noite. Se necessário, descasque delicadamente a microfluídica com a ajuda de pinças. Como pode ser limpo por incubação durante a noite com um detergente enzimático comercial de 1% (v/v) (ver Tabela de materiais).

5. gravação espontânea atividade Neuronal

Nota: Culturas de neurônios corticais embrionárias para mimcomo normalmente apresentam atividade espontânea, assim como 7 dias in vitro (DIV), mas dê estável de 2-3 semanas (14-21 DIV) para amadurecer e exibem atividade. Cabe o experimentador para decidir quando começar as medições eletrofisiológicas baseadas os objectivos do estudo. Neste protocolo, a gravação da atividade neuronal de µEF é demonstrada por meio de um sistema de gravação comercial (ver Tabela de materiais para obter detalhes de hardware), com um módulo de aquecimento incorporado. Para a realização de gravações, usamos um software livremente disponível (ver Tabela de materiais para detalhes do software).

1. Ligar o MEA gravação sistema e controlador de temperatura e permitir a placa de base aquecida do pré-amplificador para chegar a 37 ° C.
   Nota: para gravações de longa duração (> 30 min de cada vez) um também deve ter um sistema que mantém uma atmosfera de CO₂ .
2. Coloque o µEF sobre o pré-amplificador (headstage).
   Nota: Certifique-se que o chip MEA está corretamente alinhado com o número de referência na superior da borda. O chip MEA que usamos é simétrico e rotacionalmente, mas este alinhamento coincide com a orientação correta do layout pin dos eletrodos e o ID de hardware.
3. Fechar e travar a tampa do pré-amplificador.
4. Para gravar, abra o software de gravação e definir os parâmetros de gravação e o caminho dos fluxos dados gravados (consulte o manual do software para obter detalhes sobre como configurar um esquema de gravação).
   Nota: Uma aquisição com uma taxa de amostragem de 20 kHz é geralmente suficiente para a maioria dos aplicativos. Uma maior frequência de amostragem é aconselhável se mais precisão é necessário em horários de pico. Se se pretende apenas picos de registro, defina um filtro high-pass a 300 Hz, que irá atenuar os componentes de frequência mais baixos do sinal. Se dados brutos e filtrados são registrados simultaneamente, isto irá aumentar significativamente o tamanho do arquivo de dados. É sempre possível fazer filtragem off-line dos dados brutos. Para reduzir dados um tamanho de arquivo também pode limitar microeletrodos, da qual a record (por exemplo, a único microeletrodos dentro microgrooves).
5. Clique em Iniciar DAQ para iniciar a aquisição de dados. Verifique se o display mostra traços de execução de atividade e iniciar a gravação.
   Nota: O nível de ruído é geralmente ligeiramente maior nos microeletrodos correspondente a microgrooves. Se o nível de ruído é muito alto (amplitude pico-a-pico > 50 µV) ou instável em várias microeletrodos, poderia ser devido a sujeira impedindo um bom contacto pin-pad. Este problema é geralmente resolvido limpando suavemente as almofadas de contato MEA e os pinos de pré-amplificador usando um cotonete umedecido com álcool 70%.
6. Abra o arquivo gravado no software análise (consulte a Tabela de materiais) para explorar rapidamente os dados.

6. análise de dados

Nota: As etapas a seguir mostram como usar o software µSpikeHunter, uma ferramenta computacional desenvolvida no laboratório de Aguiar (disponível mediante pedido de e-mail para pauloaguiar@ineb.up.pt), para analisar os dados registrados com µEF. Uma interface gráfica do usuário (Figura 2) é usado para carregar os dados, identificar a propagação de ondas de pico, determinar sua direção (anterógrada ou retrógrada) e estimar a velocidade de propagação. µSpikeHunter é compatível com arquivos HDF5 gerados a partir de gravações obtidas usando sistemas de família MEA2100, que podem ser usados em conjunto com 60 - 120- e 256-eletrodo MEAs. As gravações obtidas usando o experimentador de canal múltiplos podem ser facilmente convertidas para arquivos HDF5 usando software livremente disponíveis (ver Tabela de materiais).

1. Clique em Browse para selecionar o arquivo de gravação. Em seguida, clique no botão de informações de arquivo para listar a taxa de amostragem, a duração da gravação, bem como uma lista dos fluxos dados gravados (por exemplo, os dados brutos, dados filtrados).
   Nota: Para estimativas de velocidade de propagação de verdade, é recomendável selecionar o fluxo de dados brutos para análise.
2. Selecione microeletrodos (única linha ou coluna associada com disco) para análise e defina o valor de limite de deteção do espigão (fase positiva ou negativa) em 6 vezes o desvio padrão (SD) do ruído do sinal. Clique em Ler dados para aplicar o detector de evento e obter as sequências de propagação identificados.
   Nota: Se os critérios forem atendidos, uma lista de sequências de propagação detectado preencherá o painel de análise. O usuário pode então Visualizar e interagir com várias ferramentas de análise para a sequência de propagação, incluindo traços de tensão, correlações cruzadas inter microeletrodas, velocidades de propagação da sequência de single, um kymograph e uma ferramenta de reprodução de áudio. Embora a estimativa de velocidade de propagação pode ser obtida para qualquer par de microeletrodos ou como a média das estimativas para todos os pares, esta estimativa é mais confiável se o par mais distante é selecionado.
3. Repita a etapa anterior para os conjuntos de microeletrodos de interesse. Cada vez clique em Salvar todos os eventos para salvar o tempo e a amplitude de espinhos (em cada um dos microeletrodos) para todas as sequências de propagação identificados para um arquivo CSV.
4. Importe os arquivos CSV para ambientes de análise de dados para posterior análise dos padrões de actividade da cultura (por exemplo, disparar taxa, intervalos de pico inter).

Results

Usando o protocolo descrito aqui, rato de E-18 de neurônios cortical semeado na µEF é capaz de desenvolver e manter-se saudável nestas condições de cultura para mais de um mês. Logo que 3 a 5 dias na cultura, os neurônios corticais crescem seus axônios através de microgrooves em direção ao compartimento axonal de µEF (Figura 1). Após 15 dias em cultura, esperam-se que apresentam níveis estáveis de atividade corticais neurônios cultivados na µEF e propagação d...

Discussion

O protocolo apresentado aqui mostra como montar um µEF, composto de um dispositivo microfluidic e um MEA com projetos padrão comercialmente disponíveis e como analisar os dados gravados.

Ao projetar um experimento, pesquisadores devem levar em conta que o modelo in vitro é limitado pela grade fixa de MEA, que restringe os arranjos do disco. O uso de um determinado microfluidic ou MEA design dependerá das necessidades específicas de experimentais, mas, em geral, as mesmas etapas do pro...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27 Suplement (50X)	Thermo Fisher Scientific	LTI17504-044
Poli(etileno imina) ramificado (PEI), 25 kDa	Sigma-Aldrich	408727	Purificar PEI ramificado por diálise usando uma membrana de corte de 2,5 kDa por 3 dias a 4° C contra uma solução de HCl 5 mM (renovada diariamente). Liofilize o PEI purificado.
Filtro de células (40 µ m)	Falcon	352340
Microtubos cônicos (1,5 ml)	VWR	211-0015
Fralda descartável, 60x40 cm	Bastos Viegas SA	455-019
Fórceps Dumont #5, reto	Ferramentas de Belas Ciências	91150-20
Fórceps Dumont #5/45	Ferramentas de Ciências Finas	11251-35
Fórceps Dumont #7, curvo	Ferramentas de Ciências Finas	91197-00
Soro Fetal Bovino Inativado por Calor Premium	Biowest	S181BH-500ML
Laminina de Engelbreth-Holm-Swarm	Sigma-Aldrich	L2020-1MG	Prepare a solução estoque de laminina a 1 mg / mL dissolvendo o pó no respectivo volume de meio não suplementado. Armazene a solução de laminina a -20 > C em alíquotas pequenas (20 µ L) para evitar ciclos repetidos de congelamento/descongelamento.
L-Glutamina 200mM	Thermo Fisher Scientific	LTID25030-024
Neubauer câmara de contagem melhorada (hemocitômetro)	Marienfeld	630010
Meio Neurobasal (1X)	Thermo Fisher Scientific	21103-049	Meio basal usado para culturas neuronais
Dispositivos microfluídicos PDMS	não aplicável	não aplicável Composto	por dois compartimentos de semeadura celular interligados por 20 microranhuras com 450 μ m comprimento e tempos; 10 μ m altura e tempos; 14 μ m de largura e separadas por 86 µ m (espaço total de 100 μ m).
Solução de penicilina-estreptomicina (P/S) (100X)	PES Biowest	L0022-100
(Ø 30 mm), 0.22 µ m	de polipropileno Frilabo	1730012
, 15 ml	Thermo Fisher Scientific	07-200-886
Tubos cônicos de polipropileno, 50 ml	Thermo Fisher Scientific	05-539-13
Pipetas sorológicas de poliestireno disposabel, 10 ml	Thermo Fisher Scientific	1367811D
Pipetas sorológicas de disposabel de poliestireno, 5 ml	Thermo Fisher Scientific	1367811D
Membrana de celulose regenerada padrão (2 kDa)	Laboratórios Spectrum	132107
Tesoura cirúrgica padrão	Ferramentas de Belas Ciências	91401-14
MEAs planares integrados ao substrato (256 microeletrodos)	Sistemas multicanais	256MEA100/30iR-ITO	252 eletrodos de registro de nitreto de titânio (TiN) e 4 eletrodos de referência internos organizados em uma grade quadrada de 16 por 16. Cada eletrodo de gravação é de 30 µ m de diâmetro e espaçado por 100 µm.
Seringa com ponta luer-lock, 10 ml	Seringa Terumo Europe	5100-X00V0
com trava luer, 50 ml	Terumo Europe	8300006682
Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	Detergente em pó enzyme-active usado para a limpeza de MEAs
Placas de cultura de tecidos, 35 mm	StemCell Technologies	27150
Placas de cultura de tecidos, 90 mm	Frilabo	900095
Solução de Azul de Tripano (0,4%)	Sigma-Aldrich	T8154
Tripsina (1:250)	Thermo Fisher Scientific	27250018
Fita de Vinil 471	3M	B40071909