Summary
Dieses Protokoll soll zeigen, wie in-vitro- Mikroelektrode Arrays mit mikrofluidischen Geräten für das Studium Aktionspotential Übertragung in neuronalen Kulturen zu verbinden. Datenanalyse, nämlich die Erkennung und Charakterisierung von Aktionspotentiale, Vermehrung ist durchgeführt mit einem neuen, erweiterten, aber benutzerfreundlich und frei verfügbar, computational Tool.
Abstract
Mikroelektrode Arrays (MEAs) werden häufig verwendet, um neuronale Funktion in-vitro-Studie. Diese Geräte ermöglichen gleichzeitige nichtinvasive Aufnahme/Stimulation der elektrophysiologischen Aktivität über einen längeren Zeitraum. Jedoch können Signale aus allen Quellen um jeden Mikroelektrode Sensing ungünstige Eigentum beim verstehen Kommunikation und Verbreitung in neuronalen Schaltkreisen zu signalisieren. In einem neuronalen Netzwerk mehrere Neuronen gleichzeitig aktivierbar und können überlappende Aktionspotentiale, macht es schwierig, zu diskriminieren und verfolgen Signalausbreitung erzeugen. In Anbetracht dieser Einschränkung haben wir eingerichtet, eine in-vitro- Setup konzentrierte sich auf die Bewertung von elektrophysiologischen Kommunikation, die in der Lage, zu isolieren und axonale Signale mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu verstärken. Durch Anbindung mikrofluidischen Geräten und MEAs, können wir neuronale Kulturen mit einem gut kontrollierten Ausrichtung der Axone und Mikroelektroden in Schubladen. Dieses Setup ermöglicht Aufnahmen von Spike Ausbreitung mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis im Laufe von mehreren Wochen. In Kombination mit speziellen Data-Analyse-Algorithmen, es bietet detaillierte Quantifizierung von mehreren Kommunikation im Zusammenhang mit Eigenschaften wie Ausbreitungsgeschwindigkeit, Wärmeleitung Versagen, Feuerrate, Anterograde Spitzen und Codierung Mechanismen.
Dieses Protokoll zeigt wie erstelle ich eine Setup unterteilte neuronalen Kultur über MEAs Substrat integriert, wie Neuronen in diesem Setup Kultur und wie erfolgreich aufzeichnen, analysieren und interpretieren die Ergebnisse solcher Experimente. Hier zeigen wir, wie die etablierten Einrichtung vereinfacht das Verständnis der neuronalen Kommunikation und axonalen Signalausbreitung. Diese Plattformen ebnen den Weg für neue in-vitro- Modelle mit engineered und steuerbare neuronalen Netzes Topografien. Sie können verwendet werden, im Zusammenhang mit der homogenen neuronalen Kulturen oder mit Kokultur Konfigurationen, z. B. Kommunikation zwischen sensorischen Neuronen und andere Zelltypen überwacht und bewertet wird. Diese Einrichtung bietet sehr interessante Konditionen zu studieren, zum Beispiel Neurodevelopment, neuronale Schaltkreise, Informationen Kodierung, Neurodegeneration und Neuroregeneration Ansätze.
Introduction
Verständnis elektrische Kommunikation in neuronalen Schaltkreisen ist ein grundlegender Schritt zur Normalfunktion zu offenbaren, und therapeutische Strategien um Funktionsstörungen zu beheben. Neuronen zu integrieren, zu berechnen und Relais Aktionspotentiale (APs), die sich entlang ihrer dünne Axone ausbreiten. Traditionelle elektrophysiologische Techniken (z.B. Patch-Clamp) sind leistungsfähige Techniken neuronalen Aktivität zu studieren, sondern beschränken sich oft auf die größeren Zellstrukturen, wie z. B. die Soma oder die Dendriten. Die bildgebenden Verfahren bieten eine Alternative zum axonale Signale mit hoher Ortsauflösung zu studieren, aber sie sind technisch schwierig zu führen und lassen keine langfristige Messungen1. In diesem Zusammenhang kann die Kombination von Mikroelektrode Arrays (MEAs) und Mikrofluidik einen mächtigen Beitrag bei der Offenlegung der grundlegenden Eigenschaften der Neuron´s Aktivität und Signal-Übertragung innerhalb neuronaler Netzwerke in-vitro-2 machen. , 3.
MEA-Technologie beruht auf extrazelluläre Aufnahmen von neuronalen Kulturen. Die Hauptvorteile dieser elektrophysiologische Methodik sind seine Fähigkeit, langfristige, gleichzeitige Stimulation und Aufnahme an mehreren Standorten und in eine nicht-invasive Weise3unterstützen. MEAs bestehen aus biokompatiblen, hoch leitfähige und korrosionsbeständig Mikroelektroden eingebettet in ein Glassubstrat Wafer. Sie sind kompatibel mit konventionellen Zelle Kultur Bio-Beschichtungen, die durch die Förderung von Zelladhäsion deutlich die Abdichtung zwischen dem Substrat und Zellen3,4zu erhöhen. Darüber hinaus sie sind vielseitig im Design und in Mikroelektroden Größe, Geometrie und Dichte variieren. Insgesamt arbeiten MEAs als konventionelle Zelle Kulturgefäße mit dem Vorteil, dass gleichzeitige live-Imaging und elektrophysiologische Aufnahmen/Stimulation.
Die Verwendung von MEA Technologie hat zum Studium der wichtigen Features von neuronalen Netzen5beigetragen. Es gibt jedoch inhärente Eigenschaften, die die Leistung von MEAs für das Studium Kommunikations- und APs Vermehrung in einem neuronalen Schaltkreis zu begrenzen. MEAs ermöglichen Aufnahmen von Einzelzellen und sogar subzellulären Strukturen wie Axone, aber im Vergleich zu somal Signale axonale Signale haben eine sehr geringe Signal-Rausch-Verhältnis (SNR)6. Darüber hinaus behindert das Merkmal des extrazellulären Bereich Potenziale aus allen Quellen um jeden Mikroelektrode sensing das Tracking der Signalausbreitung in einem neuronalen Schaltkreis.
Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass bessere Aufnahmebedingungen erreicht werden können, indem er die Mikroelektroden im engen Mikrokanäle in die Axone wachsen können ausgerichtet. Diese Konfiguration bietet eine deutliche Zunahme der SNR, dass Vermehrung axonale Signale problemlos7,8,9,10,11,12erkannt, 13. Die Strategie von verbünden mikrofluidischen Geräten mit MEA Technologie schafft eine galvanisch getrennte Mikroumgebung geeignet, axonale Signale11zu verstärken. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von mehreren Fernerkundung Mikroelektroden entlang einer Mikrorille für Erkennung und Charakterisierung von axonalen Signalausbreitung von grundlegender Bedeutung.
In-vitro- Plattformen mit sehr kontrollierbar neuronalen Netzes Topografien können viele Forschung Fragen14angepasst. Diese Plattformen können sind geeignet, um im Rahmen der neuronalen Kulturen verwendet werden aber erweitert werden um Kokultur Konfigurationen, Ingenieur, wo die Kommunikation zwischen Nervenzellen und anderen Zelltypen überwacht und bewertet werden können. Diese Einrichtung bietet somit sehr interessante Konditionen, eine Reihe von neuronalen-bezogene Studien wie Neurodevelopment, neuronale Schaltkreise, Informationscodierung, Neurodegeneration und Neuroregeneration zu erkunden. Darüber hinaus kann die Kombination mit neuen Modellen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen15,16 neue Wege bei der Entwicklung von möglichen Therapien für Krankheiten des Menschen öffnen, die das Nervensystem beeinflussen.
Unser Labor ist diese Plattform kombinieren Mikroelektroden mit Mikrofluidik (µEF) verwenden, um neuronale Prozesse auf Zell- und Netzwerk Ebene und ihre Implikation in der Physio und pathologische Nervensystem zu verstehen. Angesichts des Wertes dieser Plattform auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, die dieses Protokoll soll demonstrieren, wie eine unterteilte neuronalen Evaluierungskultur über MEAs Substrat integriert, wie man Kultur Neuronen in dieser Plattform und wie man erfolgreich aufnehmen, analysieren Sie und interpretieren Sie die Ergebnisse solcher Experimente. Dieses Protokoll wird sicherlich die experimentellen Toolbox für neuronale Kulturen in der Erforschung der neuronalen Kommunikation bereichern.
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Protocol
Alle Verfahren, die Tiere wurden nach der Europäischen Union (EU) Richtlinie 2010/63/EU ( Decreto-Lei 113/2013 zu portugiesischem Recht umgesetzt) durchgeführt. Das experimentelle (0421/000/000/2017) wurde von der Ethikkommission der beiden Portugiesisch offizielle Behörde auf Tierschutz und Experimente (Direção-Geral de alimentacao e Veterinária - DGAV) und der jeweiligen Institution genehmigt.
1. Vorbereitung der Kultur, Medien und andere Lösungen
Hinweis: Bereiten Sie die Beschichtungslösungen frisch am Tag der Nutzung. Die unbenutzten Beschichtungslösungen und Nährmedien können bei-20 ° C oder 4 ° C wie unten beschrieben gespeichert werden.
- 10 mL einer 0,05 % (V/V) Poly(ethylene imine) (PEI) funktionierende Lösung vorzubereiten.
- 20 mL von 0,25 % (w/V) PEI-Stammlösung durch Auflösen der gereinigten PEI vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien) in sterilem Wasser.
- Verdünnen Sie 2 mL von 0,25 % (w/V) PEI-Stammlösung in 8 mL sterilem destilliertem Wasser. Gut mischen und verwenden. Nicht verwendete Lösung kann bei 4 ° c gelagert werden
- 1 mL einer 5 µg/mL Laminin Lösung vorzubereiten.
- Verdünnen Sie 5 µL Laminin-Stammlösung 1 mg/mL in 995 µL der basalen Medium (siehe Tabelle der Materialien). Gut mischen und verwenden. Nicht verwendete Lösung kann für bis zu 1-2 Wochen bei-20 ° C eingefroren aufbewahrt werden.
- Bereiten Sie 1 L HEPES gepufferten Hank ausgeglichene Salzlösung (H-HBSS).
- Bereiten Sie 1 M HEPES Lösung durch Auflösen von 11,9 g HEPES Pulver in 50 mL Reinstwasser. PH-Wert auf 7,2 einstellen.
- Bereiten Sie H-HBSS Lösung (ohne Kalzium und Magnesium vor) durch Auflösen von 5,33 mM Kaliumchlorid, 0,44 mM Kalium Phosphat monobasic, Natrium-Chlorid-138 mM, 0,3 mM Natriumphosphat Diabas- und 5,6 mM Glukose in 800 mL Reinstwasser.
- 15 mL 1 M HEPES Lösung (Endkonzentration von 15 mM) hinzugeben.
- Anpassen der pH-Wert auf 0,2-0,3 Einheiten unter den gewünschten pH-Wert 7,4 mit 1 N HCl oder 1 N NaOH. Fügen Sie Reinstwasser, die Lautstärke des endgültigen Lösung zu machen.
Hinweis: pH-Wert tendiert bei der Filtration zu steigen. - Sterilisieren Sie durch Filtration mit einer 0,22 µm Porosität Poly(ether sulfone) (PES) Membrane.
- Vorbereitung 10 mL von H-HBSS mit 10 % Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum (HiFBS).
- Verdünnen Sie 1 mL HiFBS in H-HBSS 9 mL. Gut mischen und verwenden. 3-4 Wochen kann nicht verwendete Lösung bei 4 ° C aufbewahrt werden.
- Vorbereiten von 1,5 mg/mL 5 mL Trypsin-Lösung.
- Unmittelbar vor der Anwendung Auflösen von Trypsin in 5 mL H-HBSS 7,5 mg. Sterilisieren Sie durch Filtration mit einer 0,22 µm Porosität PES-Membran.
- 50 mL ergänzt Medium vorzubereiten.
- Mischen Sie in einem 50 mL konische Rohr, 48,5 mL basal Medium (siehe Tabelle der Materialien), 2 % (V/V) B-27 Ergänzung, 0,5 mM L-Glutamin und 1 % Pen/Strep (10.000 U/mL Penicillin und 10.000 µg/mL Streptomycin). Ergänzt Medium kann 3-4 Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden.
(2) mikrofluidischen und MEA Geräte Vorbereitung
Hinweis: Führen Sie Schritte 2.1-2.11 am Tag vor der Aussaat der Zelle.
- Reinigen Sie mikrofluidischen Geräte, Fertigung und andere Verunreinigungen mit Vinyl Klebeband zu entfernen. Drücken Sie vorsichtig das Klebeband gegen das Gerät alle Bereiche des Gerätes erreichen.
- Die MEA 3 min (0,3 Mbar) um die Oberfläche zu reinigen und machen es mehr hydrophile Luft Plasma zu reinigen.
- Kurz Tauchen Sie mikrofluidischen Geräten in 70 % igem Ethanol ein und es ermöglichen Sie ihnen, in einem Laminar-Flow-Kapuze an der Luft trocknen.
- Legen Sie jedes MEA in einem sterilen 90 mm Petrischale und 15 min von ultravioletten (UV) Licht Exposition zu sterilisieren.
- Mantel der MEA zentrale Fläche von Inkubation mit 500 µL 0,05 % (V/V) PEI-Lösung für mindestens 1 h bei 37 ° C.
Hinweis: Wie von anderen17beschrieben, führt PEI Beschichtung von MEAs weniger Zelle clustering als mit poly(lysine) Beschichtung. - Aspirieren der PEI Beschichtungslösung von der MEA-Oberfläche und waschen MEAs 4 X mit 1 mL sterilem destilliertem Wasser. Achten Sie darauf, um die MEA-Oberfläche nicht berühren, während Waschschritte, da dies die Elektroden beschädigen kann.
- Geleitet von einem Stereomikroskop in einem Laminar-Flow-Kapuze, Zentrieren des MEA-Chips und der zentrale Bereich des MEA 1 mL sterilem Wasser hinzufügen.
- Stellen Sie das Gerät von mikrofluidischen auf der MEA-Oberfläche.
- Richten Sie vorsichtig die Mikrospuren von mikrofluidischen Gerät mit dem Mikroelektrode Raster der MEA.
- Bei korrekter Ausrichtung aspirieren Sie vorsichtig das überschüssige Wasser ohne die MEA oder mikrofluidischen Gerät zu berühren.
- Inkubieren Sie die µEFs über Nacht bei 37 ° C zu trocknen und komplette Anlage zu ermöglichen. Um die Anlage zu erleichtern, drücken Sie vorsichtig die mikrofluidischen Gerät gegen die MEA.
Hinweis: Führen Sie Schritt 2.12 am Tag der Zelle Aussaat. - Sobald die µEFs vollständig getrocknet haben, laden die mikrofluidischen Brunnen mit 150 µL 5 µg/mL Laminin Beschichtungslösung und Inkubation bei 37 ° C für mindestens 2 h vor der Aussaat der Zelle.
Hinweis: Beim Laden von µEF mit Laminin Lösung sicherstellen Sie, dass die Lösung der Mikrospuren füllt. Verwenden Sie einen Staubsauger, um Luftblasen zu entfernen, die innerhalb der Mikrospuren vorhanden sein könnten.
(3) präfrontalen Kortex Dissektion
- Bereiten Sie die Dissektion Bereich auf das Embryo entfernen.
- Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche und die chirurgischen Instrumente mit 70 % Ethanol.
Hinweis: Obwohl diese Dissektion keine sterile Verfahren ist, hilft Desinfektion Gefahr einer Kontamination zu reduzieren. - Verwenden Sie saubere Wegwerfwindel Dissektion Bereich beschränken und legen Sie die chirurgische Instrumente für die Entfernung von Embryo.
- Bereiten Sie 4 90 mm Petrischalen gefüllt mit kalten H-HBSS und legen Sie sie auf einem Tablett mit Eis in der Nähe der Dissektion.
- Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche und die chirurgischen Instrumente mit 70 % Ethanol.
- Ein e-18 Mal schwanger Wistar Ratten durch Kohlendioxid (CO2) Inhalation einschläfern.
- Entfernen Sie nach Abschluss des Verfahrens das Tier aus der CO-2 -Kammer zu und bestätigen Sie Tod durch eine sekundäre Methode der Euthanasie, z. B. Entbluten.
- Ort der tierischen ventralen Seite nach oben auf die Wegwerfwindel, sprühen Sie das unterere Abdomen mit 70 % Ethanol und mit Hilfe von Zangen und Scheren, machen eine U-Form-Schnitt durch die Haut, die Gebärmutter verfügbar zu machen.
- Vorsichtig entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter zu, durch wegschneiden alle Bindegewebe und legen Sie sie in einem der Petrischalen mit kalten H-HBSS.
- Jeder Embryo aus seiner embryonalen Sac entfernen und mit Hilfe von Zangen und Scheren, enthaupten des Embryos.
- Übertragen Sie der Embryo´s Kopf auf einer zweiten Petrischale gefüllt mit kalten H-HBSS.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.6-3.7 für jedes Embryo.
- Den präfrontalen Kortex zu sezieren.
- Übertragen Sie ein Embryo´s Kopf auf ein Drittel Petrischale.
- Verwenden Sie ein paar Zangen, um das Gehirn aussetzen.
- Entfernen Sie das Gehirn aus der Kavität und bedecken Sie es mit kalten H-HBSS.
- Falls vorhanden, entfernen Sie und entsorgen Sie die olfaktorischen Birnen. Den präfrontalen Kortex zu sezieren und Hirnhäute zu entfernen.
- Übertragen Sie die präfrontalen Kortex-Fragmente auf einer vierten Petrischale gefüllt mit kalten H-HBSS.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.9.1 - 3.9.5 für jedes Embryo.
(4) kortikale Neuronen Dissoziation und Kultur auf µEF
Hinweis: Die folgenden Verfahren wurden in einem Laminar-Flow-Kapuze durchgeführt, nach 15 min Zyklus der UV Sterilisation. Fläche sowie alle Materialien, die im Inneren der Haube platziert sollte zuvor mit 70 % Ethanol desinfiziert werden.
- Wie in Schritt 1.5 beschrieben, lösen Sie die zuvor gewogenen Trypsin in 5 mL H-HBSS auf und Filtern Sie die Lösung.
- Sammle die Kortex Teile zuvor in insgesamt 5 mL H-HBSS seziert. Auf eine sterile 15 mL konische Rohr übertragen.
- Die Röhrchen mit den Kortex Fragmente fügen Sie 2,3 mL frisch zubereitete 1,5 mg/mL Trypsin-Lösung hinzu.
- Mischen Sie die Suspension und Inkubation bei 37 ° C für 15 min (kurz schütteln alle 5 min.).
- Gewebe-Verdauung zu stoppen und Trypsin auswaschen.
- Den Überstand enthält die Trypsin zu verwerfen. Hinzugeben Sie 5 mL H-HBSS mit 10 % HiFBS, die restlichen Trypsin zu inaktivieren; Schütteln Sie vorsichtig.
- Kortex Fragmente niederzulassen und den Überstand verwerfen zu lassen.
- Fügen Sie 5 mL H-HBSS, die HiFBS Rückstände zu entfernen. Kortex Fragmente niederzulassen und den Überstand verwerfen zu lassen.
- Waschen Sie wieder die Kortex Fragmente mit 5 mL H-HBSS.
- Kortex Fragmente niederzulassen und den Überstand verwerfen zu lassen. 5 mL ergänzt neuronalen Medium hinzugeben.
- Mechanisch distanzieren Kortex Fragmente mit einer serologischen 5 mL-Pipette durch Pipettieren langsam nach oben und unten für 10 - 15 Mal. Falls erforderlich, wiederholen Sie den Vorgang mit einer Kleinkaliber-Pipette, bis die Zellsuspension werden homogen.
- Entsorgen Sie das übrige undissoziierten Gewebe durch die Zelle Aussetzung Trog ein 40 µm Zelle Sieb filtern.
- Entwicklungsfähigen Zellen zu zählen und die Zelldichte bestimmen.
- Fügen Sie in ein Reaktionscup 20 µL von 0,4 % (w/V) Trypan blau zu einem 20 µL Zellsuspension. Mischen Sie die Lösung gut, homogenisierte und übertragen Sie 10 µL auf ein Neubauer Kammer zählen.
- Entwicklungsfähigen Zellen zu zählen und die Zelldichte der lebensfähigen Zellen zu bestimmen.
- Anpassen der Zelldichte auf 3,6 x 107 Zellen/mL (ggf. Zentrifugieren Zellsuspension).
- Unmittelbar vor der Zelle Aussaat entfernen Sie Laminin Beschichtung aus alle Brunnen der µEF. Pipette 50 µL ergänzt Medium in jede Vertiefung des axonalen Fachs µEF.
- Samen Sie 5 µL Zellsuspension in das µEF somal Fach. Inkubation bei 37 ° C für 1 h, um Zellen Befestigung auf dem Untergrund zu ermöglichen.
- Sanft zu füllen jeweils gut von µEF mit erwärmte Medium ergänzt. Übertragen der µEF auf einen Luftbefeuchter Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2geliefert.
Hinweis: Um schnelle Kulturmedium Verdunstung zu vermeiden, legen Sie eine geöffnete Reaktionscup, gefüllt mit Wasser in die Petrischale mit den µEF. - Pflegen Sie Kulturen für den gewünschten Zeitraum durch den Ersatz von 50 % des Kulturmediums jeden zweiten bis dritten Tag der Kultur.
Hinweis: Nach den Experimenten können die Mikrofluidik von MEAs abgelöst werden durch Eintauchen der µEF im Wasser über Nacht. Wenn nötig, vorsichtig schälen der Mikrofluidik mit Hilfe der Zange. MEAs können durch Übernachtung Inkubation mit einem 1 % (V/V) kommerzielle enzymatischen Reinigungsmittel gereinigt werden (siehe Tabelle der Materialien).
5. Aufnahme spontan neuronaler Aktivität
Hinweis: Embryonale kortikale Neuronen Kulturen auf MEAs weisen in der Regel spontane Aktivität als 7 Tage in vitro (DIV), sondern nehmen Sie 2-3 Wochen (14-21 DIV) um zu Reifen und zeigen Aktivität stabil. Es liegt an der Experimentator zu entscheiden, wann die elektrophysiologischen Messungen auf der Grundlage der Ziele der Studie beginnen. In diesem Protokoll wird die Aufnahme von neuronaler Aktivität von µEF mithilfe eines kommerziellen Aufnahmen-Systems demonstriert (siehe Tabelle der Materialien für Hardware-Details), mit einem Heizmodul integriert. Für die Durchführung von Aufnahmen, verwendeten wir eine frei verfügbare Software (siehe Tabelle der Materialien für Softwaredetails).
- Schalten Sie die MEA recording System und der Temperaturregler und lassen Sie die beheizte Bodenplatte des Vorverstärkers um 37 ° c zu erreichen
Hinweis: für Langzeitaufzeichnungen (> 30 min zu einem Zeitpunkt) sollte man eine System, das eine CO2 Atmosphäre bewahrt. - Legen Sie die µEF auf der Vorverstärker (Headstage).
Hinweis: Sicherstellen Sie, dass der MEA-Chip korrekt mit der Referenznummer in der oberen linken Rand ausgerichtet ist. Die MEA-Chip, die, den wir verwenden, ist rotationssymmetrisch, aber diese Ausrichtung entspricht die korrekte Ausrichtung der das Pin-Layout der Elektroden und die Hardware-IDs. - Schließen und Verriegeln des Vorverstärker-Deckels.
- Um zu erfassen, öffnen Sie die Recording-Software und definieren Sie die Aufnahmeparameter und den Pfad der aufgezeichneten Datenströme (siehe Software-Handbuch für Details wie die Einrichtung einer Aufnahme-Schema).
Hinweis: Eine Akquisition mit einer Abtastrate von 20 kHz ist in der Regel genug für die meisten Anwendungen. Eine höhere Abtastfrequenz ist sinnvoll, wenn mehr Präzision Spike Timings erforderlich ist. Wenn man nur zu Rekord Spitzen will, setzen Sie einen Hochpass-Filter bei 300 Hz, die unteren Frequenzanteile des Signals abschwächen wird. Wenn rohe und gefilterten Daten gleichzeitig aufgezeichnet werden, erhöht dies erheblich die Größe der Daten-Datei. Es ist immer möglich, offline Filterung der Rohdaten zu tun. Um Daten reduzieren kann Dateigröße einer Mikroelektroden aus dem Datensatz (z. B. nur Mikroelektroden innerhalb Mikrospuren) einschränken. - Klicken Sie auf Start DAQ Datenerfassung starten. Überprüfen Sie, ob das Display laufende Spuren von Aktivität und Aufnahme starten zeigt.
Hinweis: Der Geräuschpegel ist in der Regel etwas höher in der Mikroelektroden, die Mikrospuren entspricht. Wenn der Geräuschpegel zu hoch ist (Spitze-Spitze-Amplitude > 50 µV) oder unsicher in mehreren Mikroelektroden, es könnte wegen Schmutz einen guten Pin-Pad-Kontakt zu behindern. Dieses Problem wird in der Regel durch sanft Reinigung der Kontaktflächen MEA und die Vorverstärker-Pins mit einem Wattestäbchen, befeuchtet mit 70 % Ethanol gelöst. - Öffnen Sie die aufgenommene Datei in der Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien), die Daten schnell zu erkunden.
(6) Datenanalyse
Hinweis: Die folgenden Schritte zeigen, wie zur Nutzung der µSpikeHunter-Software, eine rechnerische Tool entwickelt Aguiar Lab (frei verfügbar auf e-Mail-Anfrage an pauloaguiar@ineb.up.pt), um mit µEF aufgezeichneten Daten zu analysieren. Eine grafische Benutzeroberfläche (Abbildung 2) wird verwendet, um die Daten laden, verbreitende Spitze Wellen zu identifizieren, ihre Richtung zu bestimmen (Anterograde und retrograde) und Ausbreitung Geschwindigkeiten zu schätzen. µSpikeHunter ist kompatibel mit HDF5 Dateien erstellt von Aufnahmen unter Verwendung MEA2100-Familie-Systeme, die in Verbindung mit 60, 120 und 256-Elektrode MEAs verwendet werden können. Die Aufnahmen mit Hilfe des Multi-Channel-Experimentators leicht in HDF5 Dateien mit frei verfügbaren Software konvertiert werden können (siehe Tabelle der Materialien).
- Klicken Sie auf Durchsuchen , um die aufgenommene Datei wählen. Klicken Sie auf die Datei-Info-Taste um die Sampling-Rate, die Aufnahmedauer sowie eine Liste der erfassten Datenströme (z. B. Rohdaten, die gefilterten Daten) aufzulisten.
Hinweis: Für wahre Ausbreitung Geschwindigkeit Schätzungen empfiehlt es die raw-Daten-Stream für die Analyse wählen. - Wählen Sie Mikroelektroden (einzelne Zeile oder Spalte zugeordnet Mikrorille) für die Analyse und des Spike Erkennung Schwellenwerts (positive oder negative Phase) bei 6 x die Standardabweichung (SD) von der Signal-Rausch. Klicken Sie auf Read Data gelten die Ereignis-Detektor und die identifizierten Vermehrung-Sequenzen.
Hinweis: Wenn die Kriterien erfüllt sind, wird eine Liste der erkannten Ausbreitung Sequenzen das Analyse-Panel füllen. Der Benutzer kann dann anzeigen und interagieren mit verschiedenen Analysetools für die Vermehrung Sequenz, einschließlich Spannung Spuren, Inter Mikroelektrode Cross-Korrelationen, Single-Sequenz Ausbreitung Geschwindigkeiten, eine Glomeruli und ein audio-Wiedergabe-Tool. Obwohl die Vermehrung Geschwindigkeit Schätzung für jedes Paar von Mikroelektroden oder als Mittelwert der Schätzungen für alle Paare erreicht werden kann, ist diese Schätzung mehr zuverlässig, wenn das am weitesten entfernte paar ausgewählt ist. - Wiederholen Sie die vorherigen Schritt für die Mikroelektrode Sets von Interesse. Jedes Mal klicken Sie Speichern alle Ereignisse um die Zeit und die Amplitude der Spitzen (jeweils von der Mikroelektroden) sparen für alle identifizierten Ausbreitung Sequenzen in einer CSV-Datei.
- Importieren Sie die CSV-Dateien auf Datenumgebungen Analyse zur weiteren Analyse der Muster der Aktivität der Kultur (z. B. Feuerrate, Inter Spike-Intervallen).
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Representative Results
Mit dem beschriebenen Protokoll hier können e-18 Ratte kortikale Neuronen ausgesät auf µEF entwickeln und gesund in diesen Kulturbedingungen für mehr als einen Monat bleiben. Kortikale Neuronen wachsen, sobald 3 bis 5 Tage in Kultur, deren Axone durch Mikrospuren in Richtung der axonalen Fach des µEF (Abbildung 1). Nach 15 Tagen in Kultur kortikale Neuronen auf µEF kultiviert werden voraussichtlich stetig Maß an Aktivität aufweisen und Ausbreitung von Aktionspotentialen entlang der Mikrospuren wird erwartet. Ältere Kulturen (> 14 DIV) sind in der Regel platzen Aktivität wie in konventionellen MEA Aufnahmen18,19dominiert werden.
Aufnahmen und Datenanalyse
RAW-Daten-Analyse mit µSpikeHunter (Abbildung 2) erlaubt die Erkennung und Extraktion Spitze Wellen entlang Sätze von 4 Mikroelektroden (innerhalb Mikrospuren) zu propagieren. Abbildung 3 zeigt eines dieser Ereignisse. µSpikeHunter zur Abschätzung der Ausbreitung Geschwindigkeiten, basierend auf der Cross-Korrelationen zwischen der Spannung Wellenformen von ausgewählten Paare von Mikroelektroden (mit einer zeitlichen Verzögerung) und der damit verbundenen bekannten Inter Elektrodenabstand erlaubt.
Die extrahierten Daten wurde weiter mit benutzerdefinierten gestaltete Code in MATLAB analysiert. Ein repräsentative Raster Plot die Vermehrung spike Wellen entlang 11 (von 16) Mikrospuren ist in Abbildung 4adargestellt. Die momentane Feuerrate für eine hohe und eine niedrige Aktivität Mikrorille ist in Abbildung 4 bdargestellt.
µEF Aufnahmen zeigen unterschiedlicher Aktivität pro Mikroelektrode. Häufig sind mehrere Mikroelektroden im somal Abteil "silent". Jedoch neigen die meisten Mikroelektroden innerhalb Mikrospuren aktiv sein (Abb. 5a). Es ist gut beschrieben, dass die Mikrospuren als Signal-Verstärker8funktionieren. Die Amplitude eines aufgezeichneten Signals hängt nicht nur von der Größe der Quelle Ströme, sondern auch auf den Widerstand des umgebenden Mediums. Der Widerstand entlang einer Mikrorille ist besonders hoch, die erhöht der Amplitude der gemessenen Signale im Vergleich zu denen Mikroelektroden im somal Fach (Abb. 5 b).
Abbildung 1 . Embryonalen Ratte kortikale Neuronen auf µEF kultiviert. (a) Foto von µEF. Maßstab: 1 cm. (b) repräsentatives Bild der kortikalen Neuronen in der µEF für 5 Tage, zeigt mehrere Axone kreuzen die Mikrospuren und erreichen das axonale Fach (Pfeile) kultiviert. Maßstab: 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Screen Capture die µSpikeHunter Zentrale grafische Benutzeroberfläche. Der Benutzer kann mit µEF aufgezeichneten Daten zu laden, verbreitende Spitze Wellen zu identifizieren, ihre Richtung zu bestimmen (Anterograde und retrograde) und Ausbreitung Geschwindigkeiten zu schätzen. Eine Glomeruli Tool ermöglicht dem Benutzer, manuell die Ausbreitungsgeschwindigkeit, basierend auf einer Linie auf die Glomeruli gezeichnet zu schätzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Anterograde verbreitende Spike-Wave spürte durch 4 Mikroelektroden (E8-E11) innerhalb einer Mikrorille. Jede Spur entspricht einer Mikroelektrode raw-Aufzeichnung für 3 ms nach Analyse mit µSpikeHunter, die Kreuzkorrelation zwischen den entferntesten Mikroelektroden (E8 und E11) erlaubt die Berechnung der Ausbreitungsgeschwindigkeit von 0,52 m/s. Klicken Sie bitte hier eine größere Version dieser Figur sehen.
Abbildung 4 . Flut von Informationen durch die Mikrospuren. (a) Vertreter Raster Grundstück von 2 Minuten spontane Aktivität aufgezeichnet entlang 11 Mikrospuren. Jeder Punkt steht für eine verbreitende Spike Welle (Einheit) von 4 Mikroelektroden gespürt und durch die Analyse mit µSpikeHunter identifiziert. Ein hochwertiges und eine niedrige Aktivität Mikrorille werden in gelb und rot hervorgehoben. (b) Entwicklung der momentanen Feuerrate (wie Preis-Codierung) für die zwei markierten Mikrospuren entlang 10 Minuten. Nur verbreitende Einheiten galten für die Berechnung der Feuerrate. Hinweis die Aktivität Synchronisation, trotz der verschiedenen feuern Rate Ebenen. Die momentane Feuerrate wurde berechnet die Spike-Ereignisse mit einem "glockenförmig" Kernel mit einer Standardabweichung von 100 Ms. convolving Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Qualität der extrazellulären Aufnahmen in µEF. (a) Zeitfenster (1 Sekunde) einer µEF Aufnahme (Ratte kortikale Neuronen an 15 Tagen in Vitro) mit einer Abtastrate von 20 kHz und einen Hochpass-Filter bei 300 Hz. Elektrode Zeilen 1-7 somal Fach und Zeilen 8 bis 11, die Mikrospuren entsprechen. (b) Box und Whisker Plot des gesamten Spektrums der Spike Amplituden extrahiert (Spikes erkannt, mit einer Schwelle-Methode, mit negativen Phase nur auf 6 X Standardabweichung festgelegt) aus den angegebenen Zeilen (Gesamtaufnahmezeit von 10 Minuten). Die Spikes Amplituden sind deutlich größer in der Mikroelektroden innerhalb Mikrospuren (Zeilen 8-11; 16 Mikrospuren), im Vergleich zu den Mikroelektroden somal Fach (Zeilen 1-7; 16 aktive Mikroelektroden). Einfache ANOVA Dunn's mehrere Vergleichstests ***p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die hier vorgestellten Protokoll zeigt wie ein µEF, bestehend aus einem Mikrofluidik-Gerät und ein MEA mit handelsüblichen Standardausführungen, zusammenzubauen und die erfassten Daten analysieren.
Beim Entwerfen eines Experiments müssen Forscher berücksichtigen, dass die in-vitro- Modell durch die MEA festen Raster, begrenzt ist, die Mikrorille Regelungen beschränkt. Die Verwendung eines bestimmten mikrofluidischen oder MEA Design richtet sich nach den spezifischen Bedürfnissen der experimentellen, aber im Allgemeinen sollte die gleichen Verfahrensschritte gelten für verschiedene µEF Konfigurationen.
Eine kritische Entscheidung zu machen, bevor µEF Montage ist, ob der Benutzer die montierte µEF in Zukunft wiederverwenden will experimentiert. Behandlung mit Sauerstoffplasma auf beiden Oberflächen kann getan werden, um mikrofluidischen Geräten MEAs20kovalent binden. Allerdings macht diese Abdichtung oft die MEA-Chips unbrauchbar für weitere Experimente, da abnehmen das mikrofluidischen Gerät irreversibel die Passivierungsschicht schädigt. Um dieses Problem zu umgehen, tendenziell Forschungsgruppen die montierte µEF, trotz der möglichen Nachteile (z. B. Ablagerungen aus früheren Experimenten) wiederverwenden. Durch sorgfältig nach der Anleitung in diesem Protokoll vom Experiment zu experimentieren, kann man sicher anfügen und trennen von mikrofluidischen Geräten ohne Beschädigung der MEA.
Die Verwendung von µEF ermöglicht die Isolierung eines Satzes von Axonen innerhalb der Mikrospuren. Der Zeitaufwand für eine angemessene Anzahl von Axonen der Mikrospuren überqueren wird entscheidend davon abhängen der Zelle Aussaat Verfahren, nämlich ausgesät Zelldichte. Mit der Dichte, die in diesem Protokoll angegeben, Neuronen benutzen, um die ganze Mikrorille innerhalb von 3 bis 5 überqueren DIV.
Je nach Kultur Umgebung (d. h. Inkubator und Luftfeuchtigkeit) kann es erforderlich, Medien alle 2 bis 3 Tage der Kultur ersetzen. Wenn Medien zu erneuern, entfernen Sie das Medium aus µEF Brunnen unter Beibehaltung der Medien innerhalb der Hauptkanäle. Fügen Sie Medien dann sanft in die µEF Vertiefungen, so dass sie langsam durch die wichtigsten Kanäle fließen vor füllt sich der Brunnen mit final Media-Volumen. Im Anschluss an diese Empfehlungen sind wir in der Lage, diese Kulturen unter gesunden Bedingungen für mindestens einen Monat beibehalten.
Ein entscheidender Vorteil dieser Plattform ist die Fähigkeit zu isolieren, zu messen und axonale Signale verfolgen. Obwohl die µEF Aufnahme einfach ist, die große Datenmengen, die generiert werden können ist umständlich zu handhaben und erfordert gute Kenntnisse der Datenanalyse. Die hier verwendete Analysesoftware, µSpikeHunter21, ist eine erweiterte noch intuitives computational Tool, ermöglicht eine genaue Quantifizierung von mehreren Maßnahmen (z. B. verbreitende Veranstaltungen, Ausbreitungsgeschwindigkeit etc.) im Zusammenhang mit in ein paar Schritte. Datenanalyse ist, zwar nicht im Mittelpunkt dieses Protokolls ermöglicht die Angaben hier bereits die Gewinnung von aussagekräftigen Daten aus einer µEF Aufnahme. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die sichere Trennung der ein einziges Axon pro Mikrorille nicht praktikabel bleibt. So können sehr komplexe Spike Wellenformen (aufgrund mehrerer Axone durch die Mikrorille) entstehen und Spike Timings und Ausbreitungsrechnungen Geschwindigkeit beeinflussen. Diese Einschränkung kann mit sehr schmalen Mikrospuren (unter 5 µm)13 und/oder durch Spike sortieren Techniken21, abgeschwächt werden, die helfen verschiedene Signalquellen zu unterscheiden.
Obwohl in-vitro- Kulturen können nicht die volle in-Vivo -Komplexität rekapitulieren, ermöglicht die Kombination mit µEF gut kontrollierten Bottom-up-Ansätze. Wir hoffen, dass dieses Protokoll hilft sowohl Anfängern als auch tüchtig MEA-Benutzern etablieren neue und zuverlässige Modelle für elektrophysiologische Kommunikation in neuronale Schaltkreise zu studieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde finanziert von FEDER - Fundo Europeu de Desenvolvimento Regionalfonds durch COMPETE 2020 - Operacional Programm für Wettbewerbsfähigkeit und Internationalisierung (lt), Portugal 2020, und von den Portugiesen finanziert durch FCT - Fundação Para eine Ciência e eine Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior im Rahmen des Projekts PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (lt-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus wurde von FCT (PD/BD/135491/2018) unterstützt. Paulo Aguiar wurde von Programa Ciência - Programa Operacional Potencial Humano (POPH) - Förderung der wissenschaftlichen Beschäftigung, ESF und MCTES und Programm Investigador FCT, POPH und Fundo Social Europeu unterstützt. Die mikrofluidischen Geräte wurden bei INESC - Mikrosystem- und Nanotechnologie, Portugal, unter der Aufsicht von João Pedro Conde und Virginia Chu hergestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
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