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Bioengineering

Microelectrode सरणियों के साथ Microfluidics संचार और Axonal सिग्नल प्रोपेगेशन का अध्ययन करने के लिए सामना करना पड़

Published: December 8, 2018 doi: 10.3791/58878
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कैसे इन विट्रो में गठबंधन करने के लिए microfluidic उपकरणों के साथ microelectrode arrays में कार्रवाई की क्षमता संचरण का अध्ययन करने के लिए ंयूरॉन संस्कृतियों । डेटा विश्लेषण, अर्थात् प्रचार कार्रवाई क्षमता का पता लगाने और लक्षण वर्णन, एक नया उंनत, अभी तक उपयोगकर्ता के अनुकूल है और आसानी से उपलब्ध है, गणना उपकरण का उपयोग किया जाता है ।

Abstract

Microelectrode arrays (रहत) व्यापक रूप से इन विट्रो मेंंयूरॉंस समारोह का अध्ययन किया जाता है । इन उपकरणों की अनुमति समवर्ती गैर इनवेसिव रिकॉर्डिंग/electrophysiological गतिविधि की लंबी अवधि के लिए । हालांकि, न्यूरॉन सर्किट में संचार और संकेत प्रचार को समझने की कोशिश कर रहा है जब हर microelectrode के आसपास के सभी स्रोतों से संकेत संवेदन की संपत्ति प्रतिकूल हो सकता है । एक ंयूरॉंस नेटवर्क में, कई ंयूरॉंस एक साथ सक्रिय किया जा सकता है और अतिव्यापी कार्रवाई क्षमता उत्पंन कर सकते हैं, यह मुश्किल भेदभाव करने के लिए और संकेत के प्रसार को ट्रैक कर । इस सीमा को ध्यान में रखते, हम एक इन विट्रो सेटअप electrophysiological संचार, जो अलग और उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ axonal संकेतों बढ़ाना करने में सक्षम है का आकलन करने पर ध्यान केंद्रित की स्थापना की है । microfluidic उपकरणों और रहत का सामना करके, हम axons और microelectrodes के एक अच्छी तरह से नियंत्रित संरेखण के साथ ंयूरॉन संस्कृतियों compartmentalize करने में सक्षम हैं । इस सेटअप कई हफ्तों के पाठ्यक्रम पर एक उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात के साथ स्पाइक प्रचार की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है । विशेष डेटा विश्लेषण एल्गोरिदम के साथ संयुक्त, यह इस तरह के प्रसार वेग, आचरण विफलता, फायरिंग दर, anterograde spikes, और कोडिंग तंत्र के रूप में कई संचार संबंधित गुणों की विस्तृत ठहराव प्रदान करता है ।

इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कैसे सब्सट्रेट पर एक compartmentalized ंयूरॉन संस्कृति सेटअप बनाने के लिए एकीकृत रहत, इस सेटअप में कैसे संस्कृति ंयूरॉंस के लिए, और कैसे सफलतापूर्वक रिकॉर्ड करने के लिए, विश्लेषण और इस तरह के प्रयोगों से परिणामों की व्याख्या । यहां, हम बताते है कि कैसे स्थापित सेटअप ंयूरॉन संचार और axonal संकेत प्रचार की समझ सरल । इन प्लेटफार्मों इंजीनियर और नियंत्रणीय ंयूरॉंस नेटवर्क स्थलाकृति के साथ इन विट्रो मॉडल में नए के लिए मार्ग प्रशस्त । वे सजातीय न्यूरॉन संस्कृतियों के संदर्भ में इस्तेमाल किया जा सकता है, या सह संस्कृति विन्यास के साथ जहां, उदाहरण के लिए, संवेदी न्यूरॉन्स और अन्य सेल प्रकार के बीच संचार निगरानी और मूल्यांकन किया जाता है. इस सेटअप का अध्ययन करने के लिए बहुत ही रोचक शर्तें प्रदान करता है, उदाहरण के लिए, neurodevelopment, न्यूरॉन सर्किट, जानकारी कोडिंग, neurodegeneration और neuroregeneration दृष्टिकोण.

Introduction

न्यूरॉन सर्किट में विद्युत संचार को समझना सामान्य कार्य प्रकट करने के लिए एक बुनियादी कदम है, और शिथिलता पता करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों ईजाद करना. न्यूरॉन्स एकीकृत, गणना और रिले कार्रवाई क्षमता (एपीएस) जो उनके पतले axons साथ प्रचार. पारंपरिक electrophysiological तकनीक (जैसे, पैच दबाना) शक्तिशाली तकनीक के लिए ंयूरॉंस गतिविधि का अध्ययन कर रहे है लेकिन अक्सर ऐसे सोमा या dendrites के रूप में बड़ा सेलुलर संरचनाओं, तक ही सीमित हैं । इमेजिंग तकनीक उच्च स्थानिक संकल्प के साथ axonal संकेतों का अध्ययन करने के लिए एक विकल्प प्रदान करते हैं, लेकिन वे तकनीकी रूप से कठिन प्रदर्शन करते हैं और दीर्घकालिक माप1की अनुमति नहीं देते हैं । इस संदर्भ में, microelectrode arrays के संयोजन (रहत) और microfluidics ंयूरॉन ´ के मौलिक गुणों का खुलासा करने में एक शक्तिशाली योगदान कर सकते है गतिविधि और संकेत संचरण में न्यूरॉन नेटवर्क के भीतर इन विट्रो2 , 3.

मेे प्रौद्योगिकी न्यूरॉन संस्कृतियों की extracellular रिकॉर्डिंग पर निर्भर करता है । इस electrophysiological पद्धति का मुख्य लाभ कई साइटों पर लंबी अवधि, एक साथ उत्तेजना और रिकॉर्डिंग का समर्थन करने की क्षमता है और एक गैर इनवेसिव रास्ता3में । रहत एक गिलास वेफर सब्सट्रेट में एम्बेडेड, उच्च प्रवाहकीय और संक्षारण प्रतिरोधी microelectrodes के बने होते हैं । वे पारंपरिक कोशिका संस्कृति जैव कोटिंग्स के साथ संगत कर रहे हैं, जो सेल आसंजन को बढ़ावा देने के द्वारा काफी सब्सट्रेट और कोशिकाओं3,4के बीच सीलिंग प्रतिरोध वृद्धि हुई है । इसके अलावा, वे डिजाइन में बहुमुखी है और microelectrodes आकार, ज्यामिति और घनत्व में भिंन हो सकते हैं । कुल मिलाकर, समवर्ती जी इमेजिंग और electrophysiological रिकॉर्डिंग की अनुमति के लाभ के साथ पारंपरिक सेल संस्कृति जहाजों के रूप में काम रहत/

मेे प्रौद्योगिकी के उपयोग तंत्रिका नेटवर्क के महत्वपूर्ण सुविधाओं के अध्ययन के लिए योगदान दिया है5। हालांकि, वहां अंतर्निहित विशेषताएं है कि संचार और ए पी ए के प्रसार में अध्ययन के लिए रहत के प्रदर्शन की सीमा एक न्यूरॉन सर्किट । एकल कोशिकाओं से रहत सक्षम रिकॉर्डिंग और यहां तक कि axons की तरह उपसेलुलर संरचनाओं, लेकिन जब स्मल संकेतों की तुलना में, axonal संकेतों एक बहुत कम संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR)6है. इसके अलावा, हर microelectrode के आसपास सभी स्रोतों से extracellular क्षेत्र क्षमता संवेदन की विशेषता एक न्यूरॉन सर्किट में संकेत प्रसार की ट्रैकिंग में बाधा.

हाल के अध्ययनों का प्रदर्शन किया है, तथापि, कि बेहतर रिकॉर्डिंग शर्तों संकीर्ण microchannels में जो axons विकसित कर सकते है के भीतर गठबंधन microelectrodes होने से प्राप्त किया जा सकता है । इस विंयास SNR में एक उल्लेखनीय वृद्धि प्रदान करता है कि इस तरह के प्रचार axonal संकेतों को आसानी से पता लगाया जा सकता है7,8,9,10,11,12, 13. मेे प्रौद्योगिकी के साथ सहयोगी microfluidic उपकरणों की रणनीति एक विद्युत पृथक microenvironment axonal संकेतों11बढ़ाना उपयुक्त बनाता है । इसके अलावा, एक microgroove साथ कई संवेदन microelectrodes की उपस्थिति का पता लगाने और axonal संकेत प्रचार के लक्षण वर्णन के लिए मौलिक है ।

इन विट्रो प्लेटफार्मों में अत्यधिक नियंत्रणीय न्यूरॉन नेटवर्क स्थलाकृति के साथ कई शोध प्रश्न14के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इन प्लेटफार्मों ंयूरॉंस संस्कृतियों के संदर्भ में इस्तेमाल किया जा उपयुक्त हैं, लेकिन इंजीनियर सह संस्कृति विंयास, जहां ंयूरॉंस और अंय प्रकार के सेल के बीच संचार पर नजर रखी जा सकता है और मूल्यांकन करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है । इस प्रकार इस तरह के neurodevelopment, न्यूरॉन सर्किट, जानकारी कोडिंग, neurodegeneration और neuroregeneration के रूप में तंत्रिका से संबंधित अध्ययनों की एक संख्या का पता लगाने के लिए बहुत ही दिलचस्प शर्तों प्रदान करता है. इसके अलावा, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल15,16 के उभरते मॉडलों के साथ अपने संयोजन मानव रोगों है कि तंत्रिका तंत्र को प्रभावित करने के लिए संभावित उपचारों के विकास में नए रास्ते खोल सकते हैं ।

हमारी प्रयोगशाला microfluidics (µ ef) के साथ microelectrodes के संयोजन इस मंच का उपयोग कर रहा है सेलुलर और नेटवर्क के स्तर पर और फिजियो में उनके निहितार्थ-और रोग तंत्रिका तंत्र में ंयूरॉन प्रक्रियाओं को समझते हैं । तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में इस तरह के मंच के मूल्य को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कैसे सब्सट्रेट पर एक compartmentalized ंयूरॉन संस्कृति बनाने के लिए एकीकृत रहत, इस मंच में कैसे संस्कृति ंयूरॉंस के लिए और कैसे सफलतापूर्वक रिकॉर्ड करने के लिए प्रदर्शित करने के लिए है, ऐसे प्रयोगों से परिणामों का विश्लेषण और व्याख्या करें. इस प्रोटोकॉल निश्चित रूप से तंत्रिका संचार के अध्ययन में ंयूरॉंस संस्कृतियों के लिए प्रयोगात्मक toolbox समृद्ध होगा ।

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Protocol

सभी जानवरों को शामिल प्रक्रियाओं यूरोपीय संघ (ईयू) के निर्देश 2010 के अनुसार प्रदर्शन किया गया/63/यूरोपीय संघ ( Decreto-Lei 113/2013 द्वारा पुर्तगाली कानून के लिए स्थानांतरित) । प्रायोगिक प्रोटोकॉल (0421/000/000/2017) को पशु कल्याण और प्रयोग पर पुर्तगाली सरकारी प्राधिकार (Direção-Geral de Alimentação e Veterinária-DGAV) और मेजबान संस्था के दोनों की एथिक्स समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था.

1. संस्कृति मीडिया और अंय समाधान की तैयारी

नोट: नए सिरे से इसके उपयोग के दिन पर कोटिंग समाधान तैयार करते हैं । अप्रयुक्त कोटिंग समाधान और संस्कृति मीडिया पर संग्रहित किया जा सकता है-20 डिग्री सेल्सियस या 4 डिग्री सेल्सियस के रूप में नीचे विस्तृत ।

  1. एक ०.०५% (v/v) पाली (ईथीलीन िमीन) (पी) काम समाधान के 10 मिलीलीटर तैयार करें ।
    1. ०.२५% (डब्ल्यू/वी) के 20 मिलीलीटर तैयार शुद्ध पी भंग करके पी स्टॉक समाधान (देखें सामग्री की तालिका) बाँझ पानी में ।
    2. ०.२५% (डब्ल्यू/वी) के 2 मिलीलीटर पतला आसुत जल के 8 मिलीलीटर में पी स्टॉक समाधान । अच्छी तरह से मिश्रण और उपयोग करें । अप्रयुक्त समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. एक 5 µ जी/एमएल laminin समाधान की 1 मिलीलीटर तैयार करें ।
    1. पतला 5 µ एल के 1 मिलीग्राम/एमएल laminin स्टॉक समाधान में ९९५ µ एल बेसल मध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) । अच्छी तरह से मिश्रण और उपयोग करें । अप्रयुक्त समाधान 1-2 सप्ताह तक के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है ।
  3. HEPES के 1 एल तैयार-बफर है हांक संतुलित नमक समाधान (एच HBSS) ।
    1. ultrapure पानी के ५० मिलीलीटर में HEPES चूर्ण के ११.९ ग्राम को भंग करके 1 मीटर HEPES घोल तैयार करें । ७.२ के लिए पीएच समायोजित करें ।
    2. एच-HBSS सॉल्यूशन (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) को भंग करके ५.३३ एमएम पोटेशियम क्लोराइड, ०.४४ एमएम पोटेशियम फॉस्फेट monobasic, १३८ एमएम सोडियम क्लोराइड, ०.३ एमएम सोडियम फास्फेट dibasic और ५.६ एमएम ग्लूकोज की ८०० मिलीलीटर ultrapure पानी में घोल कर तैयार करें ।
    3. 1 मीटर HEPES समाधान (15 मिमी की अंतिम एकाग्रता) के 15 मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. 1 एन एचसीएल या 1 एन NaOH का उपयोग कर वांछित पीएच ७.४ नीचे 0.2-0.3 इकाइयों के लिए पीएच समायोजित करें । अंतिम समाधान मात्रा बनाने के लिए ultrapure पानी जोड़ें ।
      नोट निस्पंदन के दौरान वृद्धि करने के लिए पीएच जाता है ।
    5. एक ०.२२ µm porosity पाली (ईथर sulfone) (पी इ एस) झिल्ली का उपयोग निस्पंदन द्वारा निष्फल ।
  4. 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (hiFBS) युक्त एच-HBSS के 10 मिलीलीटर तैयार करें ।
    1. एच-HBSS के 9 मिलीलीटर में hiFBS की 1 मिलीलीटर पतला । अच्छी तरह से मिश्रण और उपयोग करें । अप्रयुक्त समाधान 3-4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  5. १.५ मिलीग्राम/एमएल trypsin समाधान की 5 मिलीलीटर तैयार करें ।
    1. तुरंत उपयोग करने से पहले, भंग ७.५ एच के 5 मिलीलीटर में trypsin के मिलीग्राम-HBSS । निस्पंदन द्वारा एक ०.२२ µm porosity पी इ एस झिल्ली का उपयोग करके निष्फल ।
  6. अनुपूरक मध्यम के ५० मिलीलीटर तैयार करें ।
    1. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में, बेसल मध्यम के ४८.५ मिलीलीटर मिश्रण ( सामग्री की तालिकादेखें), 2% (वी/वी) बी-27 पूरक, ०.५ मिमी L-glutamine और 1% कलम/Strep (१०,००० यू/एमएल पेनिसिलिन और १०,००० µ g/एमएल streptomycin) । अनुपूरक मध्यम 3-4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।

2. Microfluidic और मेे उपकरणों की तैयारी

नोट: कक्ष सीडिंग से पहले दिन पर चरण 2.1-2.11 निष्पादित करें ।

  1. स्वच्छ microfluidic उपकरणों निर्माण और अन्य मलबे vinyl टेप का उपयोग कर हटाने के लिए । धीरे डिवाइस के सभी क्षेत्रों तक पहुँचने के लिए डिवाइस के खिलाफ टेप दबाएँ.
  2. एयर प्लाज्मा-मेे साफ करने के लिए 3 मिनट (०.३ mbar) की सतह को साफ करने और इसे और अधिक हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए ।
  3. संक्षेप में ७०% इथेनॉल में microfluidic उपकरणों डूब और उंहें एक लामिना प्रवाह हुड के अंदर हवा शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  4. एक बाँझ ९० mm पेट्री डिश में प्रत्येक मेे प्लेस और पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश जोखिम के 15 मिनट से उन्हें निष्फल ।
  5. कोट मेे केंद्रीय भूतल क्षेत्र ०.०५% की ५०० µ एल के साथ मशीन द्वारा (वी/वी) पी समाधान के लिए कम से 1 ज ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
    नोट: के रूप में17दूसरों के द्वारा वर्णित है, पी कोटिंग कम पाली (lysine) कोटिंग का उपयोग करने से क्लस्टरिंग में रहत परिणामों के ।
  6. महाप्राण सतह से बेई कोटिंग समाधान और धो रहत 4x के साथ बाँझ आसुत पानी की 1 मिलीलीटर । यह इलेक्ट्रोड को नुकसान पहुंचा सकता है के रूप में धुलाई चरणों के दौरान विदेश मंत्रालय सतह को छूने के लिए सावधान रहें ।
  7. एक लामिना प्रवाह हुड के अंदर एक stereomicroscope द्वारा निर्देशित, विदेश मंत्रालय चिप केंद्र और विदेश मंत्रालय के केंद्रीय क्षेत्र के लिए बाँझ पानी की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  8. microfluidic उपकरण मेे सतह के ऊपर रखें ।
  9. सावधानीपूर्वक microfluidic डिवाइस के microgrooves को microelectrode ग्रिड मेे संरेखित करें ।
  10. सही ढंग से संरेखित होने पर, सावधानीपूर्वक मेे या microfluidic डिवाइस को छूने के बिना अतिरिक्त पानी महाप्राण ।
  11. सूखी और पूरी तरह से लगाव की अनुमति देने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात µ efs मशीन । आसक्ति को सुगम बनाने के लिए, microfluidic उपकरण को धीरे से प्रेस करना ।
    नोट: सेल सीडिंग के दिन २.१२ कदम निष्पादित करें ।
  12. एक बार µ efs पूरी तरह से सूख गया है, १५० µ एल के साथ microfluidic वेल्स लोड 5 µ g/एमएल laminin कोटिंग समाधान और मशीन ३७ डिग्री सेल्सियस से कम 2 के लिए सेल बोने से पहले ज ।
    नोट: laminin समाधान के साथ µ ef लोड करते समय, सुनिश्चित करें कि समाधान microgrooves भरता है । microgrooves के भीतर मौजूद हो सकता है कि किसी भी हवा बुलबुला हटाने के लिए एक निर्वात का उपयोग करें.

3. आकडे प्रांतस्था विच्छेदन

  1. भ्रूण हटाने के लिए विच्छेदन क्षेत्र तैयार करें ।
    1. कार्य सतह और ७०% इथेनॉल के साथ शल्य चिकित्सा उपकरणों को संक्रमित ।
      नोट: हालांकि इस विच्छेदन एक बाँझ प्रक्रिया नहीं है, संक्रमण के अवसरों को कम करने में मदद करता है ।
    2. विच्छेदन क्षेत्र सीमित और भ्रूण हटाने के लिए शल्य चिकित्सा उपकरणों का पालन करने के लिए एक साफ डिस्पोजेबल डायपर का प्रयोग करें ।
    3. शीत एच HBSS से भरे ४ ९० mm पेट्री व्यंजन तैयार करें और उन्हें विच्छेदन क्षेत्र के पास बर्फ के साथ एक ट्रे पर रखें ।
  2. Euthanize एक E-18 समय गर्भवती Wistar चूहा कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) सांस लेना द्वारा ।
  3. प्रक्रिया के पूरा होने पर, सीओ2 चैंबर से पशु निकालें और इच्छामृत्यु की एक माध्यमिक विधि द्वारा मौत की पुष्टि, exsanguination जैसे ।
  4. डिस्पोजेबल डायपर पर पशु ventral पक्ष प्लेस, ७०% इथेनॉल के साथ पेट के निचले स्प्रे और, संदंश और कैंची की मदद से, एक U-आकार त्वचा के माध्यम से कटौती करने के लिए गर्भाशय का पर्दाफाश ।
  5. ध्यान से दूर किसी भी संयोजी ऊतक काटने से गर्भाशय से भ्रूण को दूर करने और उन्हें ठंड एच HBSS के साथ पेट्री डिश में से एक जगह है ।
  6. अपनी भ्रूण थैली से प्रत्येक भ्रूण निकालें और, संदंश और कैंची की मदद से, भ्रूण decapitate ।
  7. कोल्ड एच HBSS से भरे एक दूसरे पेट्री डिश को भ्रूण ´ र्ट्स हेड ट्रांसफर करें ।
  8. दोहराएं चरण ३.६-प्रत्येक भ्रूण के लिए ३.७ ।
  9. काटना आकडे प्रांतस्था.
    1. एक तिहाई पेट्री डिश के लिए एक भ्रूण ´ एस सिर हस्तांतरण ।
    2. मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें ।
    3. इसकी गुहार से मस्तिष्क निकालें और इसे कोल्ड एच-HBSS से ढक दें ।
    4. यदि वर्तमान, निकालें और घ्राण बल्ब को त्यागें । काटना को आकडे प्रांतस्था और निकाल मेनिन्जेस.
    5. शीत एच-HBSS से भरे चौथी पेट्री डिश में आकडे प्रांतस्था अंशों को स्थानांतरित करें ।
    6. प्रत्येक भ्रूण के लिए कदम 3.9.1-3.9.5 दोहराएं ।

4. Cortical न्यूरॉन्स पृथक्करण और कल्चर पर µ ef

नोट: निंनलिखित प्रक्रियाओं यूवी नसबंदी के एक 15 मिनट के चक्र के बाद एक लामिना प्रवाह हुड के अंदर प्रदर्शन किया गया । कार्य सतह क्षेत्र के रूप में अच्छी तरह के रूप में सभी डाकू के अंदर रखा सामग्री पहले ७०% इथेनॉल से संक्रमित किया जाना चाहिए ।

  1. चरण १.५ में वर्णित के रूप में, पहले भारित trypsin के 5 मिलीलीटर में भंग H-HBSS और फ़िल्टर समाधान ।
  2. प्रांतस्था के टुकड़ों को पहले ही एच-HBSS के 5 एमएल के कुल में विच्छेदित कर लीजिए । उंहें एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
  3. नए सिरे से तैयार की २.३ मिलीलीटर जोड़ें १.५ मिलीग्राम/एमएल trypsin प्रांतस्था टुकड़े युक्त ट्यूब के लिए समाधान ।
  4. मिश्रण निलंबन और 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन (संक्षेप में हर 5 मिनट आंदोलन) ।
  5. बंद करो ऊतक पाचन और trypsin बाहर धोने ।
    1. trypsin युक्त supernatant को त्यागें । शेष trypsin को निष्क्रिय करने के लिए 10% hiFBS युक्त एच-HBSS के 5 मिलीलीटर जोड़ें; लिएर आन्दोलन गर्ने ।
    2. प्रांतस्था अंशों को व्यवस्थित करने दें और फिर supernatant को छोड़ें ।
    3. hiFBS अवशेषों को हटाने के लिए एच-HBSS के 5 मिलीलीटर जोड़ें । चलो प्रांतस्था टुकड़े बसने और supernatant त्यागें ।
    4. फिर से धो प्रांतस्था के टुकड़े के साथ 5 मिलीलीटर एच-HBSS ।
    5. चलो प्रांतस्था टुकड़े बसने और supernatant त्यागें । पूरक ंयूरॉन मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
  6. प्रांतस्था अंशों को यांत्रिक रूप से अलग कर देना करके 5 मिलीलीटर serologic पिपेट के साथ धीरे से ऊपर और नीचे 10-15 बार तक pipetting । यदि आवश्यक हो, एक छोटे कैलिबर पिपेट का उपयोग कर प्रक्रिया दोहराने जब तक सेल निलंबन समरूप हो ।
  7. कोशिका निलंबन गर्त एक ४० µm सेल छलनी फ़िल्टर द्वारा शेष undissociated ऊतकों को त्यागें ।
  8. व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती और सेल घनत्व निर्धारित करते हैं ।
    1. एक microtube में, ०.४% के 20 µ l को जोड़ें (w/v) Trypan ब्लू को 20 µ l सेल सस्पेंशन. घोल को homogenate और 10 µ l को एक Neubauer मतगणना कक्ष में ट्रांसफर करने के लिए अच्छी तरह मिलाएं ।
    2. व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती और व्यवहार्य कोशिकाओं के सेल घनत्व का निर्धारण ।
  9. ३.६ x 107 कोशिकाओं/एमएल के लिए सेल घनत्व को समायोजित करें (यदि आवश्यक हो, सेल निलंबन केंद्रापसारक) ।
  10. सेल सीडिंग के तुरंत पहले, µ ef के सभी कुओं से laminin कोटिंग निकालें । पिपेट ५० µ ef axonal डिब्बे के प्रत्येक कुआं के लिए पूरक माध्यम के µ एल ।
  11. µ ef स्मल डिब्बे में सेल सस्पेंशन के सीड 5 µ एल. 1 एच के लिए ३७ ° c में मशीन, सब्सट्रेट करने के लिए कोशिकाओं लगाव की अनुमति देने के लिए ।
  12. धीरे µ ef के प्रत्येक अच्छी तरह से गर्म पूरक मध्यम के साथ भरें । µ ef एक humidifier मशीन के लिए ३७ ° c 5% CO2के साथ आपूर्ति पर स्थानांतरण ।
    नोट: त्वरित संस्कृति के माध्यम वाष्पीकरण से बचने के लिए, µ ef ले पेट्री डिश के अंदर पानी से भरा एक खोला microtube जगह है ।
  13. संस्कृति के तीसरे दिन के लिए हर दूसरे कल्चरल मीडियम के ५०% की जगह द्वारा आवश्यक अवधि के लिए संस्कृतियों को बनाए रखें ।
    नोट: प्रयोगों के बाद µ ef को रात भर पानी में डुबोकर microfluidics से रहत से अलग किया जा सकता है । अगर जरूरत हो तो धीरे से microfluidics को संदंश की मदद से छील लें । रहत एक 1% (वी/वी) वाणिज्यिक एंजाइमी डिटर्जेंट ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ रातोंरात मशीन द्वारा साफ किया जा सकता है ।

5. रिकॉर्डिंग सहज ंयूरॉंस गतिविधि

नोट: भ्रूण cortical ंयूरॉन संस्कृतियों पर विशेष रूप से प्रदर्शन सहज गतिविधि के रूप में 7 दिनों के रूप में इन विट्रो (DIV), लेकिन ले 2-3 सप्ताह (14-21 DIV) परिपक्व और प्रदर्शन स्थिर गतिविधि के लिए । यह प्रयोगकर्ता को तय करना है कि अध्ययन के उद्देश्यों के आधार पर electrophysiological माप कब शुरू करना है. इस प्रोटोकॉल में, µ ef से न्यूरॉन गतिविधि की रिकॉर्डिंग एक हीटिंग मॉड्यूल शामिल के साथ एक वाणिज्यिक रिकॉर्डिंग प्रणाली (हार्डवेयर विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके प्रदर्शन किया है । रिकॉर्डिंग प्रदर्शन के लिए, हम एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया (सॉफ्टवेयर विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) ।

  1. विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग प्रणाली और तापमान नियंत्रक पर बारी और ३७ डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के लिए एम्पलीफायर के गर्म आधार प्लेट की अनुमति दें ।
    नोट: लंबी अवधि के लिए रिकॉर्डिंग (एक समय में > 30 मिनट) एक भी एक प्रणाली है कि एक सह2 वातावरण का कहना है चाहिए ।
  2. µ ef को प्रवर्धक (headstage) पर रखें ।
    नोट: यह सुनिश्चित करें कि मेे चिप सही रूप से ऊपरी बाएँ किनारे में संदर्भ संख्या के साथ संरेखित है । विदेश मंत्रालय चिप हम रोटेशन सममित है, लेकिन इस संरेखण इलेक्ट्रोड और हार्डवेयर आईडी के पिन लेआउट का सही अभिविन्यास से मेल खाता है ।
  3. बंद करें और परिवर्धक ढक्कन कुंडी लगाएं ।
  4. रिकॉर्ड करने के लिए, रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर खोलने के लिए और रिकॉर्डिंग मापदंडों और रिकॉर्ड डेटा धाराओं के पथ को परिभाषित (कैसे एक रिकॉर्डिंग योजना सेट अप करने के लिए पर विवरण के लिए सॉफ्टवेयर मैनुअल देखें).
    नोट: 20 kHz के एक नमूना दर के साथ एक अधिग्रहण आम तौर पर अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त है. अधिक सटीक कील समय में आवश्यक है, तो एक उच्च नमूना आवृत्ति सलाह दी जाती है । एक केवल spikes रिकॉर्ड करने के लिए करना चाहता है, तो संकेत के निचले आवृत्ति घटकों को क्षीणन होगा जो ३०० हर्ट्ज पर एक उच्च-पास फिल्टर सेट. अपुष्ट और फ़िल्टर किए गए डेटा एक साथ रिकॉर्ड किए जाते हैं, तो यह उल्लेखनीयतया डेटा फ़ाइल आकार में वृद्धि होगी । यह हमेशा के लिए कच्चे डेटा की ऑफ़लाइन फ़िल्टरिंग करना संभव है । डेटा फ़ाइल आकार को कम करने के लिए एक भी microelectrodes से जो रिकॉर्ड करने के लिए सीमित कर सकते है (जैसे, केवल microelectrodes के भीतर microgrooves) ।
  5. क्लिक करें, प्रारंभ DAQ डेटा प्राप्ति के लिए । यदि प्रदर्शन गतिविधि के निशान चल रहा है और रिकॉर्डिंग शुरू दिखाता है की जांच करें ।
    नोट: शोर स्तर आमतौर पर microgrooves के लिए इसी microelectrodes में थोड़ा अधिक है । यदि शोर स्तर बहुत अधिक है (पीक से पीक आयाम > 50 µV) या कई microelectrodes में अस्थिर, यह एक अच्छा पिन-पैड संपर्क में बाधा गंदगी के कारण हो सकता है । इस समस्या को आमतौर पर धीरे मेे संपर्क पैड और एम्पलीफायर एक कपास झाड़ू ७०% इथेनॉल के साथ गीला का उपयोग कर पिन सफाई से हल है ।
  6. विश्लेषण सॉफ्टवेयर में दर्ज की गई फ़ाइल को खोलने ( सामग्री की तालिकादेखें) जल्दी से डेटा का पता लगाने के लिए ।

6. डेटा विश्लेषण

नोट: निम्न चरण µ spikehunter सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने के लिए कैसे दिखाएँ, अगुइयार की प्रयोगशाला में विकसित एक गणना उपकरण (pauloaguiar@ineb.up.pt के लिए ई-मेल अनुरोध पर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध), µ ef के साथ रिकॉर्ड किए गए डेटा का विश्लेषण करने के लिए । एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (चित्रा 2) डेटा लोड करने के लिए उपयोग किया जाता है, प्रचार स्पाइक तरंगों की पहचान, उनकी दिशा निर्धारित (anterograde या प्रतिगामी) और अनुमान प्रचार वेग. µ spikehunter HDF5-, १२०-, और २५६-इलेक्ट्रोड रहत के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो MEA2100-परिवार प्रणालियों, का उपयोग कर प्राप्त रिकॉर्डिंग से उत्पंन की फ़ाइलों के साथ संगत है । मल्टी चैनल प्रयोगकर्ता का उपयोग कर प्राप्त रिकॉर्डिंग आसानी से मुक्त रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर HDF5 फ़ाइलों में परिवर्तित किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें).

  1. रिकॉर्डिंग फ़ाइल का चयन करने के लिए ब्राउज़ क्लिक करें । फिर, नमूना दर, रिकॉर्डिंग अवधि के साथ ही रिकॉर्ड की गई डेटा स्ट्रीम (जैसे, raw डेटा, फ़िल्टर किए गए डेटा) की सूची की सूची के लिए फ़ाइल जानकारी बटन क्लिक करें ।
    नोट: सच प्रचार वेग अनुमान के लिए, यह विश्लेषण के लिए कच्चे डेटा स्ट्रीम का चयन करने के लिए सिफारिश की है.
  2. विश्लेषण के लिए microelectrodes (एकल पंक्ति या स्तंभ microgroove के साथ संबद्ध) का चयन करें और संकेत शोर के मानक विचलन (SD) 6x पर स्पाइक डिटेक्शन थ्रेशोल्ड मान (धनात्मक या ऋणात्मक चरण) सेट है । इवेंट डिटेक्टर को लागू करने और पहचाने गए प्रोपेगेशन अनुक्रम प्राप्त करने के लिए डेटा पढ़ें क्लिक करें ।
    नोट: यदि मापदंड मिले हैं, तो पता लगाया प्रोपेगेशन अनुक्रम की एक सूची विश्लेषण कक्ष पॉप्युलेट करेगा । उपयोगकर्ता तब देख सकते हैं और प्रोपेगेशन अनुक्रम, वोल्टेज ट्रैस, अंतर-microelectrode क्रॉस-सहसंबंध, एकल-अनुक्रम प्रोपेगेशन वेग, एक kymograph, और एक ऑडियो प्लेबैक उपकरण सहित के लिए कई विश्लेषण उपकरणों के साथ सहभागिता । हालांकि प्रचार वेग अनुमान microelectrodes के किसी भी जोड़ी के लिए या सभी जोड़ों के लिए अनुमानों के औसत के रूप में प्राप्त किया जा सकता है, इस आकलन अधिक से अधिक अगर दूर जोड़ी चयनित है विश्वसनीय है ।
  3. ब्याज के microelectrode सेट्स के लिए पिछला चरण दोहराएं । प्रत्येक समय एक CSV फ़ाइल के लिए सभी पहचान प्रोपेगेशन अनुक्रम के लिए spikes के समय और आयाम (प्रत्येक microelectrodes पर) को सहेजने के लिए सभी ईवेंट्स सहेजें क्लिक करें ।
  4. संस्कृति की गतिविधि के प्रतिमानों के आगे विश्लेषण के लिए CSV फ़ाइलों को डेटा विश्लेषण परिवेशों में आयात करें (उदा., फायरिंग दर, अंतर-स्पाइक अंतराल) ।

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Representative Results

यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, ई-18 चूहे cortical न्यूरॉन्स µ ef पर वरीयता प्राप्त विकसित करने के लिए और एक महीने से अधिक के लिए इन संस्कृति की स्थिति में स्वस्थ रहने में सक्षम हैं । जैसे ही 3 से 5 दिन संस्कृति में, cortical न्यूरॉन्स µ ef (चित्रा 1) के axonal डिब्बे की ओर microgrooves के माध्यम से अपने axons बढ़ने. संस्कृति में 15 दिनों के बाद, cortical न्यूरॉन्स µ ef पर संस्कृति की गतिविधि और microgrooves के साथ कार्रवाई क्षमता के प्रचार के स्थिर स्तर प्रदर्शन की उंमीद है उंमीद कर रहे हैं । पुराने संस्कृतियों (> 14 DIV) के लिए पारंपरिक मेे रिकॉर्डिंग18,19के रूप में गतिविधि के फटने से हावी हो जाते हैं ।

रिकॉर्डिंग और डेटा विश्लेषण

µ spikehunter (चित्रा 2) के साथ रॉ डेटा विश्लेषण का पता लगाने और 4 microelectrodes (microgrooves के भीतर) के सेट के साथ स्पाइक तरंगों के प्रचार के निष्कर्षण की अनुमति दी । चित्रा 3 इन घटनाओं में से एक को प्रदर्शित करता है । µ spikehunter प्रचार वेग के आकलन के लिए अनुमति दी, microelectrodes के चयनित जोड़े के वोल्टेज waveforms के बीच पार सहसंबंधों के आधार पर (एक समय देरी प्रदान) और संबद्ध ज्ञात इंटर इलेक्ट्रोड दूरी.

निकाले गए डेटा आगे MATLAB में कस्टम डिजाइन कोड का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । 11 के साथ प्रचार स्पाइक तरंगों का एक प्रतिनिधि रैस्टर भूखंड (16 में से) microgrooves चित्रा 4aमें दिखाया गया है । एक उच्च और एक कम गतिविधि microgroove के लिए तात्कालिक गोलीबारी दर चित्रा 4bमें दिखाया गया है ।

µ ef रिकॉर्डिंग प्रति microelectrode गतिविधि का स्तर अलग दर्शाती है । अक्सर, स्मल डिब्बे में कई microelectrodes "मूक" हैं । हालांकि, microgrooves के भीतर सबसे microelectrodes (आंकड़ा 5 ए) सक्रिय हो जाते हैं । यह अच्छी तरह से वर्णित है कि संकेत एम्पलीफायरों के रूप में microgrooves समारोह8. एक दर्ज संकेत के आयाम न केवल स्रोत धाराओं के आकार पर निर्भर करता है, लेकिन यह भी आसपास के मीडिया के प्रतिरोधकता पर. एक microgroove साथ प्रतिरोध विशेष रूप से उच्च है, जो बहुत स्मल डिब्बे (चित्रा 5b) में microelectrodes की तुलना में मापा संकेतों के आयाम बढ़ जाती है ।

Figure 1
चित्रा 1 . भ्रूण चूहा cortical न्यूरॉन्स µ ef पर कल्चरित । (क) µ ef की तस्वीर । स्केल बार: 1 सेमी. (ख) cortical ंयूरॉंस की प्रतिनिधि छवि µ ef में 5 दिनों के लिए, microgrooves को पार कर कई axons दिखा रहा है और axonal डिब्बे (तीर) तक पहुंचने । स्केल बार: १०० µm । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 . µ spikehunter मुख्य ग्राफिकल यूजर इंटरफेस का स्क्रीन कैप्चर । उपयोगकर्ता µ ef के साथ दर्ज डेटा लोड कर सकते हैं, प्रचार स्पाइक तरंगों की पहचान, उनकी दिशा निर्धारित (anterograde या प्रतिगामी) और अनुमान प्रचार वेग । एक kymograph उपकरण उपयोगकर्ता मैन्युअल रूप से एक kymograph पर तैयार की रेखा के आधार पर प्रसार वेग का अनुमान लगाने के लिए अनुमति देता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 3
चित्रा 3 . Anterograde प्रचार स्पाइक वेव एक microgroove के भीतर 4 microelectrodes (E8-E11) द्वारा महसूस किया । प्रत्येक ट्रेस के लिए एक microelectrode रॉ रिकॉर्डिंग का प्रतिनिधित्व करता है 3 ms. µ spikehunter के साथ विश्लेषण के बाद, पार से दूर microelectrodes (E8 और E11) के बीच सहसंबंध ०.५२ मी का प्रसार वेग की गणना की अनुमति दी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखें । 

Figure 4
चित्र 4 . microgrooves के माध्यम से सूचना बैराज । (क) एक प्रतिनिधि रैस्टर साजिश के 2 मिनट सहज गतिविधि के साथ दर्ज 11 microgrooves. प्रत्येक डॉट एक प्रचार स्पाइक तरंग (इकाई) 4 microelectrodes द्वारा महसूस किया और µ spikehunter के साथ विश्लेषण के माध्यम से की पहचान का प्रतिनिधित्व करता है । एक उच्च और एक कम गतिविधि microgroove क्रमशः पीले और लाल, में प्रकाश डाला जाता है । (ख) तात्कालिक गोलीबारी दर का विकास (के रूप में दर कोडिंग में) 10 मिनट के साथ दो नाट microgrooves के लिए । फायरिंग दर की गणना के लिए केवल प्रचार करने वाली इकाइयों पर विचार किया गया । विभिंन गोलीबारी दर स्तरों के बावजूद गतिविधि सिंक्रनाइज़ेशन को नोट करें । तात्कालिक गोलीबारी दर १०० ms. के एक मानक विचलन के साथ एक गाऊसी कर्नेल के साथ स्पाइक घटनाओं convolving गणना की गई थी इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 5
चित्रा 5 . µ ef में extracellular रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता । (a) समय विंडो (1 सेकंड) के एक µ ef रिकॉर्डिंग (चूहे cortical न्यूरॉन्स में 15 दिनों में) 20 kHz और एक उच्च-पास फिल्टर की एक नमूना दर के साथ ३०० हर्ट्ज. इलेक्ट्रोड पंक्तियाँ 1-7 स्मल डिब्बे और पंक्तियों के लिए 8-11 microgrooves करने के लिए अनुरूप. (ख) बॉक्स और मूंछ की साजिश की पूरी श्रृंखला के स्पाइक आयाम निकाले गए (एक सीमा विधि का उपयोग कर पाया spikes, केवल नकारात्मक चरण के साथ, 6x मानक विचलन पर सेट) निर्दिष्ट पंक्तियों से (कुल रिकॉर्डिंग समय 10 मिनट). spikes के आयाम microgrooves के भीतर microelectrodes में काफी बड़ा कर रहे हैं (पंक्तियाँ 8-11; 16 microgrooves), स्मल डिब्बे के microelectrodes की तुलना में (पंक्तियाँ 1-7; 16 सक्रिय microelectrodes). वन-तरफ़ा ANOVA, डन के मल्टीपल मुक़ाबले टेस्ट, * * * *p < 0.0001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे एक µ ef इकट्ठा करने के लिए, एक microfluidic डिवाइस और मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डिजाइनों के साथ एक मेे शामिल, और रिकॉर्ड किए गए डेटा का विश्लेषण करने के लिए कैसे ।

जब एक प्रयोग डिजाइन, शोधकर्ताओं को ध्यान में रखना चाहिए कि इन विट्रो मॉडल मेे तय ग्रिड द्वारा सीमित है, जो microgroove व्यवस्था को विवश करता है । एक विशेष microfluidic या विदेश मंत्रालय डिजाइन का उपयोग विशिष्ट प्रयोगात्मक जरूरतों पर निर्भर करेगा, लेकिन सामान्य रूप से, एक ही प्रक्रिया कदम अलग µ ef विन्यास के लिए लागू करना चाहिए.

µ ef assembly से पहले किया जाने वाला एक महत् वपूर्ण निर्णय यह है कि उपयोगकर्ता भविष् य के प्रयोगों में इकट्ठे µ ef का पुन: प्रयोग करना चाहता है । दोनों सतहों पर ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ उपचार रहत२०covalently बांड microfluidic उपकरणों को किया जा सकता है. हालांकि, इस सीलिंग अक्सर आगे प्रयोगों के लिए विदेश मंत्रालय अनुपयोगी चिप्स बनाता है, microfluidic डिवाइस अचल नुकसान passivation परत को अलग करने के रूप में । इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, अनुसंधान समूहों के लिए घुड़सवार µ ef, संभव कमियां (जैसे, पिछले प्रयोगों से मलबे) के बावजूद पुनः प्रयोग करते हैं । ध्यान से इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित चरणों का पालन करके, प्रयोग से प्रयोग करने के लिए, एक सुरक्षित रूप से संलग्न कर सकते है और microfluidic उपकरणों मेे हानिकारक बिना अलग ।

µ ef के उपयोग microgrooves के भीतर axons का एक सेट के अलगाव की अनुमति देता है । axons की एक उचित संख्या के लिए आवश्यक समय microgrooves पार करने के लिए बहुत सेल बोने की प्रक्रिया पर निर्भर करेगा, अर्थात् बीज कोशिका घनत्व । इस प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट घनत्व का उपयोग करना, न्यूरॉन्स 3 से 5 DIV के भीतर पूरे microgroove पार करने के लिए उपयोग.

संस्कृति पर्यावरण पर निर्भर करता है (यानी, मशीन और आर्द्रता स्तर), यह मीडिया की जगह की आवश्यकता हो सकती है हर 2 संस्कृति के 3 दिनों के लिए । मीडिया का नवीनीकरण करते समय, मीडिया को मुख्य चैनलों के भीतर मीडिया को बनाए रखते हुए µ ef वेल्स से निकालें । फिर, धीरे से µ ef वेल्स के लिए मीडिया को जोड़ने के लिए इसे धीरे अंतिम मीडिया मात्रा के साथ कुओं भरने से पहले मुख्य चैनलों के माध्यम से प्रवाह की अनुमति । इन सिफारिशों के बाद, हम स्वस्थ परिस्थितियों में इन संस्कृतियों को बनाए रखने के कम से एक महीने के लिए कर रहे हैं ।

इस मंच का एक महत्वपूर्ण लाभ को अलग करने की क्षमता है, उपाय और ट्रैक axonal संकेतों । हालांकि µ ef रिकॉर्डिंग सरल है, डेटा है कि उत्पंन किया जा सकता है की बड़ी राशि को संभाल बोझिल है और डेटा विश्लेषण के अच्छे ज्ञान की आवश्यकता है । विश्लेषण सॉफ्टवेयर यहां इस्तेमाल किया, µ spikehunter21, एक उंनत अभी तक सहज ज्ञान युक्त गणना उपकरण है, जो कई संबंधित उपायों की विस्तृत ठहराव के लिए अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, प्रचार की घटनाओं, प्रसार वेग आदि) में कुछ कदम । हालांकि डेटा विश्लेषण इस प्रोटोकॉल का फ़ोकस नहीं है, लेकिन यहां दी गई जानकारी पहले से ही सार्थक डेटा की निष्कर्षण को µ ef रिकॉर्डिंग से अनुमति देती है । हालांकि, यह ध्यान दें कि microgroove प्रति एक एकल axon के विश्वसनीय अलगाव अव्यावहारिक रहता है महत्वपूर्ण है । इस प्रकार, बहुत जटिल स्पाइक waveforms (microgroove के माध्यम से गुजर कई axons के कारण) उत्पन्न हो सकता है और कील समय और प्रसार वेग गणना को प्रभावित. इस सीमा बहुत संकीर्ण microgrooves का उपयोग करके तनु किया जा सकता है (5 µm नीचे)13 और/या के माध्यम से कील तकनीक21छंटाई, जो मदद अलग संकेत स्रोतों भेद ।

हालांकि इन विट्रो संस्कृतियों में vivo जटिलता में पूर्ण दोहराऊंगा नहीं कर सकता, µ ef के साथ उनके संयोजन अच्छी तरह से नियंत्रित नीचे-अप अनुसंधान दृष्टिकोण सक्षम बनाता है । हमें उंमीद है कि इस प्रोटोकॉल दोनों शुरुआती और कुशल विदेश मंत्रालय में मदद मिलेगी ंयूरॉंस सर्किट में electrophysiological संचार के अध्ययन के लिए नए और विश्वसनीय मॉडल की स्थापना ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम FEDER-फंडो Europeu de Desenvolvimento क्षेत्रीय कोष द्वारा प्रतिस्पर्धा के लिए २०२०-Operacional कार्यक्रम के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था और अंतर्राष्ट्रीयकरण (POCI), पुर्तगाल २०२०, और पुर्तगाली धन द्वारा FCT के माध्यम से-Fundação पैरा एक Ciência ई ए Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino परियोजना के ढांचे में सुपीरियर PTDC/सीटीएम-नण/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-०१६६२३) । जोस सी Mateus FCT (पीडी/BD/135491/2018) द्वारा समर्थित किया गया था । पाउलो अगुइयार ने Programa Ciência-Programa Operacional पोटेंशीयल Humano (POPH)-वैज्ञानिक रोजगार, ESF और MCTES और कार्यक्रम Investigador FCT, POPH और फंडो सोशल Europeu को बढ़ावा देने का समर्थन किया था. microfluidic उपकरणों INESC-माइक्रोसिस्टंस और Nanotechnologies, पुर्तगाल, João पेड्रो Conde और वर्जीनिया चू के पर्यवेक्षण के तहत में गढ़े थे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B-27 Suplement (50X) Thermo Fisher Scientific LTI17504-044
Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa Sigma-Aldrich 408727 Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI.
Cell strainer (40 µm)  Falcon 352340
Conical microtubes (1.5 ml) VWR 211-0015
Disposable diaper, 60x40 cm Bastos Viegas SA 455-019
Forceps Dumont #5, straight Fine Science Tools 91150-20
Forceps Dumont #5/45 Fine Science Tools 11251-35
Forceps Dumont #7, curved Fine Science Tools 91197-00
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium Biowest S181BH-500ML
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm  Sigma-Aldrich L2020-1MG Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles.
L-Glutamine 200mM  Thermo Fisher Scientific LTID25030-024
Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) Marienfeld 630010
Neurobasal Medium (1X) Thermo Fisher Scientific 21103-049 Basal medium used for neuronal cultures
PDMS microfluidic devices  not applicable not applicable Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm).
Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) Biowest L0022-100
PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm  Frilabo 1730012
Polypropylene conical tubes, 15 ml Thermo Fisher Scientific 07-200-886
Polypropylene conical tubes, 50 ml Thermo Fisher Scientific 05-539-13
Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml  Thermo Fisher Scientific 1367811D
Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml  Thermo Fisher Scientific 1367811D
Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa)   Spectrum labs 132107
Standard surgical scissor Fine Science Tools 91401-14
Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) Multi Channel Systems 256MEA100/30iR-ITO 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm.
Syringe luer-lock tip, 10 ml  Terumo Europe 5100-X00V0
Syringe luer-lock tip, 50 ml  Terumo Europe 8300006682
Terg-A-Zyme Sigma-Aldrich Z273287  Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning
Tissue culture plates, 35 mm  StemCell Technologies 27150
Tissue culture plates, 90 mm Frilabo 900095
Trypan Blue solution (0.4%)  Sigma-Aldrich T8154
Trypsin (1:250) Thermo Fisher Scientific 27250018
Vinyl tape 471 3M B40071909

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References

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इंजीनियरिंग अंक १४२ microelectrode arrays microfluidic डिवाइस न्यूरॉन सर्किट कार्रवाई क्षमता प्रसार वेग न्यूरॉन्स संचार extracellular रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डेटा विश्लेषण सूचना प्रसारण अभिकलनी उपकरण ंयूरॉन संस्कृति ंयूरॉंस गतिविधि
Microelectrode सरणियों के साथ Microfluidics संचार और Axonal सिग्नल प्रोपेगेशन का अध्ययन करने के लिए सामना करना पड़
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Lopes, C. D. F., Mateus, J. C., Aguiar, P. Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation. J. Vis. Exp. (142), e58878, doi:10.3791/58878 (2018).

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