Summary
Denne protokol har til formål at demonstrere, hvordan man kombinere i vitro mikroelektrode arrays med mikrofluid enheder til at studere aktionspotentialet transmission i neuronal kulturer. Dataanalyse, nemlig påvisning og karakterisering af prydplanteformeringsmateriale aktion potentialer, er udført ved hjælp af en ny avanceret, men brugervenlig og frit tilgængelige, computational værktøj.
Abstract
Mikroelektrode arrays (MMA) er almindeligt anvendt til at studere neuronal funktion i vitro. Disse enheder tillade samtidige non-invasiv optagelse/stimulation af elektrofysiologiske aktivitet i lange perioder. Egenskaben for sensing signaler fra alle kilder omkring hver mikroelektrode kan imidlertid blive ugunstige når de forsøger at forstå kommunikation og signalere formering i neuronal kredsløb. I et neuronal netværk, flere neuroner kan aktiveres samtidig og kan generere overlappende handling potentialer, hvilket gør det vanskeligt at skelne og spore signal formering. I betragtning af denne begrænsning, har vi etableret en in vitro- setup fokuseret på vurderingen af elektrofysiologiske kommunikation, som er i stand til at isolere og forstærke cytoskeletale signaler med høj rumlige og tidsmæssige opløsning. Af en grænseflade mikrofluid enheder og multilaterale miljøaftaler, kan vi inddeler neuronal kulturer med en velkontrollerede justering af axoner og microelectrodes. Denne konfiguration giver mulighed for optagelser af spike formering med en høj signal-støj-forholdet i løbet af flere uger. Kombineret med specialiseret data analyse algoritmer, det giver detaljerede kvantificering af flere kommunikation relaterede egenskaber såsom formering hastighed, overledning fiasko, fyring sats, anterograd pigge, og kodning mekanismer.
Denne protokol viser, hvordan du opretter en opdelte neuronal kultur opsætning via substrat-integreret multilaterale miljøaftaler, sådan kultur neuroner i denne opsætning, og hvordan at registrere, analysere og fortolke resultaterne fra sådanne eksperimenter. Vi viser her, hvordan den etablerede setup forenkler forståelse af neuronal kommunikation og cytoskeletale signal formering. Disse platforme bane vejen for nye in vitro- modeller med manipuleret og kontrollerbar neuronal netværk topografi. De kan bruges i forbindelse med homogene neuronal kulturer eller med fælles kultur konfigurationer hvor, for eksempel, kommunikation mellem sensoriske neuroner og andre celletyper er overvåget og vurderet. Denne opsætning giver meget interessante betingelser at studere, for eksempel, forstyrrelser i nervesystemets udvikling, neuronal kredsløb, information kodning, neurodegeneration og neuroregeneration tilgange.
Introduction
Forstå elektrisk kommunikation i neuronal kredsløb er et afgørende skridt til at afsløre normale funktion, og udarbejde terapeutiske strategier til at løse dysfunktion. Neuroner integrere, beregne og relæ handling potentialer (APs) som udbrede langs deres tynde axoner. Traditionelle elektrofysiologiske teknikker (fx patch klemme) er kraftfulde teknikker til at studere neuronal aktivitet, men er ofte begrænset til de større cellulære strukturer, såsom soma eller dendritter. Billedbehandling teknikker tilbyde et alternativ til at studere cytoskeletale signaler med stor rumlig opløsning, men de er teknisk vanskeligt at udføre og ikke tillader langsigtede mål1. I denne sammenhæng, kan kombinationen af mikroelektrode arrays (MMA) og mikrofluidik yde et stærkt bidrag i afslørende de grundlæggende egenskaber for neuron´s aktivitet og signal transmission inden for neuronal netværk in vitro-2 , 3.
MEA teknologi bygger på ekstracellulære optagelser af neuronal kulturer. De vigtigste fordele ved denne elektrofysiologiske metoder er dens evne til at støtte langsigtede, samtidige stimulation og optagelse på flere steder og i en ikke-invasiv måde3. MMA er lavet af biokompatible, høj ledende og korrosionsbestandig microelectrodes indlejret i et glas wafer substrat. De er kompatible med konventionel celle kultur bio-belægninger, som ved at fremme celle friktion betydeligt øger den forsegling modstand mellem substrat og celler3,4. Derudover er de alsidige i design og kan variere i microelectrodes størrelse, geometri og tæthed. Samlet set arbejde MEAs som konventionel celle kultur fartøjer med fordelen, at samtidige live imaging og elektrofysiologiske optagelser/stimulation.
Brugen af MEA teknologi har bidraget til studiet af vigtige funktioner af neurale netværk5. Men der er iboende egenskaber, der begrænser udførelsen af multilaterale miljøaftaler for at studere kommunikation og APs formering i et neuronal kredsløb. MEAs aktiverer optagelser fra enkelt celler og endda subcellulært strukturer som axoner, men i forhold til somal signaler, cytoskeletale signaler har et meget lavt signal / støj-forhold (SNR)6. Endvidere hæmmer karakteristisk for sensing ekstracellulære felt potentialer fra alle kilder omkring hver mikroelektrode sporing af signal formering i et neuronal kredsløb.
Nylige undersøgelser har imidlertid vist, at bedre optagelse betingelser kan opnås ved at have de microelectrodes linje inden for snævre microchannels, hvori axoner kan vokse. Denne konfiguration giver en betydelig stigning i SNR sådan at formerings cytoskeletale signaler kan være let fundet7,8,9,10,11,12, 13. Strategien for allierer mikrofluid enheder med MEA teknologi skaber en elektrisk isoleret mikromiljø egnet til at forstærke cytoskeletale signaler11. Tilstedeværelsen af flere sensing microelectrodes langs en microgroove er desuden afgørende for påvisning og karakterisering af cytoskeletale signal propagation.
Sådanne in vitro- platforme med meget styrbar neuronal netværk topografi kan tilpasses til mange forskning spørgsmål14. Disse platforme er egnede til at blive brugt i forbindelse med neuronal kulturer men kan udvides til Engineering Co kultur konfigurationer, hvor kommunikationen mellem neuroner og andre celletyper kan overvåges og vurderes. Denne opsætning giver således meget interessante betingelser at udforske en række neurale-relaterede studier som forstyrrelser i nervesystemets udvikling, neuronal kredsløb, information kodning, neurodegeneration og neuroregeneration. Derudover kan kombination med nye modeller af menneskelige inducerede pluripotente stamceller15,16 åbne nye veje i udviklingen af potentielle terapier for menneskelige sygdomme, der påvirker nervesystemet.
Vores laboratorium bruger denne platform kombinerer microelectrodes med mikrofluidik (µEF) for at forstå neuronal processer på det cellulære og netværket niveau og deres konsekvenser i fysio- og patologiske nervesystem. Da værdien af sådanne platform inden for neuroscience, formålet med denne protokol er at vise, hvordan du opretter en opdelte neuronal kultur over substrat-integreret MEAs, hvordan kultur neuroner i denne platform og hvordan man med held optage, analysere og fortolke resultaterne fra sådanne eksperimenter. Denne protokol vil helt sikkert berige den eksperimentelle værktøjskasse til neuronal kulturer i studiet af neurale kommunikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr blev udført i den Europæiske Union (EU) direktiv 2010/63/EU (omsat til portugisisk lovgivning ved Decreto-Lei 113/2013). Forsøgsplan (0421/000/000/2017) blev godkendt af det etiske udvalg af både den portugisiske officielle myndighed på dyrevelfærd og eksperimenter (Direção-Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV) og vært Institution.
1. forberedelse af dyrkningsmedier og andre løsninger
Bemærk: Forberede frisk belægning løsninger på dagen for dens anvendelse. Ubrugte belægning løsninger og kultur medier kan opbevares ved-20 ° C og 4 ° C som beskrevet nedenfor.
- Forberede 10 mL 0,05% (v/v) Poly(ethylene imine) (PEI) brugsopløsning.
- Forberede 20 mL af stamopløsningen 0,25% (w/v) PEI ved at opløse renset PEI (Se Tabel af materialer) i sterilt vand.
- Fortyndes 2 mL 0,25% (w/v) PEI stamopløsning i 8 mL sterilt, destilleret vand. Bland godt og bruge. Uudnyttede løsning kan opbevares ved 4 ° C.
- Forberede 1 mL af en 5 µg/mL laminin løsning.
- Fortynd 5 µL af 1 mg/mL laminin stamopløsning i 995 µL af basal medium (Se Tabel af materialer). Bland godt og bruge. Uudnyttede løsning kan opbevares frosset ved-20 ° C i op til 1-2 uger.
- Forberede 1 liter HEPES-buffered Hank afbalanceret saltopløsning (H-HBSS).
- Forberede 1 M HEPES løsning ved at opløse 11,9 g HEPES pulver i 50 mL i ultrarent vand. Justere pH til 7,2.
- Forberede H-HBSS løsning (uden calcium og magnesium) ved at opløse 5,33 mM kaliumchlorid, 0,44 mM kalium fosfat monobasic, 138 mM natriumchlorid, 0.3 mM natriumfosfat dibasiske og 5,6 mM glukose i 800 mL i ultrarent vand.
- Tilsættes 15 mL 1 M HEPES (endelig koncentration på 15 mM).
- Justere pH til 0,2-0,3 enheder under den ønskede pH 7,4 bruger 1 N HCl eller 1 N NaOH. Tilsættes ultrarent vand til fyldes op endelige løsning.
Bemærk pH har tendens til at stige i løbet af filtrering. - Sterilisere ved filtrering ved hjælp af et 0,22 µm porøsitet poly(ether sulfone) (PES) membran.
- Forberede 10 mL af H-HBSS der indeholder 10% varme-inaktiverede føtal bovint Serum (hiFBS).
- Fortyndes 1 mL af hiFBS i 9 mL H-HBSS. Bland godt og bruge. Uudnyttede løsning kan opbevares ved 4 ° C i 3-4 uger.
- Forberede 5 mL 1,5 mg/mL trypsin løsning.
- Umiddelbart før anvendelsen, opløses 7,5 mg af trypsin i 5 mL af H-HBSS. Sterilisere ved filtrering ved hjælp af et 0,22 µm porøsitet PES membran.
- Forberede 50 mL af suppleres med medium.
- I en 50 mL konisk slange, bland 48.5 mL af basal medium (Se Tabel af materialer), 2% (v/v) B-27 supplement, 0,5 mM L-glutamin og 1% Pen/Strep (10.000 U/mL penicillin og 10.000 µg/mL streptomycin). Suppleres med medium kan opbevares ved 4 ° C i 3-4 uger.
2. mikrofluid og MEA enheder forberedelse
Bemærk: Udfør trin 2.1-2.11 dagen før celle såning.
- Ren mikrofluid enheder til at fjerne fabrikation og andre belægninger med vinyl bånd. Tryk forsigtigt tape mod enheden til at nå alle områder af enheden.
- Luft plasma-clean MEA i 3 min. (0,3 mbar) for at rengøre overfladen og gøre det mere hydrofile.
- Kort nedsænkes mikrofluid enheder i 70% ethanol og lade dem lufttørre inde i en laminar flow hætte.
- Placer hver MEA i en steril 90 mm petriskål og sterilisere dem af 15 min af ultraviolet (UV) lys eksponering.
- Frakke MEA centrale overfladearealet af inkubere med 500 µL af 0,05% (v/v) PEI løsning for mindst 1 h ved 37 ° C.
Bemærk: Som beskrevet af andre17, PEI belægning af multilaterale miljøaftaler resulterer i mindre celle klyngedannelse end ved hjælp af poly(lysine) belægning. - Opsug PEI belægning løsning fra MEA overflade og vaske MEAs 4 x med 1 mL sterilt destilleret vand. Vær omhyggelig med at berøre MEA overfladen under vask skridt, da dette kan beskadige elektroderne.
- Styret af et stereomikroskop inde i en laminar flow hætte, center MEA chip og tilsættes 1 mL sterilt vand til det centrale område af MEA.
- Placer mikrofluid enheden på toppen af MEA overflade.
- Omhyggeligt justeres microgrooves af mikrofluid enhed med mikroelektrode gitter af MEA.
- Når korrekt justeret, omhyggeligt Opsug den overskydende vand uden at røre MEA eller mikrofluid enhed.
- Inkubér µEFs natten over ved 37 ° C til tørre og tillader komplet vedhæftet fil. For at lette den vedhæftede fil, tryk forsigtigt mikrofluid enheden mod MEA.
Bemærk: Udføre trin 2.12 på dagen for celle såning. - Når µEFs har helt tørret, indlæse mikrofluid brøndene med 150 µL af 5 µg/mL laminin belægning løsning og inkuberes ved 37 ° C i mindst 2 h før celle såning.
Bemærk: Når lastning µEF med laminin løsning, sikre at løsningen fylder microgrooves. Brug et vakuum til at fjerne enhver luftboble, der kan være til stede inden for microgrooves.
3. præfrontal Cortex dissektion
- Forberede embryo fjernelse området dissektion.
- Desinficer den arbejdende overflade og de kirurgiske instrumenter med 70% ethanol.
Bemærk: Selvom dette dissektion ikke er en steril procedure, desinfektion hjælper til at reducere risikoen for forurening. - Brug en ren engangs ble til at begrænse området dissektion og lægge ud de kirurgiske instrumenter for embryo fjernelse.
- Forbered 4 90 mm petriskåle fyldt med kolde H-HBSS og placere dem på en bakke med isen i nærheden af området dissektion.
- Desinficer den arbejdende overflade og de kirurgiske instrumenter med 70% ethanol.
- Aflive en E-18 tid-gravid Wistar rotter af kuldioxid (CO2) indånding.
- Efter afslutningen af proceduren, fjerne dyret fra CO2 kammeret og bekræfte død af en sekundær metode for dødshjælp, som exsanguination.
- Placer den animalske ventrale side op på den engangs ble, spray underlivet med 70% ethanol, og med hjælp fra pincet og saks, lave en U-form skære igennem huden til at udsætte livmoderen.
- Forsigtigt fjerne embryoner fra livmoderen ved at skære væk enhver bindevæv og placere dem i en af petriskåle med kolde H-HBSS.
- Fjern hvert embryon fra sin embryonale sac, og med hjælp fra pincet og saks, halshugge embryonet.
- Overfør embryo´s hovedet til en anden petriskål fyldt med kolde H-HBSS.
- Gentag trin 3.6-3.7 for hvert embryon.
- Dissekere den præfrontale cortex.
- Overføre en embryo´s hoved til et tredje petriskål.
- Brug et par pincet til at udsætte hjernen.
- Fjerne hjernen fra dens hulrum og dække det med kolde H-HBSS.
- Hvis den nuværende, Fjern og kassér den olfaktoriske pære. Dissekere den præfrontale cortex og fjerne meninges.
- Overføre de præfrontale cortex fragmenter til en fjerde petriskål fyldt med kolde H-HBSS.
- Gentag trin 3.9.1 - 3.9.5 for hvert embryon.
4. kortikale neuroner Dissociation og kultur på µEF
Bemærk: Følgende procedurer blev udført i en laminar flow hood efter en 15 min cyklus af UV sterilisation. Arbejde overflade område samt alle de materialer, der er placeret inde i hætten skal tidligere desinficeres med 70% ethanol.
- Som beskrevet i trin 1,5, opløses den tidligere vejede trypsin i 5 mL af H-HBSS og opløsningen filtreres.
- Indsamle cortex stykker tidligere dissekeret i alt 5 mL af H-HBSS. Overføre dem til en steril 15 mL konisk slange.
- Tilføje 2,3 mL af frisklavede 1,5 mg/mL trypsin løsning til rør indeholdende cortex fragmenter.
- Bland suspension og inkuberes ved 37 ° C i 15 min. (kortvarigt agitere hver 5 min).
- Stop væv fordøjelse og vaske ud trypsin.
- Supernatanten, der indeholder trypsin. Der tilsættes 5 mL af H-HBSS indeholder 10% hiFBS til at inaktivere de resterende trypsin; forsigtigt agitere.
- Lad cortex fragmenter slå sig ned og derefter supernatanten.
- Der tilsættes 5 mL af H-HBSS til at fjerne hiFBS rester. Lad cortex fragmenter slå sig ned og supernatanten.
- Vask igen cortex fragmenter med 5 mL af H-HBSS.
- Lad cortex fragmenter slå sig ned og supernatanten. Der tilsættes 5 mL af suppleres med neuronal medium.
- Mekanisk adskille cortex fragmenter med 5 mL serologiske pipette af pipettering langsomt op og ned til 10 - 15 gange. Hvis det er nødvendigt, gentage proceduren ved hjælp af en lille kaliber pipette, indtil cellesuspension bliver homogen.
- Kassér de resterende undissociated væv af filtrering celle suspension lavpunktet en 40 µm celle si.
- Tælle levedygtige celler og bestemme den celle tæthed.
- Tilføj 20 µL af 0,4% (w/v) Trypan blå til en 20 µL cellesuspension i en microtube. Bland godt at homogenatet løsningen og overføre 10 µL til en Neubauer tælle kammer.
- Tælle levedygtige celler og bestemme den celle tæthed af levedygtige celler.
- Justere celle tæthed til 3,6 x 107 celler/mL (hvis det er nødvendigt, centrifugeres cellesuspension).
- Umiddelbart før celle såning, fjerne laminin belægning fra alle brønde af µEF. Tilsæt 50 µL suppleres med medium til hver brønd µEF cytoskeletale rum.
- Seed 5 µL af cellesuspension i µEF somal rum. Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time, for at tillade celler fastgørelse til underlaget.
- Forsigtigt fylde hver godt af µEF med varmede suppleres med medium. Overførsel af µEF til en luftfugter inkubator ved 37 ° C leveres med 5% CO2.
Bemærk: For at undgå hurtig næringssubstratet fordampning, placere en åbnet microtube fyldt med vand inde i petriskålen bærer µEF. - Vedligeholde kulturer for den krævede periode ved at erstatte 50% af næringssubstratet hver anden til tredje dag af kultur.
Bemærk: Efter forsøgene, mikrofluidik kan afmonteres fra MEAs ved at nedsænke µEF i vand natten over. Hvis det er nødvendigt, skræl forsigtigt mikrofluidik ved hjælp af pincet. Multilaterale miljøaftaler kan renses ved natten inkubation med en 1% (v/v) kommerciel enzymatisk vaskemiddel (Se Tabel af materialer).
5. optage spontane Neuronal aktivitet
Bemærk: Embryonale kortikale neuron kulturer på MEAs typisk udviser spontan aktivitet så snart 7 dage in vitro (DIV), men tag 2-3 uger (14-21 DIV) til modne og udstille stabil aktivitet. Det er op til eksperimentatoren at afgøre, hvornår de skal starte de elektrofysiologiske målinger baseret på målene for undersøgelsen. I denne protokol, optagelse af neuronal aktivitet fra µEF er påvist ved hjælp af en kommerciel registreringssystem (Se Tabel af materialer til hardware detaljer), med en opvarmning modul indarbejdet. For at udføre optagelser, vi brugte en frit tilgængelig software (Se Tabel af materialer for software detaljer).
- Tænd for MEA optagelse system og temperatur controller og tillade opvarmet bundpladen af forforstærker til 37 ° C.
Bemærk: For optagelser, langsigtede (> 30 min ad gangen) man bør også have et system, der fastholder en CO2 atmosfære. - Sted µEF på forforstærker (headstage).
Bemærk: Sikre, at MEA chip er korrekt justeret med referencenummer i øverste venstre kant. MEA chippen vi bruger er rotationsstøbt symmetrisk, men denne tilpasning matcher den korrekte orientering af pin layout af elektroder og hardware-id'er. - Lukke og låsen forforstærker låget.
- Hvis du vil optage, åbne optagelse software og definere parametrene optagelse og stien til de registrerede datastreams (Se software manual for oplysninger om hvordan man set-up en optagelse ordning).
Bemærk: En anskaffelse med en samplingfrekvens på 20 kHz er normalt nok for de fleste applikationer. En højere samplingfrekvens tilrådes eventuelt mere præcision i spike tidsindstillinger. Hvis man har til hensigt kun at optage pigge, skal du angive et high-pass filter ved 300 Hz, der vil dæmpe de lavere frekvens komponenter af signalet. Hvis rå og filtrerede data registreres samtidigt, vil dette øge filstørrelsen data. Det er altid muligt at gøre offline filtrering af de rå data. For at reducere data kan filstørrelse, man også begrænse microelectrodes hvorfra post (f.eks. kun microelectrodes inden for microgrooves). - Klik på Start DAQ for at starte dataopsamling. Kontrollere hvis displayet viser kørende spor af aktiviteten og start optagelsen.
Bemærk: Støjniveauet er normalt lidt højere i microelectrodes svarende til microgrooves. Hvis støjniveauet er for høj (peak til peak amplitude > 50 µV) eller usikker i flere microelectrodes, det kunne være på grund af snavs, der hindrer en god pin-pad kontakt. Dette problem er normalt løses ved forsigtigt rengøring MEA kontakt puder og forforstærker pins ved hjælp af en vatpind fugtet med 70% ethanol. - Åbn filen registreres i analyse software (Se Tabel af materialer) til hurtigt udforske data.
6. dataanalyse
Bemærk: Følgende trin viser hvordan man bruger µSpikeHunter software, en beregningsmæssige værktøj udviklet på Aguiar's lab (frit kan bestilles på e-mail til pauloaguiar@ineb.up.pt), for at analysere data registreres med µEF. En grafisk brugergrænseflade (figur 2) bruges til at indlæse dataene, identificere planter spike waves, bestemme deres retning (anterograd eller retrograd) og anslå formering hastigheder. µSpikeHunter er kompatibel med HDF5 filer genereres fra optagelser fremstillet ved hjælp af MEA2100-familien systemer, som kan bruges i forbindelse med 60 - 120- og 256-elektrode multilaterale miljøaftaler. De optagelser, indhentet ved hjælp af multi-kanal eksperimentatoren kan nemt omdannes til HDF5 filer ved hjælp af frit tilgængelige software (Se Tabel af materialer).
- Klik på Gennemse for at vælge optagelse. Klik derefter på knappen File Info for at vise samplingfrekvensen, båndoptagelsens varighed samt en liste over registrerede data-streams (f.eks. rå data, filtrerede data).
Bemærk: For ægte formering velocity skøn, det anbefales at vælge rå data-stream til analyse. - Vælg microelectrodes (enkelt række eller kolonne tilknyttet microgroove) for analyse og indstille spike påvisning tærskelværdi (positive eller negative fase) på 6 x standardafvigelse (SD) af signal-støj. Klik på Læse Data for at anvende begivenhed detektor og få identificeret formering sekvenser.
Bemærk: Hvis kriterierne er opfyldt, en liste over fundne formering sekvenser vil befolke panelet analyse. Brugeren kan derefter se og interagere med flere analyseværktøjer til formering sekvens, herunder spænding spor, Inter mikroelektrode cross-sammenhænge, single-sekvens formering hastigheder, en kymograph og en audio playback værktøj. Selv om formering hastighed estimering kan fås for ethvert par af microelectrodes eller som gennemsnittet af estimater for alle par, er dette skøn mere pålidelige, hvis det fjerneste par er valgt. - Gentag det forrige trin for mikroelektrode sæt af interesse. Hver gang skal du klikke på Gem alle begivenheder for at spare tid og amplitude af pigge (på hver af microelectrodes) for alle identificerede formering sekvenser til en CSV-fil.
- Importere CSV-filer til data analyse miljøer for yderligere analyse af mønstrene af aktivitet af kultur (fx fyring sats, Inter spike intervaller).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af protokollen beskrevet her, er E-18 rotte kortikale neuroner seedede på µEF at udvikle og forblive sunde i disse dyrkningsbetingelserne for over en måned. Så snart 3 til 5 dage i kultur, vokse kortikal neuroner deres axoner gennem microgrooves mod den cytoskeletale rum i µEF (figur 1). Efter 15 dage i kultur, kortikal neuroner kulturperler på µEF forventes at udvise stabile niveauer af aktivitet og formering af handling potentialer langs microgrooves forventes. Ældre kulturer (> 14 DIV) tendens til at være domineret af sprængfyldt aktivitet som konventionelle MEA optagelser18,19.
Optagelser og data analyse
Rå dataanalyse med µSpikeHunter (figur 2) tilladt påvisning og udvinding af formeringsmateriale spike bølger langs sæt af 4 microelectrodes (indenfor microgrooves). Figur 3 viser en af disse begivenheder. µSpikeHunter tilladt for vurdering af udbredelse hastigheder, baseret på tværs-korrelationer mellem spænding bølgeformer af udvalgte par af microelectrodes (giver en forsinkelse) og tilknyttede kendte Inter elektrode afstanden.
De udtrukne data blev yderligere analyseret ved hjælp af brugerdefinerede designet kode i MATLAB. En repræsentativ raster plot af det formeringsmateriale spike bølger langs 11 (ud af 16) microgrooves er vist i figur 4a. Øjeblikkelig fyring sats for en høj- og en lav-aktivitet microgroove er vist i figur 4b.
µEF optagelser udviser varierende niveauer af aktivitet pr. mikroelektrode. Ofte, er flere microelectrodes i somal rum "tavse". Men de fleste microelectrodes inden for microgrooves har tendens til at være aktive (figur 5a). Det er godt beskrevet, at microgrooves fungere som signal forstærkere8. Amplituden af en optagede signal afhænger af størrelsen af kilden strømme, men også på resistivitet omkringliggende medier. Modstand langs en microgroove er særlig høj, hvilket øger amplitude af de målte signaler i forhold til de af microelectrodes i somal rum (figur 5b).
Figur 1 . Embryonale rotte kortikale neuroner kulturperler på µEF. (a) fotografi af µEF. Skalalinjen: 1 cm. (b) repræsentativt billede af kortikale neuroner kulturperler i µEF i 5 dage, viser flere axoner krydse microgrooves og nå den cytoskeletale rum (pile). Skalalinjen: 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Screen capture af µSpikeHunter vigtigste anskuelighed brugergrænseflade. Brugeren kan indlæse data registreret med µEF, identificere planter spike waves, bestemme deres retning (anterograd eller retrograd) og anslå formering hastigheder. Et kymograph værktøj tillader bruger hen til manuelt vurdere formering hastighed baseret på en linje på kymograph. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Anterograd formeringsmaterialets spike bølge sanses af 4 microelectrodes (E8-E11) inden for en microgroove. Hver spore repræsenterer én mikroelektrode rå optagelse for 3 ms. efter analyse med µSpikeHunter, cross-korrelation mellem de fjerneste microelectrodes (E8 og E11) tilladt ved beregningen af en overførsel hastighed af 0,52 m/s. Klik venligst her for at Se en større version af dette tal.
Figur 4 . Oplysninger spærreild gennem microgrooves. (a) repræsentant raster plot 2 minutter af spontan aktivitet registreret langs 11 microgrooves. Hver prik repræsenterer en formeringsmaterialets spike bølge (enhed) sanses af 4 microelectrodes og identificeret gennem analyse med µSpikeHunter. En høj- og en lav-aktivitet microgroove er fremhævet i gult og rødt, henholdsvis. (b) udviklingen af øjeblikkelig fyring sats (som i sats-kodning) for de to markerede microgrooves langs 10 minutter. Eneste formeringsmaterialets enheder blev anset for beregningen af fyring sats. Bemærk aktivitet synkroniseringen, trods de forskellige fyring sats niveauer. Øjeblikkelig fyring sats beregnedes convolving spike begivenheder med en Gaussisk kerne med en standardafvigelse på 100 ms. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Kvaliteten af ekstracellulære optagelser i µEF. (a) tidsvindue (1 sekund) med en µEF optagelse (rotte kortikale neuroner på 15 dage i vitro) med en samplingfrekvens på 20 kHz og en high-pass filter ved 300 Hz. elektrode rækker 1-7 svarer til somal rum og rækker 8-11 til microgrooves. (b) boks og bakkenbart plot af den fulde vifte af spike amplituder udvundet (spikes påvises ved hjælp af en tærskel metode, med negative fase kun, sat på 6 x standardafvigelse) fra de angivne rækker (samlet optagetid på 10 minutter). Spikes' amplituder er betydeligt større i microelectrodes inden for microgrooves (rækker 8-11; 16 microgrooves), i forhold til microelectrodes af somal rum (rækker 1-7, 16 aktive microelectrodes). En-vejs ANOVA, Dunn's flere sammenligning test, ***p < 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenteres her viser hvordan man samler et µEF, bestående af en mikrofluid enhed og et MEA med standard kommercielt tilgængelige designs, og hvordan man analysere de registrerede data.
Når du udformer et eksperiment, skal forskere tage hensyn, in vitro- model er begrænset af MEA fast gitter, der begrænser microgroove ordninger. Brugen af en bestemt mikrofluid eller MEA design vil afhænge af de specifikke eksperimentelle behov, men generelt er de samme trin som procedure bør gælde for forskellige µEF konfigurationer.
En kritisk beslutning skal foretages før µEF forsamling er om brugeren agter at genbruge den samlede µEF i fremtidige eksperimenter. Behandling med ilt plasma på begge overflader kan gøres for at kovalent obligation mikrofluid enheder til MEAs20. Men denne forsegling ofte gør MEA chips ubrugelig til yderligere forsøg, som afmonterer enheden mikrofluid uigenkaldeligt skader passivation lag. For at omgå dette problem, forskergrupper har tendens til at genbruge den monterede µEF, trods de mulige ulemper (fx snavs fra tidligere forsøg). Ved at nøje følge trinene i denne protokol, fra eksperiment at eksperimentere, kan man sikkert vedhæfte og løsrive mikrofluid enheder uden at beskadige MEA.
Brugen af µEF giver isolation af et sæt af axoner i microgrooves. Tidsforbruget for et rimeligt antal axoner til at krydse microgrooves afhænger kraftigt celle såning procedure, nemlig seedede celle tæthed. Brug den tæthed, der er fastsat i denne protokol, neuroner bruge at krydse den hele microgroove inden for 3 til 5 DIV.
Afhængigt af kultur miljøet (dvs., inkubator og luftfugtighed), kan det være nødvendigt at erstatte media hver 2-3 dage af kultur. Når forny media, skal du fjerne medier fra µEF wells samtidig opretholde medier inden for de vigtigste kanaler. Derefter forsigtigt tilføje media µEF brønde gør det muligt at langsomt flow gennem de vigtigste kanaler før fylde brøndene med endelige media volumen. Efter disse anbefalinger er vi i stand til at opretholde disse kulturer i sunde forhold i mindst en måned.
En vigtig fordel af denne platform er evnen til at isolere, måle og spore cytoskeletale signaler. Selv om µEF optagelse er enkel, den store mængde data, der kan genereres er besværlige at håndtere og kræver godt kendskab til dataanalyse. Analyse software bruges her, µSpikeHunter21, er en avanceret endnu intuitiv beregningsmæssige værktøj, som giver mulighed for den nærmere kvantificering af flere relaterede foranstaltninger (f.eks. formeringsmateriale begivenheder, formering hastighed osv.) i et par skridt. Selv om Dataanalyse ikke er i fokus i denne protokol, tillader oplysningerne her allerede udvinding af meningsfulde data fra en µEF optagelse. Det er dog vigtigt at bemærke, at pålidelige isolering af et enkelt axon pr. microgroove forbliver upraktisk. Således kan meget komplekse spike bølgeformer (på grund af flere axoner passerer gennem microgroove) opstå og påvirke spike tidsindstillinger og formering velocity beregninger. Denne begrænsning kan dæmpes, ved hjælp af meget smalle microgrooves (under 5 µm)13 og/eller gennem spike sortering teknikker21, som hjælp til at skelne forskellige signalkilder.
Selvom i vitro kulturer ikke sammenfatte fuld i vivo kompleksitet, deres kombination med µEF giver mulighed for velkontrollerede bottom up forskning tilgange. Vi håber, at denne protokol vil hjælpe både begyndere og dygtige MEA brugere om oprettelse af nye og pålidelige modeller for at studere elektrofysiologiske kommunikation i neuronal kredsløb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af EFRU - Fundo Europeu de Desenvolvimento regionale midler gennem konkurrere 2020 - Operacional program for konkurrenceevne, og internationalisering (POCI), Portugal 2020, og af portugisiske midler gennem FCT - Fundação para en Ciência e en Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e nederlandsksprogede Superior inden for rammerne af projektet PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus blev støttet af FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar blev støttet af Programa Ciência - Programa Operacional Potencial system (POPH) - fremme af videnskabelige beskæftigelse, ESF og MCTES og programmet Investigador FCT, POPH og Fundo Social Europeu. Mikrofluid enheder blev fremstillet på INESC - Microsystems og nanoteknologi, Portugal, under tilsyn af João Pedro Conde og Virginia Chu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M.
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W.
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
