Aqui, apresentamos uma levedura melhorada híbrido-um protocolo para identificar os fatores de transcrição (TFs) que podem ligar a uma região de DNA humana de interesse de triagem. Esse método usa um pipeline de rastreio com throughput alto que pode interrogar a vinculação de > 1.000 TFs em uma única experiência.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Identificar os conjuntos de factores de transcrição (TFs) que regulam cada gene humano é uma tarefa difícil que requer a integração de diversas abordagens experimentais e computacionais. Um tal método é o ensaio (Y1H) um híbrido do fermento, em qual dessas interações entre TFs e DNA regiões são testadas no meio do núcleo fermento usando genes repórter. Y1H ensaios envolvem dois componentes: uma 'DNA-isca' (ex.., promotores, melhoradores, silenciadores, etc.) e um 'TF-presas,' que podem ser rastreada para ativação do gene repórter. Mais protocolos publicados para a realização de telas Y1H são baseados em transformar bibliotecas TF-presa ou matrizes em cepas de leveduras de DNA-isca. Aqui, descrevemos um pipeline, chamado Y1H reforçada (eY1H) os ensaios, onde interações TF-DNA são interrogadas por linhagens de DNA-isca com uma coleção de matriz de cepas de TF-presas usando uma matriz de alta densidade de acasalamento plataforma de robótica (HDA) que permite o rastreio em um 1.536 formato de colônia. Isto permite um aumento dramático na taxa de transferência (60 sequências de DNA-isca contra > 1.000 TFs leva duas semanas por pesquisador) e reprodutibilidade. Ilustraremos os diferentes tipos de resultados esperados através do teste de sequências de promotor humano contra uma matriz de 1.086 TFs humano, bem como exemplos de problemas que podem surgir durante as telas e como solucioná-los.
Introdução
Um problema central no campo biomédico é determinar os mecanismos pelo qual cada gene humano é regulamentado. Transcrição é o primeiro passo para controlar os níveis de expressão do gene, e ela é regulada por conjuntos de fatores de transcrição (TFs) que são exclusivos para cada gene. Dado que os seres humanos codificam para > 1.500 TFs1,2, identificando o conjunto completo do TFs que controlam a expressão de cada gene permanece um desafio aberto.
Dois tipos de métodos podem ser usados para mapear interações TF-DNA: TF-centrado e centrada no DNA métodos3 (
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. preparações
-
Placas −H de −U de SC (pratos de Petri 150 mm)
Nota: Estas placas serão usadas para o cultivo de cepas de leveduras a DNA-isca.- Dissolva a mistura de abandono, base de nitrogênio levedura (YNB), adenina hemisulfate e sulfato de amônio em 920 mL de água e pH para 5.9 com 5 M NaOH (aproximadamente 1 mL por litro de mídia; ver tabela 2 para composição). Despeje em um frasco de 2 L e adicionar uma barra de agitação.
- Em um segundo frasco de 2 L, adicione o ágar-ágar para 950 mL de água (não adicione uma barra de agitação como fará com que o ágar a ferver em autoclave). ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Três fatores principais devem ser considerados ao analisar resultados de ensaios de eY1H: a atividade de repórter de plano de fundo da estirpe DNA-isca, a força da atividade repórter correspondente a interações TF-DNA e o número de colônias positivas. A atividade de repórter de fundo (i.e., autoactivity) da estirpe DNA-isca refere-se ao crescimento global e cor das colônias na placa de leitura, mesmo na ausência de um TF-rapina fermento. Idealmente, as estirpes não-autoactive mostram uma fundo branco ou claro cor marrom,.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
A abordagem eY1H robótico acasalamento triagem descrita aqui grandemente aumenta o throughput para identificar o conjunto de TFs que se ligam a uma região de DNA de interesse, em comparação com o anterior rastreio de biblioteca ou triagem matriz abordagens baseadas na transformação. Além disso, as interações de TF-DNA detectadas pelo eY1H ensaios são altamente reprodutíveis como 90% das interações detectadas são positivos para todos os quatro colônias testado por TF, e 90% das interações reteste em uma tela independente .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health [R35-GM128625 de J.I.F.B.].
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 3-Amino-1,2,4-triazol (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Inibidor competitivo para produtos do gene HIS3 |
| Sulfato de adenina (hemissulfato), di-hidratado | US Biologicals | A0865 | Necessário para o crescimento adequado da levedura |
| Ágar Alta Força do Gel - Grau bacteriológico | American International | Chemical AGHGUP | Meios nutritivos para o crescimento da levedura |
| Sulfato de amônio | US Biologicals | A1450 | Fonte de nitrogênio em meio de levedura sintética |
| D+ Glicose Anidra | US Biologicals | G3050 | Necessário para o crescimento de levedura |
| Drop-Out Mix menos His, Leu, Tryp e Uracil, rico em adenina sem base de nitrogênio de levedura | US Biologicals | D9540-02 | Mídia sintética completa necessária para a borda de crescimento de levedura |
| Medidor de pH multiparâmetro | Hanna Instruments | HI2020-01 | Para medir o pH de meios |
| seletivos Palitos de Dente Planos 750 ct | Diamante | Para estriar leveduras em petrídeos | |
| Contas de Vidro | Walter Stern | 100C | Para espalhar leveduras ao fazer gramados |
| Glicerol ≥ 99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Necessário para fazer estoques de levedura congelados |
| L-Histidina | US Biologicals | H5100 | Para seleção de crescimento de levedura em meio seletivo |
| L-Leucina | US Biologicals | L2020-05 | Para seleção de crescimento de levedura em meio seletivo |
| L-Triptofano | Sigma T-0254 | Para seleção de crescimento de levedura em meio seletivo | |
| N, N-Dimetilformamida | Sigma | 319937-1L | Para fazer solução X-gal |
| Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | Para dispensar volumes precisos de mídia em placas Singer |
| Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Fonte de proteína necessária para o crescimento de levedura |
| Placa de Petri, 150 mm x15 mm | VWR | 10753-950 | Para o cultivo de iscas de levedura para triagem |
| PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | Para fazer placas de ágar retangulares para usar com a |
| Incubadora Refrigerada BOD de Baixa Temperatura Singer Robot Precision | ThermoFisher Scientific | PR205745R | Para incubar placas de levedura a temperatura constante |
| RePads 1.536 curtos | Singer Instruments | REP-005 | Para transferir a matriz de presas TF, levedura mate e levedura de transferência para placas de seleção e leitura diplóides |
| RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | Para transferir matriz TF-prey de 384 para 1.536 formato de colônia |
| RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | Para transferir matriz TF-prey do estoque de glicerol para a placa de ágar |
| RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | Para transferir TF-prey array de 96 para 384 formato de colônia |
| Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | Para transferir levedura de maneira de alto rendimento | |
| Hidróxido de Sódio (Pellets/ACS Certificado) | Fisher | S318-1 | Para ajustar o pH de meios seletivos |
| Fosfato de Sódio dibásico heptahidratado | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Necessário para atividade de repórter LacZ em X-gal |
| Fosfato de sódio monobásico monohidratado | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Necessário para atividade de repórter LacZ em X-gal |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Para seleção de crescimento de levedura em meio seletivo |
| X-gal (5-Bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase torna-se incolor X-gal azul para detectar interação proteína-DNA |
| Extrato de levedura | US Biologicals | Y2010 | Meio nutritivo para crescimento e propagação de levedura |
| Base de Nitrogênio de Levedura (pó) sem AA, carboidrato e sem AS | US Biologicals | Y2030 | Necessário para o crescimento vigoroso de leveduras |
Referências
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
- Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
