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Artigo de método

Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano

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DOI:

10.3791/59192

⸱

11 de fevereiro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos uma levedura melhorada híbrido-um protocolo para identificar os fatores de transcrição (TFs) que podem ligar a uma região de DNA humana de interesse de triagem. Esse método usa um pipeline de rastreio com throughput alto que pode interrogar a vinculação de > 1.000 TFs em uma única experiência.

Resumo

Identificar os conjuntos de factores de transcrição (TFs) que regulam cada gene humano é uma tarefa difícil que requer a integração de diversas abordagens experimentais e computacionais. Um tal método é o ensaio (Y1H) um híbrido do fermento, em qual dessas interações entre TFs e DNA regiões são testadas no meio do núcleo fermento usando genes repórter. Y1H ensaios envolvem dois componentes: uma 'DNA-isca' (ex.., promotores, melhoradores, silenciadores, etc.) e um 'TF-presas,' que podem ser rastreada para ativação do gene repórter. Mais protocolos publicados para a realização de telas Y1H são baseados em transformar bibliotecas TF-presa ou matrizes em cepas de leveduras de DNA-isca. Aqui, descrevemos um pipeline, chamado Y1H reforçada (eY1H) os ensaios, onde interações TF-DNA são interrogadas por linhagens de DNA-isca com uma coleção de matriz de cepas de TF-presas usando uma matriz de alta densidade de acasalamento plataforma de robótica (HDA) que permite o rastreio em um 1.536 formato de colônia. Isto permite um aumento dramático na taxa de transferência (60 sequências de DNA-isca contra > 1.000 TFs leva duas semanas por pesquisador) e reprodutibilidade. Ilustraremos os diferentes tipos de resultados esperados através do teste de sequências de promotor humano contra uma matriz de 1.086 TFs humano, bem como exemplos de problemas que podem surgir durante as telas e como solucioná-los.

Introdução

Um problema central no campo biomédico é determinar os mecanismos pelo qual cada gene humano é regulamentado. Transcrição é o primeiro passo para controlar os níveis de expressão do gene, e ela é regulada por conjuntos de fatores de transcrição (TFs) que são exclusivos para cada gene. Dado que os seres humanos codificam para > 1.500 TFs1,2, identificando o conjunto completo do TFs que controlam a expressão de cada gene permanece um desafio aberto.

Dois tipos de métodos podem ser usados para mapear interações TF-DNA: TF-centrado e centrada no DNA métodos3 (figura 1A). Em métodos TF-centrado, um TF de interesse é sondada para ligação para regiões de DNA genômicas ou para determinar a sua especificidade de ligação do DNA. Estes métodos incluem imunoprecipitação da cromatina (ChIP) seguida por sequenciamento de alta produtividade, microarrays de ligação da proteína e SELEX4,5,6. Em métodos centrado no DNA, uma sequência de DNA de interesse é analisada para determinar o conjunto de TFs que ligam para a sequência do DNA. A mais amplamente aplicada de tais métodos é fermento um híbrido (Y1H) os ensaios, no quais as interações entre TFs e DNA regiões são testadas no meio do núcleo fermento usando o repórter genes7,8,9.

Y1H ensaios envolvem dois componentes: uma 'DNA-isca' (por exemplo, promotores, melhoradores, silenciadores, etc) e um 'TF-presas,' que podem ser rastreada para repórter gene ativação9,10 (figura 1B). A isca de ADN clonada montante de repórter dois genes (LacZ e HIS3) e ambas as construções do DNA-bait::reporter estão integradas no genoma da levedura para gerar chromatinized 'linhagens de DNA-isca'. A TF-presa, codificada em um plasmídeo que expressa um TF fundido-se ao domínio de ativação (AD) da levedura Gal4 TF, é introduzida a estirpe de DNA-isca para pescar interações TF-DNA. Se o TF-rapina vincula-se à sequência de DNA-isca, o anúncio presente na rapina TF levará para a ativação de ambos os genes repórter. Como resultado, as células com uma interação positiva podem ser selecionadas para o crescimento em placas faltando histidina, bem como a superação de um inibidor competitivo, 3-Amino-1, 2,4-triazole (3-a) e visualizadas como colônias azuis na presença de X-gal. Porque o fermento potente Gal4 AD é usado, os ensaios de Y1H podem detectar interações envolvendo ativadores transcricionais, bem como repressores. Além disso, dado que TF-presas são expressos de um promotor forte de fermento (ADH1), interações podem ser detectadas mesmo para TFs com níveis de baixa expressão endógena, que são um desafio para detectar por ChIP11,12.

Mais protocolos publicados para a realização de ensaios de Y1H são baseados em introduzir as cepas de leveduras DNA-isca TF-presas, transformando-se em pool TF-rapina bibliotecas, seguidas por seleção, colônia escolhendo e sequenciamento para identificar o TF interagindo, ou por transformação individual clones8,9. Estes são protocolos demorados, limitando o número de sequências de DNA que podem ser testados por pesquisador. Uma recente melhoria dos ensaios de Y1H, chamado enhanced Y1H (eY1H), aumentou drasticamente a taxa de transferência de rastreio usando uma plataforma robótica de matriz (HDA) de alta densidade para acasalar cepas de leveduras DNA-isca com uma coleção de cepas de leveduras, cada uma expressando uma diferente TF-rapina10,13 (Figura 1). Estas telas empregam uma 1.536 colônia formato permitindo testar TFs mais humano em quadriplicado usando apenas três pratos. Além disso, dado que as interações TF-DNA são testadas de forma emparelhada, esta abordagem permite comparando interações entre DNA-iscas (como duas variantes de nucleotídeo único não-codificante) e entre diferente TFs ou variantes TF11,12 ,14.

Utilizando ensaios de eY1H, foram delineados os humanos maiores e Caenorhabditis elegans TF centrado no DNA-DNA interações redes até à data. Em particular, nós identificamos 2.230 interações entre 246 potenciadores do desenvolvimento humanos e 283 TFs12. Além disso, nós empregamos eY1H ensaios para descobrir a ligação de TF alterada para 109 variantes não-codificante de nucleotídeo único associados a doenças genéticas como a malformação do desenvolvimento, câncer e doenças neurológicas. Mais recentemente, nós costumávamos eY1H delinear uma rede composta por 21.714 interações entre 2.576 promotores de genes de c. elegans e 366 TFs11. Esta rede foi fundamental para desvendar o papel funcional de dezenas de c. elegans TFs.

Os protocolos para gerar manchas de DNA-isca e avaliar os níveis de atividade de repórter de fundo tem sido relatado em outro lugar15,16,17. Aqui, descrevemos um pipeline de eY1H que pode ser usado para qualquer região de DNA genômico humano contra uma matriz de 1.086 TFs humana de tela. Uma vez que uma estirpe de DNA-isca de levedura é gerada e uma matriz de TF-presa está manchado nas chapas de correspondente, o protocolo inteiro pode ser executado em duas semanas (tabela 1). Mais importante, o protocolo pode ser colocado em paralelo para que um único pesquisador pode tela 60 sequências de DNA-isca simultaneamente. Para demonstrar o protocolo, nós selecionados promotores do cytokine os genes CCL15 e IL17F. Além disso, mostramos resultados de falhadas telas para ilustrar os tipos de problemas que possam surgir durante a execução de ensaios de eY1H e como solucioná-los.

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Protocolo

1. preparações

  1. Placas −H de −U de SC (pratos de Petri 150 mm)
    Nota: Estas placas serão usadas para o cultivo de cepas de leveduras a DNA-isca.
    1. Dissolva a mistura de abandono, base de nitrogênio levedura (YNB), adenina hemisulfate e sulfato de amônio em 920 mL de água e pH para 5.9 com 5 M NaOH (aproximadamente 1 mL por litro de mídia; ver tabela 2 para composição). Despeje em um frasco de 2 L e adicionar uma barra de agitação.
    2. Em um segundo frasco de 2 L, adicione o ágar-ágar para 950 mL de água (não adicione uma barra de agitação como fará com que o ágar a ferver em autoclave).
    3. Autoclave para 40 min 15 psi em um ciclo de líquido.
    4. Imediatamente despeje o conteúdo do frasco primeiro, incluindo a barra de agitação, sobre o agar contendo o balão. Adicionar a glicose, misture bem em uma placa de agitação e esfriar a 55 ° C em banho-maria.
    5. Adicione a leucina e o triptofano para a mídia. Misture bem em um prato Misture e despeje em pratos de Petri estéril de 150 mm (~ 80 mL por prato). Seco por 3 – 5 dias à temperatura ambiente, embrulhe em sacos plásticos e armazenar em temperatura ambiente por até 6 meses.
  2. Placas retangulares de YAPD
    Nota: Estas placas serão usadas para o cultivo do gramado para a cepa de DNA-isca e para acasalamento com a coleção de matriz TF.
    1. Dissolver o pós (ver quadro 3 para composição), com exceção de ágar, em 950 mL de água em um frasco de 2 L e adicionar uma barra de agitação.
    2. Em um segundo frasco de 2 L, adicione o ágar-ágar para 950 mL de água (não adicione uma barra de agitação como fará com que o ágar a ferver em autoclave).
    3. Autoclave para 40 min 15 psi em um ciclo de líquido.
    4. Imediatamente despeje o conteúdo do frasco primeiro, incluindo a barra de agitação, sobre o agar contendo o balão.
    5. Adicionar a glicose, misture bem em uma placa de agitação e legal a 55 ° C. Despeje as placas retangulares de mídia (ver Tabela de materiais; ~ 70 mL por placa) usando uma bomba peristáltica (5 mL/seg.) e um tubo de 6 mm. Seca para 1 dia em temperatura ambiente, embrulhe em sacos plásticos e armazenar no quarto frio por até 6 meses.
      Nota: Embora o volume de mídia sugerida é 70 mL por placa, 50 – 80 mL por placa pode ser usado. As três questões críticas a considerar quando derramando placas são 1) que eles são redistribuídos para que os meios de ágar tem a mesma espessura em toda a placa (usar uma tabela nivelada ou superfície para placa derramar e não despeje em pilhas de mais de sete placas) 2) para garantir a ausência de bolhas no agar mídia (bolhas devem ser exibidas usando uma agulha esterilizada) e 3) as placas de secagem para apenas um dia e envolvendo as placas em sacos de plástico para evitar falhas na fixação de levedura.
  3. −Trp SC e Sc −U −Trp retangulares placas
    Nota: Estas placas serão usadas para a coleção de matriz TF (−Trp Sc) crescente e selecionar levedura diploide após o acasalamento (Sc −U −Trp).
    1. Dissolver a mistura de abandono, YNB, adenina hemisulfate e sulfato de amônio em 920 mL de água e pH para 5.9 com NaOH 5m (cerca de 1 mL por litro de mídia) (ver tabela 4 para composição). Despeje em um frasco de 2 L e adicionar uma barra de agitação.
    2. Em um segundo frasco de 2 L, adicione o ágar-ágar para 950 mL de água (não adicione uma barra de agitação como fará com que o ágar a ferver em autoclave).
    3. Autoclave para 40 min 15 psi em um ciclo de líquido.
    4. Imediatamente despeje o conteúdo do frasco primeiro, incluindo a barra de agitação, sobre o agar contendo o balão. Adicionar a glicose, misture bem em uma placa de agitação e esfriar a 55 ° C.
    5. Adicione a leucina, histidina e uracil (omitir o uracil para as placas de −Trp −U de Sc).
    6. Misture bem em um prato Misture e despeje em placas retangulares (~ 70 mL por placa) usando uma bomba peristáltica (5 mL/seg) e tubulação de 6 mm. Secar por 1 dia em temperatura ambiente, embrulhe as placas em sacos plásticos e armazenar no quarto frio por até 3 meses.
  4. SC −U −H −Trp + 3AT + retangulares placas X-galão
    Nota:     estas placas serão usadas como placas de leitura para ensaios eY1H.
    1. Dissolver a mistura de abandono, YNB, adenina hemisulfate e sulfato de amônio em 850 mL de água (ver tabela 5 para composição). Fazer não pH. Despeje em um frasco de 2 L e adicionar uma barra de agitação.
    2. Em um segundo frasco de 2 L, adicione o ágar a 850 mL de água (não adicione uma barra de agitação como fará com que o ágar a ferver em autoclave).
    3. Autoclave para 40 min 15 psi em um ciclo de líquido.
    4. Prepare-se 10 x sais BU (1L) pela combinação de 900 mL de água, 70 g de Na2HPO4∙7H2O e 34,5 g de NaH2PO4∙H2O. Mix usando uma barra de agitar para dissolver o pó e ajustar o pH a 7,0 usando 5 M de NaOH. Adicione água a 1 L e autoclave.
    5. Prepare a solução de X-galão, adicionando 3,5 g de pó X-galão para um tubo de plástico de 50 mL contendo 42,5 mL de dimetil formamida. Adicionar o pó de X-galão de dimetil Formamida a dissolver mais facilmente (isso leva 30 min). Manter a solução no escuro (tubo opaco 50ml de uso ou cobertura na folha). Loja a-20 ° C.
    6. Imediatamente despeje o conteúdo do frasco primeiro, incluindo a barra de agitação, sobre o agar contendo o balão. Adicionar a glicose e a 10x BU sais (ver tabela 5 para composição), misture bem em uma placa de agitação e esfriar a 55 ° C.
    7. Adicione a leucina, 3AT e X-gal (ver tabela 5 para composição).
    8. Misture bem em um prato Misture e despeje as placas retangulares (~ 70 mL por placa) usando uma bomba peristáltica (5 mL/seg.) e um tubo de 6 mm. Seca para 1 dia em temperatura ambiente, embrulhe em sacos plásticos e armazenar na sala fria, coberta de papel alumínio (3AT e X-gal são sensíveis à luz) até 1 mês.

2. mancha uma matriz TF

  1. Descongelar a matriz TF-presa
    1. Descongele as placas de estoque de glicerol de fermento com a matriz de TF-presa no gelo.
      Nota: TF-rapina matrizes podem ser gerados como publicado anteriormente10,12,13,18.
    2. Ressuspender o fermento utilizando uma pipeta de 12 canais dentro de 1 – 3 min antes da próxima etapa.
  2. Manchando o fermento em Sc −Trp placas retangulares
    1. No robô HDA (ver Tabela de materiais), selecione multi bem 96 placas como fonte, 96 placas de ágar como alvo e almofadas de 96 pino longo.
      Nota: PIN pads não são reutilizáveis e devem ser descartados.
    2. Selecione o programa Replicar muitos para fazer duas cópias por placa de 96 poços. Não use a reciclar ou revisitar as opções para evitar a contaminação de trás das populações de congelados.
    3. Selecione a opção para rodar em cima e para baixo na fonte de misturar o fermento.
    4. Saco da matriz manchada e incubar com agar acima a 30 ° C durante 2 a 3 dias.
  3. Gerando 384 matrizes de colônia em placas retangulares de Sc −Trp
    1. No robô, selecione 96 placas de ágar como fonte, 384 placa de ágar como alvo e 96 almofadas de pino curto.
    2. Selecione o programa matriz 1:4 . Desta forma, placas de quatro 96 colônia (cada um contendo um TF diferente) serão consolidadas na placa uma 384 colônia. Não use a reciclar ou revisitar as opções para evitar a contaminação entre diferentes placas.
    3. Saco as placas e incubar o matriz de 384-colônia malhada-agar para cima a 30 ° C por 2 dias.
  4. Geração de 1.536 matrizes de colônia em placas retangulares de Sc −Trp
    Nota: Isso resultará em matrizes contendo quatro colônias para cada TF-presas.
    1. No robô, selecione 384 placas de ágar como fonte, as placas de 1.536 ágar como alvo e 384 almofadas de pino curto.
    2. Selecione o programa de fonte única de ensaio de 1:4. O objetivo é copiar cada colônia em quatro colônias para obter quadruplicates. Usar a reciclagem e revisitar as opções como envolve copiar quatro vezes cada colônia.
    3. Saco as placas e incubar o matriz de 1536-colônia malhada-agar para cima a 30 ° C durante 3 dias.
  5. Amplificando a matriz de 1.536 colônia em placas retangulares de Sc −Trp
    1. No robô, selecione 1.536 placas de ágar como fonte, 1.536 placas de ágar como alvo e 1.536 almofadas de pino curto.
    2. Selecione o programa Replicar muitos para replicar cópias de 3 – 4. Usar a reciclagem e revisitar a opção, mas jogar fora a almofada, ao alternar para um prato diferente da matriz para evitar a contaminação cruzada.
    3. Saco as placas e incubar o matriz de 1536-colônia malhada-agar para 30 ° C por 3 dias para usar para acasalamento passos (veja abaixo). Depois disso, manter as placas em temperatura ambiente e copiar novamente depois de 7 dias para uma nova rodada de seleção.

3. eY1H tela

  1. Preparando os gramados de estirpe de DNA-isca para acasalamento
    1. Manchar o fermento cepas de DNA-isca em uma placa −H de −U de Sc e crescer por 3 dias a 30 ° C.
    2. Marcam o fermento em uma placa −H de −U Sc usando um palito de dente estéril de 15 cm, para que cada placa se encaixa diferentes cepas de 12 a 16. Incubar um dia a 30 ° C.
    3. Marcam o fermento em uma placa −H de −U Sc usando um palito de dente estéril de 15 cm, para que cada placa se encaixa 4 diferentes cepas. Incubar durante um dia a 30 ° C.
    4. Raspe o fermento usando um palito esterilizado, certificando-se não raspar qualquer agar e adicionar em um tubo 1,5 com 500 µ l de água estéril.
    5. Adicione contas de vidro estéril de 10 – 15 num prato retangular YAPD. Adicionar a suspensão de levedura na chapa e agitar cuidadosamente em todas as direções por 1min garantir que o fermento é espalhado através de toda a placa.
    6. Inverter a placa imediatamente e para que os grânulos de ir para a tampa. Retire e Recicle os grânulos.
    7. Saco as placas e incubar agar para baixo por 1 – 2 dias a 30 ° C. Então prossiga para a etapa de acasalamento.
  2. Acasalamento de levedura DNA-isca e cepas de matriz TF
    1. Transferi a matriz TF para uma chapa retangular de YAPD com o robô. Selecione a placa de 1.536 ágar como origem e destino e a almofada de 1.536 pino curto. Selecione o programa Replicar muitos . Cada placa de matriz TF pode ser usada para transferir para placas YAPD 3-4 (dependendo do número de placas na matriz). As placas de matriz TF usadas para acasalamento devem ser 2-3 dias de idade, mas não mais como acasalamento podem ser ineficiente.
    2. Transferi o gramado de uma estirpe de DNA-isca para as placas YAPD, já que contém a matriz TF com o robô. Selecione a placa de 1.536 ágar como origem e destino e a almofada de 1.536 pino curto. Selecione o programa Replicar muitos . Usar um offset aleatório na fonte com um raio de ~0.6 mm para evitar tomar levedura do mesmo lugar e misture no alvo para facilitar o contacto entre cepas de leveduras. Usar o gramado contendo as cepas de DNA-isca (seção 3.1), como fonte, e as placas YAPD que contém a matriz TF visto no passo 3.2.1 como alvo.
    3. Saco as placas e incubar agar para cima a 30 ° C para 1 dia.
  3. Seleção de levedura diploide
    1. Transferi o fermento acasalado das placas YAPD para chapas de −Trp −U de Sc com o robô. Selecione a placa de 1.536 ágar como origem e destino e a almofada de 1.536 pino curto. Selecione o programa de replicar . Misture na origem e no destino.
    2. Saco as placas e incubar agar para cima a 30 ° C por 2 – 3 dias (incubação mais tempo leva a atividade de repórter de fundo elevado).
  4. Transferir para placas de leitura
    1. Transferi a levedura diploide das placas de −Trp −U de Sc para a leitura placas retangulares Sc −U −H −Trp + 3AT 5mm + 0,4 mM X-galão usando o robô. Selecione as placas de 1.536 ágar como origem e destino e a almofada de 1.536 pino curto. Selecione o programa de replicar .
    2. Saco as placas e incubar agar para cima a 30 ° C por até 7 dias.
  5. Imagens de placas de leitura
    1. Para linhagens de DNA-isca com atividade de repórter de fundo elevado, tire fotos nos dias 2, 3 e 4. Caso contrário, tire fotos, nos dias 4 e 7. Interações positivas são identificadas pelo crescimento e azul cor das colônias fúngicas e podem ser determinadas manualmente, ou pode ser determinado usando software de análise de imagem.

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Resultados

Três fatores principais devem ser considerados ao analisar resultados de ensaios de eY1H: a atividade de repórter de plano de fundo da estirpe DNA-isca, a força da atividade repórter correspondente a interações TF-DNA e o número de colônias positivas. A atividade de repórter de fundo (i.e., autoactivity) da estirpe DNA-isca refere-se ao crescimento global e cor das colônias na placa de leitura, mesmo na ausência de um TF-rapina fermento. Idealmente, as estirpes não-autoactive mostram uma fundo branco ou claro cor marrom,...

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Discussão

A abordagem eY1H robótico acasalamento triagem descrita aqui grandemente aumenta o throughput para identificar o conjunto de TFs que se ligam a uma região de DNA de interesse, em comparação com o anterior rastreio de biblioteca ou triagem matriz abordagens baseadas na transformação. Além disso, as interações de TF-DNA detectadas pelo eY1H ensaios são altamente reprodutíveis como 90% das interações detectadas são positivos para todos os quatro colônias testado por TF, e 90% das interações reteste em uma tela independente ...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health [R35-GM128625 de J.I.F.B.].

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
3-Amino-1,2,4-triazol (3AT) ~95 % TLCSigmaA8056-100GInibidor competitivo para produtos do gene HIS3
Sulfato de adenina (hemissulfato), di-hidratadoUS BiologicalsA0865Necessário para o crescimento adequado da levedura
Ágar Alta Força do Gel - Grau bacteriológicoAmerican InternationalChemical AGHGUPMeios nutritivos para o crescimento da levedura
Sulfato de amônioUS BiologicalsA1450Fonte de nitrogênio em meio de levedura sintética
D+ Glicose AnidraUS BiologicalsG3050Necessário para o crescimento de levedura
Drop-Out Mix menos His, Leu, Tryp e Uracil, rico em adenina sem base de nitrogênio de leveduraUS BiologicalsD9540-02Mídia sintética completa necessária para a borda de crescimento de levedura
Medidor de pH multiparâmetroHanna InstrumentsHI2020-01Para medir o pH de meios
seletivos Palitos de Dente Planos 750 ctDiamantePara estriar leveduras em petrídeos
Contas de VidroWalter Stern100CPara espalhar leveduras ao fazer gramados
Glicerol ≥ 99%Millipore SigmaG9012-1LNecessário para fazer estoques de levedura congelados
L-HistidinaUS BiologicalsH5100Para seleção de crescimento de levedura em meio seletivo
L-LeucinaUS BiologicalsL2020-05Para seleção de crescimento de levedura em meio seletivo
L-TriptofanoSigma T-0254Para seleção de crescimento de levedura em meio seletivo
N, N-DimetilformamidaSigma319937-1LPara fazer solução X-gal
Omnipense EliteWheatonW375030-APara dispensar volumes precisos de mídia em placas Singer
Peptone, BacteriologicalAmerican International ChemicalPEBAUPFonte de proteína necessária para o crescimento de levedura
Placa de Petri, 150 mm x15 mmVWR10753-950Para o cultivo de iscas de levedura para triagem
PlusPlatesSinger InstrumentsPLU-003Para fazer placas de ágar retangulares para usar com a
Incubadora Refrigerada BOD de Baixa Temperatura Singer Robot PrecisionThermoFisher ScientificPR205745RPara incubar placas de levedura a temperatura constante
RePads 1.536 curtosSinger InstrumentsREP-005Para transferir a matriz de presas TF, levedura mate e levedura de transferência para placas de seleção e leitura diplóides
RePads 384 shortSinger InstrumentsREP-004Para transferir matriz TF-prey de 384 para 1.536 formato de colônia
RePads 96 longSinger InstrumentsREP-001Para transferir matriz TF-prey do estoque de glicerol para a placa de ágar
RePads 96 shortSinger InstrumentsREP-002Para transferir TF-prey array de 96 para 384 formato de colônia
Singer HDA RoToR robotSinger InstrumentsPara transferir levedura de maneira de alto rendimento
Hidróxido de Sódio (Pellets/ACS Certificado)FisherS318-1Para ajustar o pH de meios seletivos
Fosfato de Sódio dibásico heptahidratadoSanta Cruz Biotechnologysc-203402CNecessário para atividade de repórter LacZ em X-gal 
Fosfato de sódio monobásico monohidratadoSanta Cruz Biotechnologysc-202342BNecessário para atividade de repórter LacZ em X-gal 
UracilSigmaU0750-100GPara seleção de crescimento de levedura em meio seletivo
X-gal (5-Bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-Dgalactopyranoside)Gold BiotechnologyX4281C100β-galactosidase torna-se incolor X-gal azul para detectar interação proteína-DNA
Extrato de leveduraUS BiologicalsY2010Meio nutritivo para crescimento e propagação de levedura
Base de Nitrogênio de Levedura (pó) sem AA, carboidrato e sem AS US BiologicalsY2030Necessário para o crescimento vigoroso de leveduras

Referências

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  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
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  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
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