Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/59192
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University
* These authors contributed equally

Summary

Hier presenteren we een verbeterde gist één-hybrid screening protocol ter identificatie van de transcriptiefactoren (TFs) die zich aan een menselijke DNA-regio van belang binden kunnen. Deze methode maakt gebruik van een high-throughput screening-pijpleiding die de binding van ondervragen kan > 1000 TFs in een enkele experiment.

Abstract

Het identificeren van de sets van transcriptiefactoren (TFs) die regelen van elk menselijk gen is een enorme taak die vereist integratie van talrijke experimentele en computationele benaderingen. Een dergelijke methode is de gist één-hybride (Y1H) assay, in welke interacties tussen TFs en DNA regio's worden getest in de omgeving van de kern van de gist met behulp van verslaggever genen. Y1H tests omvatten twee componenten: een 'DNA-aas' (b.v.., initiatiefnemers, versterkers, geluiddempers, etc.) en een 'TF-prooi,"die kan worden gescreend voor reporter gene activering. Meest gepubliceerde protocollen voor het uitvoeren van Y1H schermen zijn gebaseerd op het omzetten van TF-prooi bibliotheken of arrays in DNA-aas giststammen. Hier beschrijven we een pijpleiding, verbeterde Y1H genoemd (eY1H) testen, waar TF-DNA interacties zijn ondervraagd door de paring van de DNA-aas stammen met een gekleed verzameling TF-prooi stammen met behulp van een array met hoge dichtheid (HDA) robotic platform waarmee screening in een 1,536 de indeling van de kolonie. Dit zorgt voor een dramatische toename van de doorvoer (60 opeenvolgingen van DNA-aas tegen > 1.000 TFs duurt twee weken per onderzoeker) en reproduceerbaarheid. We illustreren de verschillende soorten van de verwachte resultaten door het testen van sequenties van menselijke promotor tegen een array van 1,086 menselijke TFs, evenals voorbeelden van problemen die zich kunnen voordoen tijdens de schermen en het oplossen van hen.

Introduction

Een centraal probleem op het gebied van biomedische is het bepalen van de mechanismen waarmee elk menselijk gen wordt geregeld. Transcriptie is de eerste stap bij het beheersen van gen expressie niveaus, en het is geregeld door sets van transcriptiefactoren (TFs) die uniek voor elk gen zijn. Gezien het feit dat mensen coderen voor > 1500 TFs1,2, identificatie van de complete set van TFs waarmee de expressie van elk gen blijft een open uitdaging.

Twee soorten methoden kunnen worden gebruikt voor het toewijzen van TF-DNA interacties: TF-gecentreerd en DNA-gecentreerd methode3 (figuur 1A). TF-gecentreerde methoden, is een TF van belang voor de binding aan de genomic DNA regio's of om te bepalen zijn DNA-bindende specificiteit gesondeerd. Deze methoden omvatten chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door sequentiebepaling van high-throughput, eiwit bindende microarrays en SELEX4,5,6. In DNA-gecentreerde methoden, is een opeenvolging van DNA van belang om te bepalen van de set van TFs die zich aan het DNA-sequentie binden gesondeerd. De meest toegepaste van dergelijke methoden is gist één-hybride (Y1H) testen, in welke interacties tussen TFs en DNA regio's worden getest in de omgeving van de kern van de gist met reporter genen7,8,9.

Y1H tests omvatten twee componenten: een 'DNA-aas' (bijv. de initiatiefnemers, versterkers, geluiddempers, etc.) en een 'TF-prooi,"die kan worden gescreend voor reporter gene activering9,10 (figuur 1B). Het DNA-aas wordt gekloond stroomopwaarts van twee reporter genen (LacZ en HIS3) en beide DNA-bait::reporter constructies zijn geïntegreerd in het genoom van de gist voor het genereren van chromatinized 'DNA-aas stammen.' De TF-prooi, gecodeerd in een plasmide die een TF gesmolten tot het domein (AD) van de activering van de gist Gal4 TF uitdrukt, is ingevoerd in de stam van de DNA-aas te vissen voor TF-DNA interacties. Als de TF-prooi aan de opeenvolging van DNA-aas bindt, dan is de advertentie aanwezig in de TF-prooi zal leiden tot de activering van beide genen verslaggever. Dientengevolge, kunnen cellen met een positieve interactie worden geselecteerd voor groei op platen histidine ontbreekt, evenals het overwinnen van een concurrerende inhibitor, 3-Amino-1,2,4-triazool (3-AT), en gevisualiseerd als blauwe kolonies in aanwezigheid van X-gal. Omdat de potente gist Gal4 AD wordt gebruikt, Y1H assays interacties transcriptionele activators evenals repressors kunnen detecteren. Bovendien, gezien het feit dat de TF-prooien worden uitgedrukt van een sterke gist promotor (ADH1), kunnen interacties worden gedetecteerd zelfs voor TFs die lage endogene expressie niveaus, die zijn uitdagend hebben te detecteren door ChIP11,12.

Meest gepubliceerde protocollen voor het uitvoeren van Y1H assays zijn gebaseerd op de invoering van TF-prooien in de DNA-aas giststammen door transformeren gepoolde TF-prooi bibliotheken gevolgd door selectie, kolonie plukken en rangschikken om te identificeren van de interactie TF, of door transformatie van individuele klonen8,9. Dit zijn tijdrovende protocollen, beperking van het aantal DNA-sequenties die kunnen worden getest per onderzoeker. Een recente verbetering van Y1H tests, genaamd versterkt Y1H (eY1H), is sterk toegenomen de screening doorvoer met behulp van een hoge dichtheid matrix (HDA) robotic platform om te paren giststammen DNA-aas met een collectie giststammen elk uiting geven aan een ander TF-prooi10,13 (Figuur 1 c). Deze schermen gebruiken een 1.536 kolonie formaat waardoor voor het testen van de meeste menselijke TFs in viervoud met behulp van slechts drie platen. Verder, gezien het feit dat de TF-DNA interacties worden getest in een paarsgewijze manier, deze aanpak maakt het mogelijk voor het vergelijken van interacties tussen DNA-aas (zoals twee noncoding één nucleotide varianten) en tussen verschillende TFs of TF varianten11,12 ,14.

Met behulp van eY1H assays, hebben we de grootste mens en Caenorhabditis elegans DNA-gecentreerde TF-DNA interacties netwerken tot heden afgebakend. In het bijzonder, hebben we 2,230 interacties tussen 246 menselijke developmental smaakversterkers en 283 TFs12vastgesteld. Verder hebben we gebruikt eY1H testen om te ontdekken van gewijzigde TF binding aan 109 één nucleotide noncoding varianten die zijn gekoppeld aan genetische ziekten zoals ontwikkelingsstoornissen malformatie, kanker en neurologische aandoeningen. Meer recentelijk hebben we gebruikt eY1H om af te bakenen een netwerk bestaande uit 21,714 interacties tussen 2.576 C. elegans gene initiatiefnemers en 366 TFs11. Dit netwerk was behulpzaam om te ontdekken de functionele rol van tientallen C. elegans TFs.

De protocollen voor het genereren van DNA-aas vlekken en evalueren van de niveaus van achtergrond verslaggever activiteit geweest gemeld elders15,16,17. Hier beschrijven we een pijpleiding van de eY1H die kan worden gebruikt om het scherm van een menselijke genomic DNA regio tegen een array van 1,086 menselijke TFs. Zodra een gist stam van de DNA-aas wordt gegenereerd en een TF-prooi-matrix is bevlekt op de overeenkomstige platen, kan het gehele protocol worden uitgevoerd in twee weken (tabel 1). Wat nog belangrijker is, kan het protocol worden heeft zodat een enkele onderzoeker kan scherm 60 opeenvolgingen van DNA-aas gelijktijdig. We gescreend om aan te tonen van het protocol, de initiatiefnemers van de twee genen van cytokine CCL15 en IL17F. Daarnaast tonen we de resultaten van mislukte schermen ter illustratie van de soorten problemen die zich voordoen kunnen bij het uitvoeren van eY1H testen en het oplossen van hen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding

  1. SC −U −H platen (petrischalen 150 mm)
    Opmerking: Deze platen worden gebruikt voor de teelt van de DNA-aas giststammen.
    1. Los van de drop-out mix, gist stikstof base (YNB), adenine hemisulfate en ammoniumsulfaat in 920 mL water en pH tot 5,9 met 5 M NaOH (ongeveer 1 mL per liter media; Zie tabel 2 voor samenstelling). Giet in een erlenmeyer van 2 L en toevoegen van een roer-bar.
    2. In een tweede maatkolf van 2 L, voeg de agar aan 950 mL water (Voeg geen een roer bar als het de agar veroorzaken zal aan de kook in de autoclaaf).
    3. Autoclaaf gedurende 40 minuten op 15 psi op een vloeibare cyclus.
    4. Giet onmiddellijk de inhoud van de eerste kolf, met inbegrip van de bar van de roer, in de kolf met agar. Toevoegen van de glucose, meng goed op een bord roer en afkoelen tot 55 ° C in een waterbad.
    5. De leucine en het tryptofaan toevoegen aan de media. Meng goed op een bord roer en giet in steriele petrischalen 150 mm (~ 80 mL per schotel). 3-5 dagen bij kamertemperatuur, drogen in plastic zakken verpakken en bewaren bij kamertemperatuur voor maximaal 6 maanden.
  2. YAPD rechthoekige platen
    Opmerking: Deze platen worden gebruikt voor de teelt van het gazon voor de DNA-aas-stam en paring met de TF matrix collectie.
    1. Los van de poeders (Zie tabel 3 voor samenstelling), met uitzondering van agar, in 950 mL water in een erlenmeyer van 2 L en voeg een roer-bar.
    2. In een tweede maatkolf van 2 L, voeg de agar aan 950 mL water (Voeg geen een roer bar als het de agar veroorzaken zal aan de kook in de autoclaaf).
    3. Autoclaaf gedurende 40 minuten op 15 psi op een vloeibare cyclus.
    4. Giet onmiddellijk de inhoud van de eerste kolf, met inbegrip van de bar van de roer, in de kolf met agar.
    5. Toevoegen van de glucose, mix goed op een roer plaat en laat afkoelen tot 55 ° C. Giet media in de rechthoekige platen (Zie Tabel of Materials; ~ 70 mL per plaat) gebruik een peristaltische pomp (5 mL/sec) en een 6 mm slang. Droge voor 1 dag bij kamertemperatuur, verpakken in plastic zakken, en op te slaan in de koude kamer voor maximaal 6 maanden.
      Opmerking: Hoewel het voorgestelde media volume 70 mL per plaat is, kan er 50 – 80 mL per plaat worden gebruikt. De drie kritieke kwesties om te overwegen wanneer gieten platen zijn 1) dat ze worden herverdeeld zodat de agarmedia de zelfde dikte in de plaat heeft (gebruik een geëgaliseerd tabel of oppervlak voor plaat gieten en doen niet giet in stapels van meer dan zeven platen) 2) om de afwezigheid van de bubbels in de agar media (bubbels moeten worden uitgeklapt met behulp van een steriele naald), en 3) de platen voor slechts één dag drogen en verpakken van de platen in plastic zakken om te voorkomen dat storingen in het vastzetten van de gist.
  3. SC −Trp en Sc −U −Trp rechthoekige platen
    Opmerking: Deze platen zal worden gebruikt voor de teelt van de TF matrix collectie (Sc −Trp) en selecteer diploïde gist na de paring (Sc −U −Trp).
    1. Los van de drop-out mix, YNB, adenine hemisulfate en ammoniumsulfaat in 920 mL water en pH tot 5,9 met NaOH 5M (ongeveer 1 mL / liter van media) (Zie tabel 4 voor samenstelling). Giet in een erlenmeyer van 2 L en toevoegen van een roer-bar.
    2. In een tweede maatkolf van 2 L, voeg de agar aan 950 mL water (Voeg geen een roer bar als het de agar veroorzaken zal aan de kook in de autoclaaf).
    3. Autoclaaf gedurende 40 minuten op 15 psi op een vloeibare cyclus.
    4. Giet onmiddellijk de inhoud van de eerste kolf, met inbegrip van de bar van de roer, in de kolf met agar. Toevoegen van de glucose, meng goed op een bord roer en afkoelen tot 55 ° C.
    5. Voeg de leucine, histidine, en uracil (weglaten van de uracil voor de Sc −U −Trp platen).
    6. Meng goed op een bord roer en giet in rechthoekige platen (~ 70 mL per plaat) gebruik een peristaltische pomp (5 mL/sec) en 6 mm slang. Voor 1 dag bij kamertemperatuur drogen, wikkel de platen in plastic zakken en opslaan in de koude kamer voor maximaal 3 maanden.
  4. SC −U −H −Trp + 3AT + X-gal rechthoekige platen
    Opmerking:     deze platen worden gebruikt als uitlezing platen voor eY1H testen.
    1. Los van de drop-out mix, YNB, adenine hemisulfate en ammoniumsulfaat in 850 mL water (Zie tabel 5 voor samenstelling). Doen niet de pH. Giet in een erlenmeyer van 2 L en toevoegen van een roer-bar.
    2. In een tweede maatkolf van 2 L, voeg de agar aan 850 mL water (Voeg geen een roer bar als het de agar veroorzaken zal aan de kook in de autoclaaf).
    3. Autoclaaf gedurende 40 minuten op 15 psi op een vloeibare cyclus.
    4. 10 x BU zouten (1L) voor te bereiden door het combineren van 900 mL water, 70 g gekristalliseerd nb2HPO4∙7H2O en 34.5 g NaH2PO4∙H2O. Mix met behulp van een roer bar te ontbinden poeders en breng de pH op 7.0 met 5 M NaOH. Voeg water tot 1 L en autoclaaf te brengen.
    5. Bereid de oplossing van de X-gal door 3.5 g X-gal poeder toe te voegen aan een 50 mL plastic buis waarin 42.5 mL dimethyl formamide. X-gal poeder toevoegen aan dimethyl formamide te ontbinden gemakkelijker (dit duurt 30 min). Stockoplossing houden in het donker (gebruik ondoorzichtige 50 ml tube of dekking in folie). Winkel bij-20 ° C.
    6. Giet onmiddellijk de inhoud van de eerste kolf, met inbegrip van de bar van de roer, in de kolf met agar. Toevoegen van de glucose en de 10 x BU zouten (Zie tabel 5 voor samenstelling), meng goed op een bord roer en afkoelen tot 55 ° C.
    7. Voeg de leucine, 3AT, en X-gal (Zie tabel 5 voor samenstelling).
    8. Meng goed op een bord roer en giet in de rechthoekige platen (~ 70 mL per plaat) gebruik een peristaltische pomp (5 mL/sec) en een 6 mm slang. Droge voor 1 dag bij kamertemperatuur, verpakken in plastic zakken, en op te slaan in de koude kamer, bedekt met aluminiumfolie (3AT en X-gal zijn licht gevoelig) voor maximaal 1 maand.

2. het spotten van een TF-matrix

  1. Ontdooien de TF-prooi-array
    1. Ontdooi de gist glycerol voorraad platen met de TF-prooi-array op ijs.
      Opmerking: TF-prooi matrices kunnen worden gegenereerd als de eerder gepubliceerde10,12,13,18.
    2. Resuspendeer de gist met behulp van een precisiepipet 12-kanaals binnen 1 – 3 minuten voor de volgende stap.
  2. De gist spotten in Sc −Trp rechthoekige platen
    1. In de robot HDA (Zie Tabel of Materials), selecteer multi goed 96 platen als bron, 96 agar platen als doelgroep, en 96 lange pin pads.
      Opmerking: PIN pads zijn niet herbruikbare en moeten worden weggegooid.
    2. Selecteer het Repliceren vele programma twee kopieën per 96-wells-plaat te maken. Gebruik niet de recycle of opnieuw opties om terug verontreiniging van de bevroren voorraden te voorkomen.
    3. Selecteer de optie swirl op en neer in de bron te mengen van de gist.
    4. De gevlekte matrix tas en incubeer agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen.
  3. Genereren van 384 kolonie arrays in Sc −Trp rechthoekige platen
    1. Selecteer in de robot, 96 agar platen als bron, 384 agarplaat als doel en 96 korte pin pads.
    2. Selecteer het programma van 1:4 matrix . Op deze manier zullen de vier 96 kolonie platen (elk met een verschillende TF) worden geconsolideerd in één 384 kolonie plaat. Gebruik niet de recycle of opnieuw opties om verontreiniging tussen verschillende platen te voorkomen.
    3. Tas van de platen en Incubeer de gevlekte 384-kolonie matrix agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 2 dagen.
  4. Genereren van 1.536 kolonie arrays in Sc −Trp rechthoekige platen
    Opmerking: Dit zal resulteren in matrices met vier kolonies voor elke TF-prooi.
    1. Selecteer in de robot, 384 agar platen als bron, de 1.536 agar platen als doel en 384 korte pin pads.
    2. Selecteer het programma van 1:4 assay één bron. Het doel is om elke kolonie in vier kolonies te verkrijgen quadruplicates kopiëren. Gebruik de recycle en opnieuw van opties als het gaat om vier keer elke kolonie kopiëren.
    3. Tas van de platen en Incubeer de gevlekte 1536-kolonie matrix agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 3 dagen.
  5. Frequentiebanden te versterken van de array 1.536 kolonie in Sc −Trp rechthoekige platen
    1. Selecteer in de robot, 1.536 agar platen als bron, 1.536 agar platen als doel en 1.536 korte pin pads.
    2. Selecteer het Repliceren vele programma voor 3-4-kopieën te repliceren. Gebruik de recycle en opnieuw optie, maar gooi de pad wanneer u overschakelt op een ander bord van de matrix te voorkomen van kruisbesmetting.
    3. Tas van de platen en Incubeer de gevlekte 1536-kolonie matrix agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 3 dagen om te gebruiken voor de paring stappen (zie hieronder). Na dat, houden de platen bij kamertemperatuur en kopie weer na 7 dagen voor een nieuwe ronde van screening.

3. eY1H scherm

  1. DNA-aas stam gazons voorbereiden paring
    1. Ter plaatse van de gist stammen van de DNA-aas op een Sc −U −H plaat en groeien gedurende 3 dagen bij 30 ° C.
    2. Strijk de gist in een 15 cm Sc −U −H plaat met een steriel tandenstoker, zodat elke plaat 12 – 16 verschillende stammen past. Incubeer één dag bij 30 ° C.
    3. Strijk de gist in een 15 cm Sc −U −H plaat met een steriel tandenstoker, zodat elke plaat 4 verschillende stammen past. Incubeer gedurende één dag bij 30 ° C.
    4. Schraap de gist met een steriel tandenstoker, ervoor niet schraap eventuele agar en toevoegen in een 1,5 buis met 500 µL van steriel water.
    5. Voeg 10 à 15 steriele glazen bolletjes op een rechthoekig bord van YAPD. Voeg de gist schorsing op het bord en schud grondig in alle richtingen voor 1 min om ervoor te zorgen dat de gist wordt verspreid via alle de plaat.
    6. De plaat onmiddellijk omkeren en tik op zodat de kralen naar het deksel. Verwijderen en recycleren van de kralen.
    7. Tas van de platen en agar-zijde naar beneden Incubeer gedurende 1-2 dagen bij 30 ° C. Ga verder met de paring stap.
  2. Paring van gist DNA-aas en TF matrix stammen
    1. De TF-matrix overbrengen in een YAPD rechthoekige plaat met de robot. Selecteer de 1.536 agarplaat als bron en doel, en de 1.536 korte pin-pad. Selecteer het programma dat Vele repliceren . Elke TF matrix plaat kan overbrengen naar 3-4 YAPD platen (afhankelijk van het aantal platen in de array) worden gebruikt. De TF matrix platen gebruikt voor de paring moeten 2-3 dagen oud maar niet meer als de paring kan inefficiënt.
    2. Het gazon van een DNA-aas stam overbrengen in de platen van de YAPD al met de TF-matrix met de robot. Selecteer de 1.536 agarplaat als bron en doel, en de 1.536 korte pin-pad. Selecteer het programma dat Vele repliceren . Gebruik een willekeurige marge in de bron met een radius van ~0.6 mm om te voorkomen dat het nemen van gist van dezelfde plek, en meng op doel om contact tussen giststammen. Gebruik het gazon met de DNA-aas stammen (punt 3.1) als bron, en de platen van de YAPD met de TF-matrix gespot in stap 3.2.1 als doel.
    3. Tas van de platen en incubeer agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 1 dag.
  3. Selectie van diploïde gist
    1. De erop gist van de platen YAPD overbrengen aan Sc −U −Trp platen met de robot. Selecteer de 1.536 agarplaat als bron en doel, en de 1.536 korte pin-pad. Selecteer het programma repliceren . Meng op bron en op doel.
    2. Tas van de platen en incubeer agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen (langere incubatietijd leidt tot hoge achtergrond verslaggever activiteit).
  4. Overbrengen van uitlezing platen
    1. De diploïde gist van de Sc −U −Trp platen overbrengen naar de uitlezing rechthoekige platen Sc −U −H −Trp + 5mM 3AT + 0,4 mM X-gal met behulp van de robot. Selecteer de 1.536 agar platen als bron en doel, en de 1.536 korte pin-pad. Selecteer het programma repliceren .
    2. Tas van de platen en incubeer agar-kant omhoog bij 30 ° C tot 7 dagen.
  5. Beeldvorming van uitlezing platen
    1. Voor DNA-aas stammen met hoge achtergrond verslaggever activiteit, door foto's te nemen op dagen 2, 3 en 4. Anders, de foto's te nemen op dagen 4 en 7. Positieve interacties door groei en blauwe kleur van de gist kolonies worden geïdentificeerd en kunnen handmatig worden bepaald, of het kan worden bepaald met behulp van de software van de analyse van de afbeelding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Drie belangrijke factoren moeten worden beschouwd wanneer analyseren van resultaten van eY1H assays: de achtergrond verslaggever activiteit van de DNA-aas-stam, de sterkte van de activiteit van de verslaggever overeenkomt met TF-DNA interacties, en het aantal positieve kolonies. De achtergrond verslaggever activiteit (bijvoorbeeld autoactivity) van de DNA-aas stam verwijst naar de algemene groei en kleur van de kolonies van de gist in de uitlezing plaat, zelfs in de afwezigheid van een TF-prooi. Ideaal, niet-autoactive stammen Toon een witte of lichte bruine achtergrondkleur, met kolonies voor positieve interacties wordt groter en blauw. Autoactive DNA-aas stammen Toon gist groei in media ontbreekt histidine en een blauwe kleur in het bijzijn van X-gal voor alle kolonies in het slagperk, die waarschijnlijk gerelateerd is aan de binding van gist transcriptionele activators op de DNA-aas-8. De sterkte van de verslaggever activiteit overeenkomt met de TF-DNA interacties gedetecteerd (dat wil zeggen, de grootte van de kolonie) en de intensiteit van de blauwe hangt af van vele parameters zoals de affiniteit, het niveau van de expressie TF in gist, het aantal sites en afstand tot bindende de gist minimale initiatiefnemers ligt stroomopwaarts van de reporter genen, en de achtergrond verslaggever activiteit van de DNA-aas-stam. Bijvoorbeeld, kan een zwakke kernkracht gemakkelijk kan worden ontdekt in het aas van een lage achtergrond maar moeilijk op te sporen in een autoactive of ongelijke achtergrond aas. Het is ook belangrijk om op te merken dat verslaggever activiteit niveaus in gist doen niet noodzakelijkerwijs correleren met de regelgeving in menselijke cellen, als de structuur van de chromatine, nucleosoom positionering, en afstand effecten verschillen tussen gist en menselijk. Verder interacties in mens dreigen te worden beïnvloed door de binding van andere TFs en cofactoren of kunnen worden gemaskeerd door functioneel redundante TFs8. Ten slotte interacties worden als positief beschouwd in eY1H testen wanneer ten minste twee van de vier kolonies verslaggever expressie boven het niveau van de achtergrond weergeven. Wij hebben echter geconstateerd ~ 90% van de interacties die voortvloeien uit alle vier kolonies die overeenkomt met een TF worden positieve10,12,19.

Ter illustratie van het soort resultaten die kunnen worden verkregen met behulp van eY1H assays gescreend we de promotor regio's (2 kb stroomopwaarts van de sites van de start transcriptie) van de genen CCL15 en IL17F, tegen een array van 1,086 menselijke TFs (Figuur 2). De promotor van de CCL15 is een voorbeeld van een niet-autoactive DNA-aas waar interacties, zelfs zwak zijn, kan gemakkelijk worden aangetroffen (figuur 2A). De promotor van de IL17F is een voorbeeld van een autoactive DNA-aas met ongelijke achtergrond verslaggever activiteit, waar sommige interacties kunnen worden opgespoord, terwijl voor verschillende TFs het is onzeker of de verslaggever activiteit hoger dan achtergrond (figuur 2B).

Problemen die optreden kunnen bij het uitvoeren van eY1H assays

Hoewel de screening eY1H protocol is rechttoe-rechtaan en robuuste, verschillende problemen kunnen optreden tijdens het scherm:

1) kolonies zijn te klein en niet voor overdracht (figuur 3A): Hoewel de verwachting is dat sommige gist uiting van exogene TFs trage groei kan weer gezien het feit dat gist genexpressie kan dysregulated, meestal ~ 95% van de TF-prooi kolonies normale weergeven groei. Als meer dan 10% van de kolonies niet groeien, zijn de meest voorkomende oorzaken problemen met de media of de overdracht van de gist. Suboptimaal groei is vaak gerelateerd aan een van de mediacomponenten activiteit (bijvoorbeeld uracil, histidine of leucine), die kan worden opgelost door het opstellen van nieuwe media met verse stamoplossingen verliezen. Als alternatief kan dit ook worden gerelateerd aan een vastmaken offset buikvliesontsteking kolonie overdracht. In dit geval, Controleer dat de 1.536 pads het midden van de kolonies van de gist in de bron-platen spelden.

2) geen groei van de gist in een gedeelte van de plaat (figuur 3B): deze kwestie is in het algemeen gerelateerd met een storing in de paring stap indien de 1.536 pin pad niet aan contact met de gist in de DNA-aas stam gazon, de TF-matrix, of in de paring plaat. In bijna alle gevallen, is dit te wijten aan de ongelijke agar media niveau tijdens plaat gieten of als gevolg van overmatig drogen van de plaat.

3) geen interacties waargenomen (Figuur 3 c en D): dit probleem is vaak gerelateerd aan beide onbedoelde inactivating mutaties in de genen van de verslaggever, in bepaalde LacZ (Figuur 3 c), of aan de hoge autoactivity die het maskeren van interacties (figuur 3D). voor het oplossen van dit probleem, het is aanbevolen om het scherm van een ander onafhankelijk verkregen stam die overeenkomt met de dezelfde DNA-aas.

4) de plaat presenteert willekeurige blauwe plekken (figuur 3E): dit probleem is vaak gerelateerd aan bacteriële besmetting. Om dit probleem op te lossen, strijk de gist om te verkrijgen van afzonderlijke kolonies en herhaalt u het scherm.

Bovenstaande zijn de meest voorkomende problemen bij het uitvoeren van eY1H testen. Andere moeten problemen, voorbereiding van nieuwe media, bevestigt dat juiste instellingen voor de robot HDA werden gebruikt, en testen van meerdere stammen per DNA-aas zou waarschijnlijk de meeste problemen oplossen.

Figure 1
Figuur 1 : Overzicht van eY1H assay schermen. (A) vergelijking tussen TF-gecentreerd en DNA-gecentreerd methoden voor het identificeren van eiwit-DNA interacties. (B) schema van eY1H tests. Een opeenvolging van DNA van belang (promotor enhancer, demper, etc.) gekloond stroomopwaarts van de HIS3 en LacZ reporter genen is geïntegreerd in het genoom van de gist. De resulterende DNA-aas stam is gedekt door een collectie giststammen herbergen TFs gesmolten aan het Gal4 activering domein (AD). Positieve interacties worden bepaald door de gist de mogelijkheid om te groeien zonder histidine en het overwinnen van concurrerende remmer 3-AT, en blauw in de aanwezigheid van X-gal. (C) pijpleiding voor eY1H schermen. Een gazon van een gist stam van de DNA-aas gekweekt in een YAPD plaat is gedekt in een plaat van de YAPD aan een array van de 1.536 kolonie uiting van TFs gesmolten AD gegroeid op een Sc −Trp plaat. Na een dag wordt de gist overgebracht naar een Sc −U −Trp om te kiezen voor diploïde gist. Na een 2-3 dagen incubatie, wordt de gist overgebracht naar een Sc −U −H −Trp + 3AT + X-gal plaat (uitlezing plaat) te identificeren van eiwit-DNA interacties. Elke interactie is getest in viervoud.  Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Voorbeelden van de eY1H uitlezing platen. (A) interacties voor de promotor van CCL15, een niet-autoactive-aas. Achtergrond verslaggever activiteit voor dit aas is laag (minder groei in de afwezigheid van histidine en afwezigheid van blauwe kleur voor niet-interactie TFs). (B) interacties voor de promotor van IL17F, een autoactive aas. Achtergrond verslaggever activiteit voor dit aas is hoog (wel groei in de afwezigheid van histidine en achtergrond blauwe kleur in de plaat) en ongelijke, maken het uitdagend om te identificeren van eiwit-DNA interacties. Sterk, middellange, en zwakke interacties zijn kwadraat in rood, oranje en geel, respectievelijk. De namen van de HGNC van de interactie TFs worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Problemen in eY1H schermen. (A) TF-prooi array waar meerdere kolonies gefaald om te groeien. (B) uitlezing plaat waar kolonies in de lagere linkerhoek te dragen hebben gefaald. (C) niet-autoactive DNA-aas stam die positieve interacties niet wordt weergegeven. (D) zeer autoactive DNA-aas stam die positieve interacties niet wordt weergegeven. (E) uitlezing plaat weergeven van meerdere blauwe kolonies als gevolg van verontreiniging. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Spotten een TF-matrix
Dag 1 Ter plaatse van gist in Sc-Trp plaat in 96 kolonie formaat (2.1 en 2.2)
Dag 4 Genereren van 384 kolonie TF matrix (2.3)
Dag 6 Genereren van 1.536 kolonie TF matrix (2.4)
Dag 9 Amplify 1.536 kolonie TF matrix (2.5)
DNA-aas stam gazons voorbereiden paring
Dag 6 Ter plaatse van de gist DNA-aas stammen (3.1.1)
Dag 9 Streak gist, 12-16 stammen per plaat (3.1.2)
Dag 10 Streak gist, 4 stammen per plaat (3.1.3)
Dag 11 Bereiden van DNA-aas gazons (3.1.4 en 3.1.5)
Paring van gist DNA-aas en TF matrix stammen
Dag 12 Paring in YAPD platen (3.2)
Selectie van diploïde gist
Dag 13 Selectie van diploïde gist in Sc-U-Trp platen (3.3)
Overbrengen van uitlezing platen
Dag 15 Diploïde gist overbrengen uitlezing platen (3.4)
Beeldvorming van uitlezing platen
17-22 dagen Beeldacquisitie van uitlezing platen afhankelijk van achtergrond (3.5)

Tabel 1: TFF-Array.

REAGENS HOEVEELHEID (voor 2 L)
Drop-out mix synthetische minus histidine, leucine, tryptofaan en uracil, adenine, rijke (2 g) w/o gist stikstof basis 2.6 g
Gist stikstof basis zonder aminozuren en ammoniumsulfaat (YNB) 3.4 g
Adenine hemisulfate (dihydraat) p.a. 160 mg
Ammoniumsulfaat 10 g
Agar 35 g
Glucose (40%, w/v) in water, steriele 100 mL
Leucine (100 mM), steriele gefilterd 16 mL
Tryptofaan (40 mM), steriele gefilterd 16 mL

Tabel 2: Reagens lijst I.

REAGENS HOEVEELHEID (voor 2 L)
Pepton 40 g
Gistextract 20 g
Adenine hemisulfate (dihydraat) p.a. 0.32 g
Glucose (40%, w/v) in water, steriele 100 mL
Agar 35 g

Tabel 3: Reagens lijst II.

REAGENS HOEVEELHEID (voor 2 L)
Drop-out mix synthetische minus histidine, leucine, tryptofaan en uracil, adenine rich (2 g) w/o gist stikstof basis 2.6 g
Gist stikstof basis zonder aminozuren en ammoniumsulfaat (YNB) 3.4 g
Adenine hemisulfate (dihydraat) p.a. 160 mg
Ammoniumsulfaat 10 g
Agar 35 g
Glucose (40%, w/v) in water, steriele 100 mL
Leucine (100 mM), steriele gefilterd 16 mL
Histidine (100 mM), steriele gefilterd 16 mL
Uracil (20 mM), steriele gefilterd (weglaten voor Sc – U – Trp platen) 16 mL

Tabel 4: Reagens lijst III.

REAGENS HOEVEELHEID (voor 2 L)
Drop-out mix synthetische minus histidine, leucine, tryptofaan en uracil, adenine rich (2 g) w/o gist stikstof basis 2.6 g
Gist stikstof basis zonder aminozuren en ammoniumsulfaat (YNB) 3.4 g
Adenine hemisulfate (dihydraat) p.a. 160 mg
Ammoniumsulfaat 10 g
Agar 35 g
Glucose (40%, w/v) in water, steriele 100 mL
10 x BU zouten 200 mL
Leucine (100 mM), steriele gefilterd 16 mL
3AT (2 M), steriele gefilterd 5 mL
X-gal (80 mg/mL) in DMF 4 mL

Tabel 5: Reagens lijst IV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De robotic eY1H paring screening beschreven aanpak hier sterk verhoogt de doorvoer ter identificatie van de set van TFs die zich aan een DNA-regio van belang binden, in vergelijking met vorige bibliotheek screening of gekleed screening benaderingen gebaseerd op transformatie. Verder, de TF-DNA-interacties die zijn gedetecteerd door eY1H testen zeer reproduceerbaar, zijn 90% van interacties genotypes zijn positief voor alle vier kolonies per TF getest, en 90% van interacties opnieuw testen in een onafhankelijke scherm van de dezelfde gist DNA-aas stam10 , 12 , 19. en wat nog belangrijker is, TF-DNA interacties door eY1H gedetecteerd op een 40%-70%-tarief wanneer getest in menselijke verslaggever testen12,20, in primaire menselijke cellen (niet-gepubliceerde resultaten), en C. elegans knockout dieren valideren 11. Dit is een soortgelijke validatie tarief voor die waargenomen voor ChIP-seq gegevens21.

Weliswaar zijn interacties geïdentificeerd door eY1H zeer reproduceerbaar wanneer nacontrole dezelfde gist stam van de DNA-aas, produceert testen van verschillende giststammen voor hetzelfde DNA-aas soms verschillende, hoewel overlappende, sets van TF-DNA interacties. Dit is meestal te wijten aan verschillen in achtergrond verslaggever activiteit tussen stammen. Daarnaast testen van fragmenten van een DNA-sequentie resulteert in de opsporing van meer TF-DNA interacties dan het testen van de volledige reeks, in het bijzonder wanneer overlappende fragmenten worden getest. Dit kan verband houden met de bepaling dat een efficiënter in het identificeren van de interacties die dicht bij de minimale initiatiefnemers van verslaggever en omdat testen overlappende fragmenten vermindert de kans dat een bindende site kan worden geroteerd door gist nucleosomes. Dus, voor kleinschalige projecten, is het raadzaam dat overlappende 0,5 – 1 kb fragmenten van een regelgevend gebied zijn getest en die twee onafhankelijke stammen worden gescreend voor elke reeks DNA-aas8.

Er zijn verschillende kritische stappen in de eY1H screening protocol om te voorkomen dat enkele van de problemen die in Figuur 3. Eerst, hoewel de meeste media ingrediënten stabiele maandenlang (behalve 3AT en X-gal), een gebrek aan goede kolonie groei waarschijnlijk duidt dat ten minste één van de ingrediënten kan activiteit hebben verloren en moet worden vervangen. Ten tweede is het belangrijk om te bereiden de rechthoekige platen zodat de agar wordt herverdeeld en zodat ze niet doen droog voor meer dan een dag om te voorkomen dat de storing in bij het gebruik van het robotachtige platform worden vastgehouden. Tot slot, het is sleutel tot de robotic platform-programma's gebruiken, zoals aangegeven in het protocol (revisit, recycle, mengen, enz.) voor de gist om effectief, gedurende de paring efficiënt te zijn, en om te voorkomen dat kruisverontreiniging tussen gist klonen worden overgedragen.

De voorbeelden die we geselecteerd om te illustreren het gebruik van eY1H schermen komen overeen met de initiatiefnemers van het menselijk gen. Echter, andere regelgevende regio's kunnen ook worden getest met inbegrip van smaakversterkers en dempers. Bijvoorbeeld, zijn wij gewend eY1H assays evalueren TF bindende menselijke developmental versterkers en C. elegans eerste introns12,22. Bovendien, gezien het feit dat in een paarsgewijze wijze interacties getest worden, kunnen eY1H testen worden gebruikt om te vergelijken interacties tussen niet-coderende varianten, en TF codering reeks varianten. Bijvoorbeeld met behulp van eY1H testen die we geïdentificeerd gewijzigd TF binding aan 109 noncoding varianten die is gekoppeld aan verschillende genetische ziekten, en ook de differentiële interacties profielen voor 58 TF missense mutaties12,14. Hoewel dit protocol gericht is op een beoordeling van TF binding aan de menselijke regelgevende gebieden, kunnen DNA regio's van andere diersoorten ook getest worden mits een TF-prooi beschikbaar is of kan worden gegenereerd. Inderdaad, TF-prooi matrices zijn gegenereerd voor C. elegans10, Drosophila melanogaster23, Mus musculus24, Arabidopsis thaliana25,26, en Zea mays 27. dus, met steeds beschikbare middelen, eY1H testen kunnen worden toegepast op aanvullende systemen.

Hoewel eY1H testen instrumentale vast te stellen op het repertoire van TFs die zich aan verschillende regelgevende regio's in menselijke en andere soorten geweest binden, zijn ze niet vrij van voorbehoud8,11,12,19 ,20,25. Een van de beperkingen is dat interacties worden getest in de omgeving van de kern van de gist en, hoewel de DNA-aas zijn chromatinized, de structuur van de chromatine in gist kan niet overeen met de structuur van de chromatine in de soorten waarvan het DNA-aas afkomstig zijn en zal niet reflecteren cell type verschillen waargenomen in vivo. Dus, interacties geïdentificeerd door eY1H tests moeten worden gevalideerd verslaggever of andere functionele testen. Opmerking, wij en anderen hebben gevonden TF-DNA interacties door eY1H gedetecteerd op een 40%-70%-tarief in functionele assays11,,12,,20,23valideren. Een andere beperking van eY1H tests is dat het niet wordt gedetecteerd door interacties voor TFs waarvoor posttranslationele modificaties afwezig in gist om te binden aan DNA, TFs die niet goed in gist gevouwen zijn als gesmolten op de advertentie en TFs die in de matrix ontbreken 8. Daarnaast, in de huidige bestandsindeling, eY1H testen niet gedetecteerd interacties heterodimeric TFs, zoals elke kolonie van de gist in de TF-matrix geeft uiting aan een enkele TF-prooi. Dus zal verdere verbeteringen in de bepaling verhogen de breedte van TFs die kunnen worden getest en uitbreiden van de mogelijkheden van eY1H assays te identificeren roman TF-DNA interacties

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health [R35-GM128625 naar J.I.F.B.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

Tags

Genetica kwestie 144 gist één-hybride Y1H transcriptie factor mens gene verordening DNA eY1H
Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C.… More

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter