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Genetics

Pantallas de un híbrido levadura mejorada para identificar el Factor de transcripción atar a las secuencias de ADN humano

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/59192
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, presentamos una levadura mejorada Detección protocolo para identificar los factores de transcripción (TFs) que se pueden unir a una región de ADN humana de interés de uno híbrido. Este método utiliza una tubería de proyección de alto rendimiento que puede interrogar el atascamiento de > 1.000 TFs en un solo experimento.

Abstract

Identificar los conjuntos de factores de transcripción (TFs) que regulan cada gen humano es una tarea de enormes proporciones que requiere la integración de numerosos enfoques experimentales y computacionales. Un tal método es el ensayo levadura uno híbrido (Y1H), en que las interacciones entre el TFs y ADN regiones se prueban en el entorno del núcleo de levadura usando genes del reportero. Y1H ensayos implican dos componentes: un 'ADN-bait' (por ejemplo., promotores, potenciadores, silenciadores, etc.) y un 'TF-presa,' que puede ser examinado para la activación del gen reportero. Más publicados protocolos para realizar Y1H pantallas se basan en transformar cepas de levadura DNA-cebo TF-presa bibliotecas o arreglos de discos. Aquí, describimos un gasoducto, llamado Y1H mejorada (eY1H) de ensayos, donde las interacciones TF-DNA son interrogadas por el apareamiento de las cepas de ADN-cebo con una colección vestida de TF-presa cepas utilizando una matriz de alta densidad plataforma robótica (HDA) que permite la proyección en un 1.536 formato de la Colonia. Esto permite un aumento dramático en el rendimiento (60 secuencias de ADN-cebo contra > 1.000 TFs tarda dos semanas por el investigador) y reproducibilidad. Ilustran los diferentes tipos de resultados esperados analizando secuencias del promotor humano contra una gran variedad de 1.086 TFs humanas, así como ejemplos de problemas que pueden surgir durante la pantallas y cómo solucionarlos problemas.

Introduction

Un problema central en el campo biomédico es determinar los mecanismos por el que se regula cada gene humano. La transcripción es el primer paso en el control de los niveles de expresión de genes, y es regulado por sistemas de factores de transcripción (TFs) que son únicos a cada gen. Dado que los seres humanos codifican para > 1.500 TFs1,2, identificar el conjunto completo de TFs que controlan la expresión de cada gen sigue siendo un desafío abierto.

Dos tipos de métodos se pueden utilizar para mapear las interacciones TF-DNA: métodos TF-centrado y centrado en la DNA3 (figura 1A). En métodos centrados en el TF, TF de interés es sondeado para atar regiones genómicas de ADN y determinar su especificidad de unión del ADN. Estos métodos incluyen la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), seguida por secuenciación de alto rendimiento, microarrays de la proteína vinculante y SELEX4,5,6. En los métodos centrados en el ADN, una secuencia de ADN de interés es sondada para determinar el conjunto de TFs que se unen a la secuencia de ADN. El más ampliamente aplicado de tales métodos es los ensayos (Y1H) levadura uno híbrido, en que las interacciones entre el TFs y ADN regiones se prueban en el entorno del núcleo de la levadura utilizando reporter genes7,8,9.

Y1H ensayos implican dos componentes: un 'ADN-bait' (por ejemplo, promotores, potenciadores, silenciadores, etc.) y un 'TF-presa,' que puede ser evaluado para reportero gene activación9,10 (figura 1B). El cebo de ADN se clona río arriba del reportero dos genes (LacZ y HIS3) y ambos constructos de ADN-bait::reporter se integración en el genoma de la levadura para generar chromatinized 'cepas de ADN-bait'. TF-presa, codificada en un plásmido que expresa un TF fusionados con el dominio de activación (AD) de la levadura Gal4 TF, se introduce en la cepa de ADN-cebo para pescar las interacciones TF-DNA. Si la TF-presa se une a la secuencia de ADN-bait, el anuncio en la TF-presa dará lugar a la activación de ambos genes del reportero. Como resultado, las células con una interacción positiva pueden seleccionadas para el crecimiento en las placas que carecen de histidina, así como la superación de un inhibidor competitivo, de 3-Amino-1,2,4-triazol (3-AT) y visualizadas como colonias azules en presencia de X-gal. Porque el potente Gal4 de la levadura se utiliza AD, Y1H ensayos pueden detectar interacciones con activadores transcripcionales como represores. Además, dado que TF-presas se expresan de un promotor fuerte levadura (ADH1), las interacciones pueden ser detectadas incluso para TFs que tienen niveles de baja expresión endógena, que son difíciles de detectar por ChIP11,12.

Más publicados protocolos para la realización de ensayos de Y1H se basan en introducir TF-presas en el cebo de ADN de levaduras transformando agrupadas bibliotecas TF-presa seguidas por la selección, Colonia selección y secuenciación para identificar la interacción TF, o por transformación de los clones de8,9. Estos son protocolos de tiempo, limitando el número de secuencias de ADN que puede ser probado por el investigador. Una reciente mejora de Y1H ensayos, llamado enhanced Y1H (eY1H), ha aumentado espectacularmente el rendimiento del cribado mediante el uso de una plataforma robótica de alta densidad matriz (HDA) para cepas de levadura DNA-cebo con una colección de cepas de levadura cada uno expresando diferentes TF-presa10,13 (figura 1). Estas pantallas emplean un formato 1.536 Colonia que permite probar TFs más humanas por cuadruplicado, usando solamente tres platos. Además, dado que las interacciones de la TF-ADN se prueban en forma pares, este enfoque permite comparar las interacciones entre DNA-cebos (como dos variantes de los nucleótidos) y entre diferentes TFs o TF variantes11,12 ,14.

Usando análisis de eY1H, hemos delineado el humano más grande y elegans de Caenorhabditis TF centrada en el ADN-ADN interacciones redes hasta la fecha. En particular, hemos identificado 2.230 interacciones entre 246 potenciadores del desarrollo humanos y de TFs 28312. Además, hemos empleado eY1H ensayos para descubrir la alteración Unión TF 109 variantes de cubierta un solo nucleótido asociados con enfermedades genéticas tales como malformación del desarrollo, cáncer y trastornos neurológicos. Más recientemente, utilizamos eY1H para delinear una red compuesta por 21.714 interacciones entre 2.576 promotores de genes de C. elegans y 366 TFs11. Esta red fue clave para descubrir el papel funcional de docenas de TFs de C. elegans .

Los protocolos para generar manchas de ADN-bait y evaluar los niveles de actividad de reportero de fondo han sido divulgado a otra parte15,16,17. Aquí, describimos un gasoducto eY1H que puede utilizarse para cualquier región de ADN genómico humano contra una amplia gama de 1.086 TFs humanas. Una vez que se genera una levadura cepa de ADN-cebo y una matriz de TF-presa es descubierta en las placas correspondientes, el conjunto del Protocolo puede realizarse en dos semanas (cuadro 1). Lo más importante, el protocolo puede ser paralela para que un investigador solo puede pantalla 60 secuencias de ADN-cebo. Para demostrar el protocolo, defendimos a los promotores de los dos genes de citoquinas CCL15 y IL17F. Además, mostramos resultados de fallido pantallas para ilustrar los tipos de problemas que pueden surgir al realizar ensayos de eY1H y cómo solucionarlos problemas.

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Protocol

1. preparaciones

  1. Placas SC −U −H (platos de Petri de 150 mm)
    Nota: Estas placas se utilizarán para el cultivo de las cepas de levadura DNA-cebo.
    1. Disolver la mezcla de abandono, levadura nitrógeno base (YNB), hemisulfate adenina y sulfato de amonio en 920 mL de agua y pH de 5.9 con 5 M NaOH (aproximadamente 1 mL por litro de media; ver tabla 2 para la composición). Vierte en un matraz de 2 L y añada una barra de agitación.
    2. En un segundo matraz de 2 L, añadir el agar a 950 mL de agua (no agregar una barra de agitación ya que producirá el agar a hervir en el autoclave).
    3. Autoclave durante 40 min a 15 psi en un ciclo líquido.
    4. Inmediatamente Vierta el contenido del primer matraz, incluyendo la barra de agitación, en el agar que contiene el frasco. Agregar la glucosa, mezclar bien en un plato de agitar y enfríe a 55 ° C en un baño de agua.
    5. Añadir la leucina y el triptófano a los medios de comunicación. Mezclar bien en un plato de agitar y verter en los platos de Petri estériles de 150 mm (~ 80 mL por plato). Seco de 3 a 5 días a temperatura ambiente, envolver en bolsas de plástico y almacenar a temperatura ambiente hasta 6 meses.
  2. Placas rectangulares de YAPD
    Nota: Estas placas se utilizarán para el cultivo del césped para la cepa de ADN-cebo y para acoplarse con la colección de la matriz TF.
    1. Disolver los polvos (ver tabla 3 para la composición), excepto el agar, en 950 mL de agua en un matraz de 2 L y añadir una barra de agitación.
    2. En un segundo matraz de 2 L, añadir el agar a 950 mL de agua (no agregar una barra de agitación ya que producirá el agar a hervir en el autoclave).
    3. Autoclave durante 40 min a 15 psi en un ciclo líquido.
    4. Inmediatamente Vierta el contenido del primer matraz, incluyendo la barra de agitación, en el agar que contiene el frasco.
    5. Agregar la glucosa, mezclar bien en un plato de agitar y enfríe a 55 ° C. Vierta los medios de comunicación en las placas rectangulares (ver Tabla de materiales; ~ 70 mL por placa) mediante una bomba peristáltica (5 mL/seg) y un tubo de 6 mm. Seco de 1 día a temperatura ambiente, envolver en bolsas de plástico y almacenar en el cuarto frío por hasta 6 meses.
      Nota: Aunque el volumen de los medios sugeridos es 70 mL por placa, puede utilizarse 50 – 80 mL por placa. Los tres temas críticos a considerar cuando las placas de colada son 1) que son nivelados para que los medios de agar tienen el mismo espesor en toda la placa (uso una mesa nivelada o superficie para verter la placa y no vierta en pilas de más de siete placas) 2) para asegurar la ausencia de burbujas en el agar media (burbujas deben hacer estallar usando una aguja estéril) y 3) las placas de sequía durante sólo un día y envolviendo las placas en bolsas de plástico para evitar fallos en la fijación de levadura.
  3. −Trp SC y Sc −U −Trp placas rectangulares
    Nota: Estas placas se utilizará para el crecimiento de la colección de la matriz TF (Sc −Trp) y seleccionar levadura diploide después de aparearse (Sc −U −Trp).
    1. Disolver la mezcla de abandono YNB, hemisulfate adenina y sulfato de amonio en 920 mL de agua y pH de 5.9 con NaOH 5M (aproximadamente 1 mL por litro de media) (ver tabla 4 para la composición). Vierte en un matraz de 2 L y añada una barra de agitación.
    2. En un segundo matraz de 2 L, añadir el agar a 950 mL de agua (no agregar una barra de agitación ya que producirá el agar a hervir en el autoclave).
    3. Autoclave durante 40 min a 15 psi en un ciclo líquido.
    4. Inmediatamente Vierta el contenido del primer matraz, incluyendo la barra de agitación, en el agar que contiene el frasco. Agregar la glucosa, mezclar bien en un plato de agitar y enfríe a 55 ° C.
    5. Añadir la leucina, histidina y uracilo (omitir el uracilo para las placas de −Trp Sc −U).
    6. Mezclar bien en un plato de agitar y verter en placas rectangulares (~ 70 mL por placa) mediante una bomba peristáltica (5 mL/seg) y tubo de 6 mm. Secar por 1 día a temperatura ambiente, envuelva las placas en bolsas de plástico y almacenar en el cuarto frío por hasta 3 meses.
  4. SC −U −H −Trp 3Por + placas rectangulares X-gal
    Nota:     estas placas se utilizará como placas de lectura para los ensayos de eY1H.
    1. Disolver la mezcla de abandono YNB, hemisulfate adenina y sulfato de amonio en 850 mL de agua (véase la tabla 5 para la composición). No no pH. Vierte en un matraz de 2 L y añada una barra de agitación.
    2. En un segundo matraz de 2 L, añadir el agar a 850 mL de agua (no agregar una barra de agitación ya que producirá el agar a hervir en el autoclave).
    3. Autoclave durante 40 min a 15 psi en un ciclo líquido.
    4. Preparar 10 x sales BU (1L) mediante la combinación de 900 mL de agua, 70 g de Na2HPO4∙7H2O y 34,5 g de NaH2PO4∙H2O. mezcla utilizando una barra de agitación para disolver polvos y ajustar el pH a 7.0 con NaOH M 5. Añadir agua para llevar a 1 L y autoclave.
    5. Preparar la solución de X-gal agregando 3,5 g de polvo de X-gal a un tubo de plástico de 50 mL que contiene 42,5 mL de formamida dimethyl. Añadir polvo de X-gal a dimetil formamida para disolver más fácilmente (esto tarda 30 min). Mantener la solución en la oscuridad (uso opaco 50 ml tubo o cubierta en papel de aluminio). Almacenar a-20 ° C.
    6. Inmediatamente Vierta el contenido del primer matraz, incluyendo la barra de agitación, en el agar que contiene el frasco. Agregar la glucosa y el 10 x BU sales (véase la tabla 5 para la composición), mezclar bien en un plato de agitar y enfríe a 55 ° C.
    7. Añadir la leucina, 3AT y X-gal (véase la tabla 5 para la composición).
    8. Mezclar bien en un plato de agitar y verter en las placas rectangulares (~ 70 mL por placa) mediante una bomba peristáltica (5 mL/seg) y un tubo de 6 mm. Seco de 1 día a temperatura ambiente, envolver en bolsas de plástico y almacenar en el cuarto frío cubierto de papel de aluminio (3Por y X-gal son sensibles a la luz) durante 1 mes.

2. observación de una variedad TF

  1. Descongelar la matriz TF-presa
    1. Descongelar la chapa levadura glicerol con la gama TF-presa sobre el hielo.
      Nota: TF-presa matrices pueden generarse previamente publicados10,12,13,18.
    2. Suspender la levadura con una pipeta 12 canales dentro de 1 a 3 minutos antes del siguiente paso.
  2. Manchar la levadura en −Trp Sc placas rectangulares
    1. En el robot de HDA (véase Tabla de materiales), seleccione múltiples bien 96 placas como fuente, 96 placas de agar como blanco y cojines pin largo 96.
      Nota: PIN pads no son reutilizables y deben ser desechados.
    2. Seleccione el programa Replicar muchas para hacer dos copias por placa de 96 pocillos. No utilice el reciclaje o revisar opciones para evitar la posterior contaminación de las reservas congeladas.
    3. Seleccione la opción de remolino hacia arriba y hacia abajo en la fuente para mezclar la levadura.
    4. La bolsa la matriz manchada e Incube agar hacia arriba a 30 ° C durante 2-3 días.
  3. Generación de matrices de Colonia 384 en placas rectangulares de Sc −Trp
    1. En el robot, seleccione 96 placas de agar como fuente, placa de agar 384 como destino y 96 pastillas pasador corto.
    2. Seleccione el programa de la matriz 1:4 . De esta manera, placas cuatro 96 Colonia (cada uno con un TF diferentes) se consolidará en la placa de una 384 Colonia. No utilice el reciclaje o revisar opciones para evitar la contaminación entre diferentes placas.
    3. La bolsa de las placas e incubar el agar manchado matriz 384-Colonia-hacia arriba a 30 ° C durante 2 días.
  4. Generar matrices de Colonia 1.536 en placas rectangulares de Sc −Trp
    Nota: Esto resultará en arreglos de discos que contiene cuatro colonias para cada presa de TF.
    1. En el robot, seleccione 384 placas de agar como fuente, las placas de 1.536 agar como blanco y cojines pasador corto 384.
    2. Seleccione el programa de fuente de análisis de 1:4. El objetivo es copiar cada colonia en cuatro colonias para obtener quadruplicates. Utilizar el reciclaje y revisar opciones de como se trata de copiar cuatro veces cada colonia.
    3. La bolsa de las placas e incubar el agar manchado matriz 1536-Colonia-hacia arriba a 30 ° C durante 3 días.
  5. Amplificando la matriz 1.536 Colonia en placas rectangulares de Sc −Trp
    1. En el robot, seleccione 1.536 placas de agar como fuente, 1.536 placas de agar como destino y 1.536 cojines pasador corto.
    2. Seleccione el programa Replicar muchas replicar copias de 3 – 4. Utilizar el reciclaje y revisar opción pero lanzar la almohadilla cuando se cambia a un plato diferente de la matriz para evitar la contaminación cruzada.
    3. La bolsa de las placas e incubar el agar manchado matriz 1536-Colonia-hacia arriba a 30 ° C durante 3 días para apareamiento pasos (véase abajo). Después de eso, mantener las placas a temperatura ambiente y copia otra vez después de 7 días para una nueva ronda de cribado.

3. eY1H pantalla

  1. Preparación de céspedes de cepa de ADN-cebo para el apareamiento
    1. Spot la levadura cepas de ADN-cebo en una placa de Sc −U −H y crecer durante 3 días a 30 ° C.
    2. Raya la levadura en una 15 cm Sc −U −H la placa con un palillo de dientes estéril, para que cada plato adapta a diferentes cepas de 12 – 16. Incubar un día a 30 ° C.
    3. Raya la levadura en una 15 cm Sc −U −H la placa con un palillo de dientes estéril, para que cada plato ajusta a 4 diferentes cepas. Incubar durante un día a 30 ° C.
    4. Raspar la levadura usando un palillo de dientes estéril, asegurándose de no raspar cualquier agar y añadir en un tubo de 1,5 con 500 μl de agua estéril.
    5. Agregar perlas de vidrio estériles de 10 – 15 en una placa rectangular de YAPD. Añadir la suspensión de levadura sobre la placa y agitar bien en todas las direcciones durante 1 min para que la levadura se propaga a través de la placa.
    6. Invertir la placa inmediatamente y aprovechar para que los granos van a la tapa. Eliminar y reciclar los granos.
    7. Bolsa de las placas e incubar agar hacia abajo durante 1 – 2 días a 30 ° C. Luego proceder a la etapa de apareamiento.
  2. Apareamiento de levadura DNA-bait y cepas de variedad TF
    1. Transferencia de la matriz TF a una placa rectangular de YAPD con el robot. Seleccione la placa de 1.536 agar como fuente y destino y la almohadilla de 1.536 pasador corto. Seleccione el programa Replicar muchas . Cada placa de matriz TF puede utilizarse para transferir a las placas YAPD de 3 a 4 (dependiendo del número de placas en la matriz). Las placas de matriz TF utilizadas para el apareamiento deben ser 2 o 3 días pero no más como apareamiento pueden ser ineficiente.
    2. Transferir el césped de una cepa de ADN-cebo a las placas YAPD ya que contiene la matriz TF con el robot. Seleccione la placa de 1.536 agar como fuente y destino y la almohadilla de 1.536 pasador corto. Seleccione el programa Replicar muchas . Utilizar un desplazamiento aleatorio en la fuente con un radio de ~0.6 m para evitar tomar levadura desde el mismo lugar y mezclar en el objetivo de facilitar el contacto entre las cepas de levadura. Utilizar el césped que contienen las cepas de ADN-cebo (sección 3.1) como fuente y las placas YAPD que contiene la matriz TF en paso 3.2.1 como destino.
    3. La bolsa de las placas e Incube agar hacia arriba a 30 ° C por 1 día.
  3. Selección de la levadura diploide
    1. Transferir la levadura acoplada de las placas YAPD placas de −Trp Sc −U con el robot. Seleccione la placa de 1.536 agar como fuente y destino y la almohadilla de 1.536 pasador corto. Seleccione el programa de replicar . Mezclar en origen y en destino.
    2. La bolsa de las placas e Incube agar hacia arriba a 30 ° C durante 2-3 días (incubación más largo conduce a actividad de reportero de fondo alta).
  4. Transferencia a las placas de la lectura
    1. Transferir la levadura diploide de las placas de −Trp Sc −U lectura placas rectangulares Sc −U −H −Trp + 5mM 3AT + 0,4 mM X-gal con el robot. Seleccione las placas de 1.536 agar como fuente y destino y la almohadilla de 1.536 pasador corto. Seleccione el programa de replicar .
    2. La bolsa de las placas e Incube agar hacia arriba a 30 ° C hasta por 7 días.
  5. Proyección de imagen de las placas de la lectura
    1. ADN-cebo de cepas con actividad de reportero de fondo alta, tomar fotos en los días 2, 3 y 4. De lo contrario, tomar fotos a los 4 y 7 días. Interacciones positivas se identifican por el color azul y el crecimiento de las colonias de levaduras y se pueden determinar manualmente, o puede ser determinado mediante software de análisis de imagen.

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Representative Results

Tres factores deben considerarse al analizar resultados de pruebas de eY1H: la actividad de reportero de fondo de la cepa de ADN-bait, la fuerza de la actividad de periodista correspondiente a las interacciones TF-DNA y el número de colonias positivas. La actividad del reportero de fondo (es decir, autoactivity) de la cepa de ADN-cebo se refiere al crecimiento y al color de las colonias de levaduras en la placa de la lectura, incluso en la ausencia de un TF-presa general. Lo ideal sería no autoactive cepas muestran un fondo blanco o ligero color marrón, con colonias para las interacciones positivas siendo más grande y azul. Autoactive ADN-cebo cepas muestran crecimiento de levadura en medios que carecen de histidina y un color azul en presencia de X-gal para todas las colonias en la placa, que probablemente se relaciona con la Unión de activadores transcripcionales de levadura a la DNA-bait8. La fuerza de la actividad de periodista correspondiente a las interacciones de TF-ADN detectadas (es decir, el tamaño de la Colonia) y la intensidad de azul depende de muchos parámetros tales como la afinidad, el nivel de expresión de la TF en la levadura, el número de enlace sitios y distancia a la los promotores de levadura mínimo situados aguas arriba de los genes del reportero y la actividad de reportero de fondo de la cepa de ADN-cebo. Por ejemplo, una interacción débil puede ser fácilmente detectada en un cebo de bajo fondo, pero puede ser difícil de detectar en un autoactive o cebo de fondo irregular. También es importante tener en cuenta esa actividad de reportero niveles de levadura no necesariamente se correlacionan con la actividad reguladora en las células humanas, como la estructura de la cromatina, nucleosoma, posicionamiento, y efectos de distancia son diferentes entre levadura y humano. Además, las interacciones en humanos están probables ser influenciado por el atascamiento de TFs y cofactores o pueden ser enmascaradas por funcionalmente redundante TFs8. Finalmente, las interacciones se consideran positivas en los ensayos de eY1H cuando al menos dos de las cuatro colonias muestran expresión de periodista por encima de los niveles de fondo. Sin embargo, hemos observado que el ~ 90% de las interacciones identificadas resultado de todas las cuatro colonias correspondientes a un TF siendo positivo10,12,19.

Para ilustrar el tipo de resultados que pueden obtenerse mediante ensayos eY1H defendimos las regiones promotoras (2 kb aguas arriba de los sitios de inicio de transcripción) de los genes CCL15 y IL17F, contra una gran variedad de 1.086 TFs humanas (figura 2). El promotor CCL15 es un ejemplo de un ADN-cebo no autoactive donde incluso las interacciones, los débiles, puede ser fácilmente detectado (figura 2A). El promotor de IL17F es un ejemplo de un autoactive ADN-cebo con actividad de reportero de fondo irregular, donde algunas interacciones pueden ser detectados mientras que para varios TFs es incierto si la actividad del periodista es más alta que el fondo (figura 2B).

Problemas que se encuentran cuando se realizan ensayos de eY1H

Aunque la proyección eY1H protocolo es sencilla y robusta, se encuentran varios problemas en la pantalla:

1) colonias son demasiado pequeñas y no a la transferencia (Figura 3A): aunque se espera que algunas levaduras expresando TFs exógenos pueden mostrar crecimiento lento dado que la expresión de genes de la levadura puede ser existen, típicamente ~ 95% de las colonias TF-presa pantalla normal crecimiento. Si más del 10% de las colonias no crecen, las causas más frecuentes son problemas con los medios de comunicación o la transferencia de la levadura. Crecimiento subóptimo con frecuencia está relacionado con uno de los componentes de los medios de comunicación perdiendo actividad (por ejemplo, uracil, histidina y leucina), que puede resolverse mediante la elaboración de medios frescos con nuevas soluciones. Alternativamente, esto puede también estar relacionado con un desplazamiento de la fijación que afecta la transferencia de la Colonia. En este caso, verifique que los 1.536 cojines pin el centro de las colonias de levaduras en las placas de la fuente.

2) no hay crecimiento de la levadura en una porción de la placa (figura 3B): este problema generalmente está relacionado con una falla en el paso correspondiente si el datáfono 1.536 no hace contacto con la levadura en el césped de cepa de ADN-bait, la gama TF, o en la placa de acoplamiento. En casi todos los casos, esto es debido al nivel de los medios de agar desigual durante la colada de la placa o debido a la excesiva sequedad de la placa.

3) no hay interacciones detectaron (figura 3 y D): este tema a menudo está relacionado con cualquiera de los dos mutaciones que hacen inactivo involuntarias en los genes del reportero, en particular LacZ (figura 3), o a alta autoactivity que las interacciones (figura de la máscara 3D). para solucionar este problema, se recomienda a la pantalla otra cepa independientemente obtenido correspondientes al mismo ADN-cebo.

4) la placa presenta manchas al azar (figura 3E): este tema está a menudo relacionada con contaminación bacteriana. Para resolver este problema, la levadura para obtener colonias individuales de la raya y repetir la pantalla.

Los anteriores son los problemas más frecuentes encontrados al realizar ensayos de eY1H. Otros problemas surgiera, preparando nuevos medios de comunicación, confirmando que se utilizaron los ajustes apropiados para el robot HDA, y pruebas múltiples cepas por cebo ADN probablemente resolvería problemas más.

Figure 1
Figura 1 : Esquema de las pantallas de análisis eY1H. (A) comparación entre métodos TF-centrado y centrado en el ADN para identificar las interacciones DNA proteína. (B) esquemas de ensayos de eY1H. Una secuencia de ADN de interés (promotor enhancer, silenciador, etc.) clonado aguas arriba de la reportera HIS3 y LacZ genes se integra en el genoma de la levadura. La tensión resultante de ADN-cebo está acoplada a una colección de cepas de levadura que TFs fusionados con el dominio de activación de Gal4 (AD). Interacciones positivas están determinadas por la capacidad de la levadura para crecer sin histidina y la superación de inhibidor competitivo 3-AT y azul en presencia de X-gal. (C) la tubería para las pantallas de eY1H. Un césped de una levadura cebo ADN cepa en una placa YAPD está acoplado en una placa YAPD en una matriz de 1.536 Colonia expresando TFs fundidos a AD en una placa de −Trp de Sc. Después de un día, la levadura se transfiere a un Sc −U −Trp seleccionar para levadura diploide. Después de una incubación de 2 – 3 días, la levadura se transfiere a una Sc −U −H −Trp, 3AT + X-gal (placa de lectura) para identificar las interacciones DNA proteína. Cada interacción es probado por cuadruplicado.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Ejemplos de placas de lectura de eY1H. (A) las interacciones con el promotor de CCL15, un cebo no autoactive. Actividad de reportero de fondo para este señuelo es baja (reducido crecimiento en ausencia de histidina y ausencia de color azul para TFs no-que obran recíprocamente). (B) las interacciones con el promotor de IL17F, un cebo autoactive. Actividad de reportero de fondo para este señuelo es alta (crecimiento en ausencia de la histidina y el fondo azul del color a lo largo de la placa) y desigual, lo que es difícil para identificar las interacciones DNA proteína. Fuerte, medio y las interacciones débiles son cuadrados en rojo, naranja y amarillo, respectivamente. Se muestran los nombres HGNC de TFs interactuante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Problemas en las pantallas de eY1H. (A) TF-presa array donde varias colonias no pudo crecer. (B) lectura de la placa donde las colonias en la esquina inferior izquierda no han podido transferir. (C) tensión no autoactive ADN-bait que no muestra las interacciones positivas. (D) altamente autoactive cebo ADN cepa que no se muestra las interacciones positivas. (E) placa de lectura mostrando múltiples colonias azules debido a la contaminación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Observar una variedad TF
Día 1 Punto de levaduras en placa de Sc-Trp en formato de 96 Colonia (2.1 y 2.2)
Día 4 Generar matriz TF de 384 Colonia (2.3)
Día 6 Generar matriz TF Colonia 1.536 (2.4)
Día 9 Ampliar la matriz TF Colonia 1.536 (2.5)
Preparación de céspedes de cepa de ADN-cebo para el apareamiento
Día 6 Spot la levadura cepas de ADN-cebo (3.1.1)
Día 9 Levadura de racha, 12-16 cepas por placa (3.1.2)
Día 10 Levadura de la raya, 4 cepas por placa (3.1.3)
Día 11 Preparar cebo ADN Céspedes (3.1.4 y 3.1.5)
Apareamiento de levadura DNA-bait y cepas de variedad TF
Día 12 Apareamiento en las placas de YAPD (3.2)
Selección de la levadura diploide
Día 13 Selección de levaduras diploides en las placas Sc – U – Trp (3.3)
Transferencia a las placas de la lectura
Día 15 Transferencia de levadura diploide a placas de lectura (3.4)
Proyección de imagen de las placas de la lectura
Días 17-22 Adquisición de imágenes de placas de lectura dependiendo del fondo (3.5)

Tabla 1: Matriz TFF.

REACTIVO DE CANTIDAD (para 2 L)
Salida mezcla sintético menos histidina, leucina, triptófano y uracilo, adenina, ricos (2 g) sin nitrógeno de levadura base 2,6 g
Nitrógeno de la levadura base sin los aminoácidos y sin sulfato de amonio (YNB) 3,4 g
Dihidrato de hemisulfate de adenina 160 mg
Sulfato de amonio 10 g
Agar 35 g
Glucosa (40%, p/v) en agua estéril 100 mL
Leucina (100 mM), estéril filtrada 16 mL
Triptófano (40 mM), estéril filtrada 16 mL

Tabla 2: Reactivo de la lista I.

REACTIVO DE CANTIDAD (para 2 L)
Peptona de 40 g
Extracto de levadura 20 g
Dihidrato de hemisulfate de adenina 0,32 g
Glucosa (40%, p/v) en agua estéril 100 mL
Agar 35 g

Tabla 3: Lista de reactivos II.

REACTIVO DE CANTIDAD (para 2 L)
Salida de la mezcla sintético menos histidina, leucina, triptófano y uracil, ricas en adenina (2 g) sin nitrógeno de levadura base 2,6 g
Nitrógeno de la levadura base sin los aminoácidos y sin sulfato de amonio (YNB) 3,4 g
Dihidrato de hemisulfate de adenina 160 mg
Sulfato de amonio 10 g
Agar 35 g
Glucosa (40%, p/v) en agua estéril 100 mL
Leucina (100 mM), estéril filtrada 16 mL
Histidina (100 mM), estéril filtrada 16 mL
Uracilo (20 mM), estéril filtrada (omitir para las placas – Trp – U Sc) 16 mL

Tabla 4: Lista de reactivos III.

REACTIVO DE CANTIDAD (para 2 L)
Salida de la mezcla sintético menos histidina, leucina, triptófano y uracil, ricas en adenina (2 g) sin nitrógeno de levadura base 2,6 g
Nitrógeno de la levadura base sin los aminoácidos y sin sulfato de amonio (YNB) 3,4 g
Dihidrato de hemisulfate de adenina 160 mg
Sulfato de amonio 10 g
Agar 35 g
Glucosa (40%, p/v) en agua estéril 100 mL
10 x BU sales 200 mL
Leucina (100 mM), estéril filtrada 16 mL
3Por (2 M), filtrado estéril 5 mL
X-gal (80 mg/mL) en DMF 4 mL

Tabla 5: Lista de reactivos IV.

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Discussion

Robótica eY1H acoplamiento proyección lo descrito aquí enormemente aumenta el rendimiento para identificar el conjunto de TFs que se unen a una región de ADN de interés, en comparación con la anterior proyección de biblioteca o proyección vestida enfoques basados en transformación. Además, las interacciones de la TF-DNA detectadas por eY1H ensayos son altamente reproducibles como el 90% de las interacciones detectadas positivas para todas las cuatro colonias probados por TF, y 90% de las interacciones vuelva a probar en una pantalla independiente de la misma levadura cebo ADN cepa10 , 12 , 19. más importante aún, las interacciones de la TF-DNA detectadas por eY1H validar a una tasa de 40%-70% cuando se la comprueba en reportero humano ensayos12,20, en las células humanas primarias (resultados no publicados) y en animales knockout de C. elegans 11. este es un índice de validación similar a la observada para el ChIP-seq datos21.

Aunque las interacciones identificadas por eY1H son altamente reproducibles cuando reexaminar la levadura misma cepa de ADN-cebo, pruebas de levaduras diferentes para el mismo cebo ADN produce a veces diferentes, aunque superpuestas, conjuntos de interacciones TF-DNA. Esto es generalmente debido a las diferencias en la actividad de reportero de fondo entre cepas. Además, fragmentos de una secuencia de ADN de prueba resultados en la detección de más interacciones de TF-DNA que prueba la secuencia completa, en particular cuando se analizan fragmentos solapados. Esto puede estar relacionado con el ensayo siendo más eficiente en la identificación de las interacciones que están cerca de los promotores de un mínimo de reportero, y porque prueba de superposición de fragmentos reduce las posibilidades de que un sitio de Unión puede ser ocluida por nucleosomas de levadura. Así, para proyectos de pequeña escala, se recomienda que superponen 0.5 – 1 kb fragmentos de una región reguladora están probados y que se proyectan dos cepas independientes para cada secuencia de ADN-bait8.

Hay varios pasos críticos en la eY1H detección protocolo para evitar algunos de los temas presentados en la figura 3. En primer lugar, aunque más ingredientes de los medios de comunicación son estables durante varios meses (excepto 3AT y X-gal), falta de crecimiento de la Colonia adecuada probablemente indica que al menos uno de los ingredientes puede haber perdido actividad y debe reemplazarse. En segundo lugar, es importante preparar las placas rectangulares para que el agar quede nivelado y por lo que no seque durante más de un día para evitar fallos en la fijación cuando se utiliza la plataforma robótica. Por último, es clave para utilizar los programas de plataforma robótica como se indica en el protocolo (revisita, recicla, mezcla, etc.) para que la levadura se transfieran efectivamente, para el apareamiento sea eficiente y evitar la contaminación cruzada entre clones de levaduras.

Los ejemplos que hemos seleccionado para ilustrar el uso de pantallas de eY1H corresponden a promotores del gene humano. Sin embargo, otras regiones reguladoras pueden también analizarse como potenciadores y silenciadores. Por ejemplo, hemos utilizado eY1H ensayos para evaluar la Unión de la TF a potenciadores del desarrollo humanos y a C. elegans primera intrones12,22. Además, dado que las interacciones se prueban de manera pares, ensayos de eY1H pueden utilizarse para comparar las interacciones entre variantes no codificante y variantes de la secuencia codificación TF. Por ejemplo, usando análisis de eY1H que se identificaron altera Unión de TF al 109 los variantes asociadas con enfermedades genéticas diferentes y también perfiles de interacción diferencial para 58 TF mutaciones sin sentido12,14. Aunque este protocolo se centra en evaluar la Unión de TF al humanas regiones reguladoras, regiones de ADN de otras especies también se pueden probar siempre que un TF-presa está disponible o puede ser generado. De hecho, se han generado TF-presa los arreglos de discos para10de C. elegans, Drosophila melanogaster23, Mus musculus24,25,de Arabidopsis thaliana26, y Zea mays 27. así, con recursos cada vez más disponibles, ensayos de eY1H se pueden aplicar a sistemas adicionales.

Aunque eY1H los ensayos han sido fundamentales para identificar el repertorio de TFs que se unen a regiones reguladoras diferentes en humanas y otras especies, no están libres de advertencias8,11,12,19 ,20,25. Una de las limitaciones es que las interacciones se prueban en el entorno del núcleo de la levadura, aunque se chromatinized los cebos de ADN, la estructura de la cromatina de la levadura puede no reflejar la estructura de la cromatina en la especie de donde se originó el cebo ADN y no refleja las diferencias de tipo de célula observadas in vivo. Así, las interacciones identificadas por análisis de eY1H deben ser validadas en reportero u otros ensayos funcionales. De nota, nosotros y otros han encontrado interacciones de TF-DNA detectadas por eY1H validar a una tasa de 40%-70% en ensayos funcionales11,12,20,23. Otra limitación del análisis eY1H es que no puede detectar interacciones con TFs que requieren modificaciones post-traduccionales ausente en levadura para enlazar a ADN, TFs que no se pliegan correctamente en la levadura cuando fusionados a la AD y TFs que faltan de la matriz 8. Además, en el formato actual, eY1H análisis no detectan interacciones que implican heterodiméricos de TFs, como cada colonia de levadura en la matriz TF expresa una sola presa de TF. Así, más mejoras en el análisis serán aumentar la amplitud de TFs que se puede probar y ampliar las capacidades de análisis eY1H identificar nuevas interacciones TF-ADN

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud [R35-GM128625 a J.I.F.B.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

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References

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

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Factor de transcripción de un híbrido Y1H genética número 144 levadura humanos gene regulación ADN eY1H
Pantallas de un híbrido levadura mejorada para identificar el Factor de transcripción atar a las secuencias de ADN humano
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Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C.… More

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

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