Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Расширение дрожжи один гибрид экраны для определения фактора транскрипции, привязка к последовательности ДНК человека

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/59192
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы представляем расширенной дрожжи один гибрид скрининг протокол для выявления факторов транскрипции (TFs), которые можно привязать к человеческой ДНК региона интерес. Этот метод использует высокопроизводительного скрининга трубопровода, который может допрашивать связывание > 1000 TFs в одном эксперименте.

Abstract

Определение набора факторов транскрипции (TFs), которые регулируют каждого человека ген является сложной задачей, которая требует интеграции многочисленные экспериментальные и расчетные подходы. Один из таких методов является дрожжи пробирного один гибрид (Y1H), в котором взаимодействие между TFs и ДНК регионах тестируются в обстановке дрожжи ядра с помощью репортер генов. Y1H анализы включают два компонента: «ДНК приманка» (например., промоутеров, усилители, глушители и т.д.) и «TF-добычу,» которые могут проверяться для активации Репортер ген. Наиболее опубликованные протоколы для выполнения Y1H экраны основаны на преобразования библиотеки TF-добычу или массивов в ДНК приманка штаммов дрожжей. Здесь мы описываем трубопровода, называется расширенной Y1H assays (eY1H), где допрашивают TF-ДНК взаимодействия путем спаривания ДНК приманка штаммы с выстроились коллекции штаммов TF-добычу, используя массив высокой плотности (HDA) Роботизированная платформа, которая позволяет скрининга в 1536 колонии формат. Это позволяет резкое увеличение пропускной способности (60 последовательностей ДНК приманка против > 1000 TFs занимает две недели за исследователь) и воспроизводимость. Мы иллюстрируют различные виды ожидаемых результатов путем тестирования человека промоутер последовательности против массив 1086 человека TFs, а также примеры вопросов, которые могут возникнуть во время экраны и способы их устранения.

Introduction

Центральная проблема в области биомедицины, является определение механизмов, которыми регулируется каждого человека ген. Транскрипция является первым шагом в борьбе уровни выражения гена, и он регулируется наборы факторов транскрипции (TFs), которые являются уникальными для каждого гена. Учитывая, что люди кодировать для > 1500 TFs1,2, определить полный набор TFs, которые контролируют выражение каждого гена остается открытым вызовом.

Два типа методов может использоваться для сопоставления TF-ДНК взаимодействий: TF-центре и ДНК центру методы3 (рис. 1A). TF-центру методов TF интереса является зондируемой для привязки геномной ДНК регионов или для определения его специфика связывания ДНК. Эти методы включают в себя иммунопреципитации chromatin (чип) следуют высокопроизводительного секвенирования, microarrays протеина привязки и SELEX4,5,6. В ДНК центру методов последовательность ДНК интереса является зондируемой определить набор TFs, привязанные к последовательности ДНК. Наиболее широко применяемым из таких методов является дрожжи один гибрид анализов (Y1H), в которых взаимодействия между TFs и ДНК регионах тестируются в среде дрожжи ядра с помощью репортер генов7,8,9.

Y1H анализы включают два компонента: «ДНК приманка» (например, промоутеров, усилители, глушители и т.д.) и «TF-добычу,» которые могут проверяться для Репортер ген активации9,10 (рис. 1B). ДНК приманка клонируется вверх по течению два репортера генов (LacZ и HIS3) и оба ДНК bait::reporter конструкции интегрированы в геноме дрожжи для создания chromatinized ДНК приманка штаммов. TF-добычу, закодированные в плазмиды, выражающий TF сливается для активации домена (AD) дрожжей Gal4 TF, вводится в штамм ДНК приманка для ловли TF-ДНК взаимодействия. Если TF-добычу связывает последовательности ДНК приманка, AD, присутствующих в TF-добычу приведет к активации как репортер генов. В результате клетки с позитивного взаимодействия может выбран для роста на пластины не хватает гистидина, а также преодоление конкурентный ингибитор, 3-амино-1,2,4-триазола (3-AT) и визуализируется как синий колоний в присутствии X-Гал. Потому что мощным дрожжи Gal4 объявление используется, Y1H анализов может обнаруживать взаимодействия с участием transcriptional активаторы, а также подавляющего. Кроме того учитывая, что TF-preys выражаются от сильного дрожжи промоутер (ADH1), взаимодействия могут быть обнаружены даже для TFs, которые имеют низкий эндогенного выражение уровней, которые являются сложными для обнаружения на чип11,12.

Наиболее опубликованные протоколы для выполнения Y1H анализы основаны на внесении TF-preys в ДНК приманка штаммов дрожжей путем преобразования пуле TF-добычу библиотек, последующим выбор, колонии комплектации и последовательности для определения взаимодействующих TF, или Преобразование отдельных клонов8,9. Это трудоемкий протоколы, ограничивая число последовательностей ДНК, которые могут быть проверены на исследователь. Недавнее улучшение анализов Y1H, называется расширение Y1H (eY1H), резко возросли скрининга пропускную способность с помощью высокой плотности массив (HDA) Роботизированная платформа для каждого выражения разных мат штаммов дрожжей ДНК приманка с коллекцией штаммов дрожжей TF-добычу10,13 (рис. 1 c). Эти экраны используют 1.536 колонии формат, позволяющий проверить большинство человеческих TFs в составленном, используя только три пластины. Кроме того, учитывая, что TF-ДНК взаимодействия тестируются на основе pairwise, этот подход позволяет для сравнения взаимодействий между ДНК приманок (например, два варианта некодирующей единичных нуклеотидных) и между различными TFs или TF варианты11,12 ,14.

С помощью eY1H анализов, мы разделенное крупнейший человека и Caenorhabditis elegans TF-ДНК, ДНК центру взаимодействия сетей к дата. В частности мы определили 2,230 взаимодействий между 246 человеческого развития усилителей и 283 TFs12. Кроме того мы использовали eY1H анализов для выявления измененных TF привязки 109 единичных нуклеотидных некодирующей варианты, связанные с генетическими заболеваниями, такими как пороки развития, рак и неврологических расстройств. Совсем недавно мы использовали eY1H для разграничения сети, состоящей из 21,714 взаимодействий между 2576 C. elegans генным стимуляторам и 366 TFs11. Эта сеть была инструментальная раскрыть функциональные роли десятки C. elegans TFs.

Протоколы для создания ДНК приманка пятна и оценивать уровни фоновой активности репортер были сообщила других15,16,17. Здесь мы описываем eY1H трубопровода, которые могут использоваться для экран любого человека геномной ДНК региона против массив 1086 человека TFs. После того, как формируется дрожжей штамма ДНК приманки и TF-добычу массив выставляется на соответствующий пластин, весь протокол могут быть выполнены в две недели (Таблица 1). Что еще более важно протокол можно распараллелить так, что один исследователь может одновременно экрана 60 последовательностей ДНК приманки. Чтобы продемонстрировать протокол, мы экранированный промоутеров двух генов цитокинов, CCL15 и IL17F. Кроме того мы показываем результаты от неудачных экранов проиллюстрировать типы проблем, которые могут возникнуть при выполнении eY1H анализов и способы их устранения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка

  1. SC −U −H плиты (Петри 150 мм)
    Примечание: Эти пластины будет использоваться для выращивания штаммов дрожжей ДНК приманки.
    1. Растворите отсева микс, дрожжи азота базы (YNB), аденин hemisulfate и сульфат аммония в 920 мл воды и pH 5.9 с 5 M NaOH (примерно 1 мл на литр СМИ; см. таблицу 2 для композиции). Залейте 2 Л колбу и добавить панель перемешать.
    2. В второй колбе 2 Л, добавить агар 950 мл воды (не добавить панель перемешать, как он вызовет агар кипеть в автоклаве).
    3. Автоклав для 40 мин на 15 psi на основе жидкого цикла.
    4. Сразу Вылейте содержимое первой колбе, включая бар перемешать, в агар, содержащие колбу. Добавьте глюкозы, смесь хорошо на тарелку, перемешать и охладить до 55 ° C на водяной бане.
    5. Добавьте лейцина и триптофана в средствах массовой информации. Смесь хорошо на тарелку, перемешать и вылить в стерильных Петри 150 мм (~ 80 мл на блюдо). Сухой для 3-5 дней при комнатной температуре, завернуть в пластиковые мешки и хранят при комнатной температуре до 6 месяцев.
  2. YAPD прямоугольной пластины
    Примечание: Эти пластины будет использоваться для выращивания газона для штамма ДНК приманки и для спаривания с TF массив-коллекцию.
    1. Распустить порошков (см. таблицу 3 для композиции), за исключением агар, 950 мл воды в колбу 2 Л и добавить панель перемешать.
    2. В второй колбе 2 Л, добавить агар 950 мл воды (не добавить панель перемешать, как он вызовет агар кипеть в автоклаве).
    3. Автоклав для 40 мин на 15 psi на основе жидкого цикла.
    4. Сразу Вылейте содержимое первой колбе, включая бар перемешать, в агар, содержащие колбу.
    5. Добавьте глюкозы, смесь хорошо на пластину перемешать и здорово 55 ° C. Налить СМИ в прямоугольной пластины (см. Таблицу материалов; ~ 70 мл на пластину) с использованием перистальтического насоса (5 мл/сек) и трубку 6 мм. Сухой за 1 день при комнатной температуре, обернуть в пластиковые мешки и хранят в холодной комнате на срок до 6 месяцев.
      Примечание: Хотя объем предлагаемых СМИ 70 мл на тарелку, 50-80 мл на табличке может использоваться. Три важнейших вопросов для рассмотрения когда лить пластины являются 1) что они выровнены, так что агар СМИ имеет такой же толщины по всей пластине (использовать выдвинутые таблицы или поверхности для наливания пластины и не наливайте в штабеля более чем семи пластин) 2) для обеспечения отсутствия пузырьков в агар СМИ (пузыри должны быть выскочил с помощью стерильной иглой) и 3) сушки пластин на только один день и упаковка плит в пластиковые мешки, чтобы избежать сбоев в закрепление дрожжей.
  3. SC-−Trp и СК −U −Trp прямоугольной пластины
    Примечание: Эти пластины будет использоваться для выращивания коллекции массива TF (Sc −Trp) и выбрать диплоидных дрожжей после спаривания (Sc −U −Trp).
    1. Распустить отсева микс, YNB, аденин hemisulfate и сульфат аммония в 920 мл воды и pH 5.9 с NaOH 5 М (примерно 1 мл на литр СМИ) (см. таблицу 4 для композиции). Залейте 2 Л колбу и добавить панель перемешать.
    2. В второй колбе 2 Л, добавить агар 950 мл воды (не добавить панель перемешать, как он вызовет агар кипеть в автоклаве).
    3. Автоклав для 40 мин на 15 psi на основе жидкого цикла.
    4. Сразу Вылейте содержимое первой колбе, включая бар перемешать, в агар, содержащие колбу. Добавьте глюкозы, смесь хорошо на тарелку, перемешать и охладить до 55 ° C.
    5. Добавьте лейцина, гистидина и урацилом (пропустить урацила для пластин −Trp −U Sc).
    6. Смесь хорошо на тарелку, перемешать и вылить в прямоугольной пластины (~ 70 мл на пластину) с использованием перистальтического насоса (5 мл/сек) и трубку 6 мм. Сухой за 1 день при комнатной температуре, обернуть пластины в пластиковые мешки и хранят в холодной комнате на срок до 3 месяцев.
  4. SC −U −H −Trp + 3AT + X-Гал прямоугольной пластины
    Примечание:     эти пластины будет использоваться как индикация плиты для eY1H анализов.
    1. Распустить отсева микс, YNB, аденин hemisulfate и сульфат аммония в 850 мл воды (см. таблицу 5 для композиции). Сделать не рН. Залейте 2 Л колбу и добавить панель перемешать.
    2. В второй колбе 2 Л, добавить агар 850 мл воды (не добавить панель перемешать, как он вызовет агар кипеть в автоклаве).
    3. Автоклав для 40 мин на 15 psi на основе жидкого цикла.
    4. Подготовка 10 x Бу соли (1 Л), объединив 900 мл воды, 70 г Na2HPO4∙7H2O и 34,5 g NaH2PO4∙H2O. микса с помощью функции бар stir распустить порошков и Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 с помощью 5 M NaOH. Добавьте воду, довести до 1 Л и автоклав.
    5. Приготовляют раствор X-Гал, добавив 3.5 g порошка X-галлон пластиковый Тюбик 50 мл, содержащие 42,5 мл диметилформамид. Добавить порошок X-Гал диметилформамид для более легко растворяются (это занимает 30 минут). Стоковый раствор Храните в темноте (использование непрозрачной 50 мл трубки или обложки фольгой). Хранить при температуре от-20 ° C.
    6. Сразу Вылейте содержимое первой колбе, включая бар перемешать, в агар, содержащие колбу. Добавьте глюкозы и 10 x Бу солей (см. таблицу 5 для композиции), смесь хорошо на тарелку, перемешать и охладить до 55 ° C.
    7. Добавьте лейцина, 3AT и X-Гал (см. таблицу 5 для композиции).
    8. Смесь хорошо на тарелку, перемешать и вылить в прямоугольной пластины (~ 70 мл на пластину) с использованием перистальтического насоса (5 мл/сек) и трубку 6 мм. Сухой за 1 день при комнатной температуре, завернуть в пластиковые мешки и хранить в холодной комнате покрыты алюминиевой фольги (3AT и X-Гал являются светочувствительных) сроком до 1 месяца.

2. кровянистые выделения в массив TF

  1. Размораживание TF-добычу массив
    1. Оттепель дрожжи глицерин запасов пластины с TF-добычу массива на льду.
      Примечание: TF-добычу массивы могут быть созданы как ранее опубликованные10,12,13,18.
    2. Ресуспензируйте дрожжей, используя 12-канальный дозатор в течение 1-3 мин до следующего шага.
  2. Кровянистые выделения дрожжей в Sc −Trp прямоугольной пластины
    1. В роботе HDA (см. Таблицу материалы), выберите несколько хорошо 96 пластины как источник, 96 плиты агара как целевых, так и 96 длинные пин пады.
      Примечание: Пин-пады не пригодны для повторного использования и должен быть уничтожен.
    2. Выберите Реплицировать многие программу, чтобы сделать две копии каждой 96-луночных пластины. Не использовать корзины или пересмотреть параметры, чтобы избежать возврата загрязнения запасов замороженных.
    3. Выберите параметр для вихрем вверх и вниз в источнике Смешать дрожжи.
    4. Мешок пятнистый массив и Инкубируйте агар стороне вверх на 30 ° C на 2-3 дней.
  3. Создание 384 колонии массивы в Sc −Trp прямоугольной пластины
    1. В робота выберите 96 плиты агара в качестве источника, 384 агар пластины как цель и 96 короткие пин пады.
    2. Выберите программу массива 1:4 . Таким образом четыре 96 колонии пластины (каждый из которых содержит различные TF) будут объединены в один 384 колонии пластины. Не использовать корзины или пересмотреть параметры, чтобы избежать загрязнения между различными пластинами.
    3. Пакет пластин и инкубировать пятнистый 384-колонии массив агар стороне вверх при 30 ° C на 2 дня.
  4. Создание 1.536 колонии массивы в Sc −Trp прямоугольной пластины
    Примечание: Это приведет к массивы, содержащие четыре колонии для каждого TF-добычу.
    1. В робота выберите 384 плиты агара в качестве источника, 1.536 агар пластины как цель и 384 короткие пин пады.
    2. Выберите программу единого источника пробирного 1:4. Цель заключается в копировании каждой колонии в четыре колонии для получения quadruplicates. Использование корзины и пересмотреть параметры, как это предполагает копирование четыре раза каждой колонии.
    3. Пакет пластин и инкубировать пятнистый 1536-колонии массив агар стороне вверх при 30 ° C в течение 3 дней.
  5. Усиливая 1.536 колонии массив в Sc −Trp прямоугольной пластины
    1. В робота выберите 1.536 плиты агара в качестве источника, 1.536 плиты агара как цель и 1536 короткие пин пады.
    2. Выберите Реплицировать многие программу повторить 3 – 4 копии. Использование корзины и пересмотреть вариант, но выбросить pad при переключении на другой плиты массива, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
    3. Пакет пластин и Инкубируйте пятнистый 1536-колонии массив агар стороне вверх на 30 ° C в течение 3 дней, чтобы использовать для спаривания шаги (см. ниже). После этого Держите пластины при комнатной температуре и копирования снова после 7 дней для нового раунда скрининга.

3. eY1H экран

  1. Подготовка газонов штамма ДНК приманка для спаривания
    1. Найди дрожжи ДНК приманка штаммов на плите −H −U Sc и расти на 3 дня при температуре 30 ° C.
    2. Полоска дрожжи в 15 см Sc −U −H пластину с помощью стерильных зубочисткой, таким образом, чтобы каждая пластина помещается 12 – 16 различных штаммов. Инкубировать один день на 30 ° C.
    3. Полоска дрожжи в 15 см Sc −U −H пластину с помощью стерильных зубочисткой, таким образом, чтобы каждая пластина помещается 4 различных штаммов. Инкубируйте на один день на 30 ° C.
    4. Очистите с помощью стерильных зубочисткой, не забудьте очистить любые агар и добавить в 1,5 пробирку с 500 мкл стерильной воды дрожжи.
    5. Добавьте 10-15 стерильные стеклянные бусы на YAPD прямоугольной пластины. Добавить дрожжи подвеска на пластину и тщательно встряхнуть во всех направлениях за 1 мин, чтобы убедиться, что дрожжи распространяется через все пластины.
    6. Инвертировать плиты немедленно и коснитесь так что бисер пойти к крышке. Удаление и переработку бисер.
    7. Пакет пластин и инкубировать агар стороне вниз на 1 – 2 дня при температуре 30 ° C. Затем перейти к шагу спаривания.
  2. Спаривания дрожжей ДНК приманки и TF массив штаммов
    1. Передача массива TF YAPD прямоугольной пластины с роботом. Выберите пластину 1.536 агар как источник и цель и 1536 короткие пин-падом. Выберите Реплицировать многие программы. Каждая пластина TF массива может использоваться для передачи до 3-4 YAPD пластин (в зависимости от количества знаков в массиве). TF массив пластин, используемых для спаривания должна быть 2-3 дней, но не больше, как спаривание может быть неэффективным.
    2. Передача газон штамма ДНК приманка для пластин YAPD, уже содержащий массив TF с роботом. Выберите пластину 1.536 агар как источник и цель и 1536 короткие пин-падом. Выберите Реплицировать многие программы. Использовать случайное смещение в источнике с радиусом ~0.6 мм, чтобы избежать принятия дрожжи из того же места и смешайте на цель для облегчения контактов между штаммов дрожжей. Используйте газон, содержащие ДНК приманка штаммы (раздел 3.1) как источник и YAPD пластин, содержащий массив TF, заметили в шаге 3.2.1 как цель.
    3. Пакет пластин и инкубировать агар стороне до 30 ° c за 1 день.
  3. Выбор диплоидных дрожжей
    1. Передать растяжением дрожжей из плит YAPD Sc −U −Trp плиты с роботом. Выберите пластину 1.536 агар как источник и цель и 1536 короткие пин-падом. Выберите реплицировать программу. Mix на источник и на цель.
    2. Пакет пластин и инкубировать агар стороне до 30 ° c на 2-3 дней (длительный инкубационный приводит к высокой фоновой активности репортер).
  4. Передать индикация пластины
    1. Передать диплоидных дрожжей из плиты −Trp −U Sc индикация прямоугольной пластины Sc −U −H −Trp + 5 мм 3AT + 0,4 мм X-Гал с помощью робота. Выберите пластины 1.536 агар как источник и цель и 1536 короткие пин-падом. Выберите реплицировать программу.
    2. Пакет пластин и проинкубируйте агар стороне до 30 ° c до 7 дней.
  5. Томографии индикация пластин
    1. Для ДНК приманка штаммы с высоким уровнем фоновой активности репортер сфотографироваться на 2, 3 и 4. В противном случае принимать фотографии на 4 и 7 дней. Положительных взаимодействий обозначаются роста и синий цвет дрожжей колоний и может определяться вручную, или он может быть определен с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Три основные факторы следует учитывать при анализе результатов от eY1H анализов: фоновой активности репортер штамма ДНК приманка, сила репортер деятельности соответствующего взаимодействия TF-ДНК и количество положительных колоний. Репортер фоновой активности (например, autoactivity) штамма ДНК приманка ссылается на общий рост и цвет дрожжей колоний в индикации пластины, даже в отсутствие хищных TF. В идеале не autoactive штаммов Показывать фон белый или светло-коричневого цвета, с колониями позитивного взаимодействия, больше и синий. Autoactive ДНК приманка штаммов показывают рост дрожжей в средствах массовой информации не хватает гистидина и синий цвет присутствии X-Гал для всех колоний в пластине, что вероятно связано с привязки transcriptional дрожжей активаторы для ДНК приманка8. Сила репортер деятельности соответствующего взаимодействия TF-ДНК обнаружено (т.е. размер колонии) и интенсивности синего зависит от многих параметров, таких как близость, TF выражение уровня в дрожжи, количество привязки сайтов и расстояние до дрожжи минимальный промоутеров расположен выше по течению от репортера генов и фоновой активности репортер штамма ДНК приманки. Например слабое взаимодействие может быть легко обнаружены в низких фоновых приманку, но может быть трудно обнаружить в autoactive или неровный фон приманки. Это также важно отметить, что активность Репортер уровней в дрожжи не коррелируют обязательно с нормативной деятельностью в клетках человека, как структура хроматина, нуклеосома позиционирования, и расстояние эффекты отличаются между дрожжей и человека. Кроме того взаимодействие в человека, вероятно, будут оказывать влияние на связывание других TFs и кофакторы или могут быть замаскированы функционально избыточных TFs8. Наконец взаимодействия считаются положительными в eY1H анализов, когда по крайней мере два из четырех колоний Показать репортер выражение выше фоновых уровней. Однако мы заметили, что ~ 90% взаимодействий определила результат из всех четырех колоний, соответствующий TF, будучи положительных10,12,19.

Чтобы проиллюстрировать тип результатов, которые могут быть получены с помощью eY1H анализов мы отбор регионов промоутер (2Кб вверх по течению сайтов начало транскрипции) генов CCL15 и IL17F, против массив 1086 человека TFs (рис. 2). Промоутер CCL15 является примером из не autoactive ДНК приманку, где даже взаимодействий, слабым, может быть легко обнаружен (рис. 2A). Промоутер IL17F является примером autoactive ДНК приманка с неравномерным фоновая активность Репортер, где могут быть обнаружены некоторые взаимодействия, хотя для нескольких TFs не ясно ли репортер активность выше, чем фон (рис. 2B).

Проблемы, которые могут возникнуть при выполнении анализов eY1H

Хотя скрининг eY1H протокол прямо вперед и надежные, некоторые проблемы могут быть обнаружены во время экрана:

1) колонии слишком малы и не передачи (рис. 3A): Хотя ожидается, что некоторые дрожжи, выражая экзогенных TFs может отображать медленный рост, учитывая, что дрожжи экспрессии генов может быть dysregulated, обычно ~ 95% TF-добычу колоний отображения обычных роста. Если более 10% колоний не расти, наиболее частыми причинами являются проблемы с массовой информации или с передачей дрожжей. Неоптимальный рост часто связан с одним из компонентов средства массовой информации, потери активности (например, урацила, гистидина или лейцина), которая может быть решена путем подготовки свежие СМИ с свежими фондовых решения. Кроме того это также может быть связано для закрепления смещение, которое влияет на передачу колонии. В этом случае проверьте, что 1.536 колодки контактный центр дрожжи колоний в исходном пластинах.

2) не рост дрожжей в части пластины (рис. 3B): этот вопрос, как правило, связаны с недостаточностью в спаривания шаг если 1.536 пин-падом сумеет сделать контакт с дрожжами в ДНК приманка штамм газон, TF массив, или пластину спаривания. Почти в каждом случае это из-за неравномерного агар СМИ уровня во время пластины лить или из-за чрезмерного высыхания плиты.

3) взаимодействия не обнаружен (рис. 3 c и D): этот вопрос часто связано либо непреднамеренных инактивирующего мутации в генах репортер, в частности LacZ (рис. 3 c), или высокой autoactivity, что маски взаимодействия (Рисунок 3D). для устранения этой проблемы, мы рекомендуем вам экран другой самостоятельно полученный штамм, соответствующий же ДНК приманка.

4 пластина представляет случайные синие пятна (Рисунок 3E): этот вопрос часто связано с бактериального загрязнения. Для решения этой проблемы, полоска дрожжи для получения отдельных колоний и повторять экрана.

Выше приведены наиболее частые проблемы, возникающие при выполнении eY1H анализов. Если возникают другие проблемы, подготовка новых средств массовой информации, подтвердив, что были использованы соответствующие параметры для HDA робота, и тестирования несколько штаммов в ДНК приманка будет скорее всего решить большинство проблем.

Figure 1
Рисунок 1 : Наброски пробирного экранов eY1H. (A) сравнение между TF-центре и ДНК центру методов для выявления ДНК белковых взаимодействий. (B) схемы eY1H анализов. Вверх по течению клонирован последовательность ДНК интерес (промоутер, усилитель, глушитель и т.д.) из HIS3 и LacZ репортер гены интегрирован в геноме дрожжей. Результате штамма ДНК приманка соединяется к коллекции штаммов дрожжей, укрывательство TFs, сливается с Gal4 активации домена (AD). Позитивного взаимодействия определяются способностью дрожжей расти без гистидина и преодоление конкурентный ингибитор 3-AT и синеет присутствии X-Гал. (C) конвейер для eY1H экранов. Газон дрожжей штамма ДНК приманка выращенных в YAPD пластина вязка в YAPD пластину в массив 1.536 колонии, выражая TFs, сливается с AD, выращенных на плите −Trp Sc. После одного дня дрожжи передается −U −Trp Sc для выбора диплоидных дрожжей. После 2-3 дня инкубации дрожжи передается Sc −U −H −Trp + 3AT + X-Гал пластины (индикация пластина) для выявления ДНК белковых взаимодействий. Каждое взаимодействие испытывается в составленном.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Примеры плит индикация eY1H. (A) взаимодействия с участием промоутер CCL15, не autoactive приманку. Фоновая активность Репортер для этой приманки низка (снижение темпов роста в отсутствие гистидина и отсутствие синего цвета для TFs не взаимодействующих). (B) взаимодействия с участием промоутер IL17F, autoactive приманку. Фоновая активность Репортер для этой приманки высока (рост в отсутствие гистидина и фон синий цвет по всей пластине) и неравномерным, что делает его сложным для выявления ДНК белковых взаимодействий. Сильный, средний и слабого взаимодействия квадрат в красный, оранжевый и желтый, соответственно. Отображаются имена HGNC взаимодействующих TFs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Проблемы в экранах eY1H. (A) TF-добычу массива, где несколько колоний удалось расти. (B) индикация пластины, где колонии в нижнем левом углу не удалось передать. (C) Non-autoactive ДНК приманка штамм, который не отображать позитивного взаимодействия. (D) высоко autoactive ДНК приманка штамм, который не отображать позитивного взаимодействия. (E) индикация плита отображение нескольких синий колоний из-за загрязнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Кровянистые выделения в массив TF
1 день Найди дрожжей в Sc – ГТО пластину в формате 96 колонии (2.1 и 2.2)
День 4 Создание массива TF 384 колонии (2.3)
День 6 Создание массива TF 1.536 колонии (2.4)
День 9 Усилить 1.536 колонии TF массив (2.5)
Подготовка газонов штамма ДНК приманка для спаривания
День 6 Найди дрожжи ДНК приманка штаммов (3.1.1)
День 9 Полоска дрожжи, 12-16 штаммов на пластину (3.1.2)
День 10 Полоска дрожжей, 4 штаммов на пластину (3.1.3)
День 11 Подготовить ДНК приманка газонов (3.1.4 и 3.1.5)
Спаривания дрожжей ДНК приманки и TF массив штаммов
День 12 Спаривания в YAPD пластин (3.2)
Выбор диплоидных дрожжей
День 13 Выбор диплоидных дрожжей в Sc – U-Trp пластины (3.3)
Передать индикация пластины
День 15 Передача диплоидных дрожжи для индикации пластины (3.4)
Томографии индикация пластин
Дни 17-22 Получение изображения индикации пластин в зависимости от фона (3.5)

Таблица 1: TFF массив.

РЕАГЕНТ Количество (по 2 Л)
Отсева из смеси синтетических минус гистидина, лейцин, триптофан и урацилом, аденин, богатые (2 g), дрожжей азота базы 2.6 g
Дрожжи азота базы без аминокислот и сульфата аммония (YNB) 3.4 g
Аденин hemisulfate дигидрат 160 мг
Сульфат аммония 10 g
Агар 35 g
Глюкозы (40%, w/v) в воде, стерильные 100 мл
Лейцин (100 мм), стерильной фильтрации 16 мл
Триптофан (40 мм), стерильной фильтрации 16 мл

Таблица 2: Реагент список I.

РЕАГЕНТ Количество (по 2 Л)
Пептон 40 g
Экстракт дрожжей 20 g
Аденин hemisulfate дигидрат 0.32 g
Глюкозы (40%, w/v) в воде, стерильные 100 мл
Агар 35 g

Таблица 3: Реагент списка II.

РЕАГЕНТ Количество (по 2 Л)
Отсева из смеси синтетических минус гистидина, лейцин, триптофан и урацилом, аденин Рич (2 g) дрожжей азота базы 2.6 g
Дрожжи азота базы без аминокислот и сульфата аммония (YNB) 3.4 g
Аденин hemisulfate дигидрат 160 мг
Сульфат аммония 10 g
Агар 35 g
Глюкозы (40%, w/v) в воде, стерильные 100 мл
Лейцин (100 мм), стерильной фильтрации 16 мл
Гистидин (100 мм), стерильной фильтрации 16 мл
Урацилом (20 мм), стерильной фильтрации (опустить для Sc-U – ГТО пластины) 16 мл

Таблица 4: Реагент список III.

РЕАГЕНТ Количество (по 2 Л)
Отсева из смеси синтетических минус гистидина, лейцин, триптофан и урацилом, аденин Рич (2 g) дрожжей азота базы 2.6 g
Дрожжи азота базы без аминокислот и сульфата аммония (YNB) 3.4 g
Аденин hemisulfate дигидрат 160 мг
Сульфат аммония 10 g
Агар 35 g
Глюкозы (40%, w/v) в воде, стерильные 100 мл
10 x Бу соли 200 мл
Лейцин (100 мм), стерильной фильтрации 16 мл
3AT (2 М), стерильной фильтрации 5 мл
X-Гал (80 мг/мл) в DMF 4 мл

Таблица 5: Реагент списка IV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Робот eY1H спаривания скрининг подход, описанный здесь значительно увеличивает пропускную способность для определения набора TFs, привязанные к ДНК региона интерес, по сравнению с предыдущей библиотеки скрининга или выстроились скрининг подходы, основанные на преобразование. Кроме того TF-ДНК взаимодействия определяется eY1H, которую анализов высокую воспроизводимость как 90% взаимодействий обнаружен положительный для всех четырех колоний проверяются на TF, и 90% взаимодействий тестирование в независимых экран же штамм дрожжей ДНК приманки10 , 12 , 19. что еще более важно, TF-ДНК взаимодействия определяется eY1H проверки по ставке 40% – 70% при испытании в человека репортер анализов12,20, в первичных клеток человека (неопубликованные результаты) и в C. elegans нокаут животных 11. это же скорость проверки к наблюдаемому для чип seq данных21.

Хотя взаимодействия, определены eY1H высокую воспроизводимость при переаттестации же дрожжей штамма ДНК приманка, тестирование разными штаммами дрожжей для того же ДНК приманка иногда производит разные, хотя перекрывающиеся, наборы TF-ДНК взаимодействий. Обычно это вызвано различиями в фоновой активности репортер штаммов. Кроме того тестирование фрагменты ДНК последовательности приводит к обнаружения более взаимодействий TF-ДНК, чем тестирование полной последовательности, в частности, когда проверяются перекрывающихся фрагментов. Это может быть связано с assay, будучи более эффективным в выявлении взаимодействий, которые близки к минимальным промоутеров репортер, и потому, что тестирование перекрывающихся фрагментов уменьшает вероятность того, что сайт связывания может быть закрыта нуклеосом дрожжей. Таким образом, для небольших проектов, рекомендуется что перекрывающихся 0,5 – 1 КБ фрагменты регулирования региона проходят испытания и что два независимых штаммов проверяются для каждой последовательности ДНК приманка8.

Есть несколько важных шагов в eY1H скрининг протокол, чтобы избежать некоторых вопросов представлен на рисунке 3. Во-первых хотя большинство СМИ ингредиенты являются стабильными в течение нескольких месяцев (за исключением 3AT и X-gal), отсутствие надлежащего колонии роста вероятно указывает, что по крайней мере один из ингредиентов, возможно, потеряли активность и должны быть заменены. Во-вторых важно подготовить прямоугольной пластины, так что агар выравнивается, и таким образом, чтобы они не сушите на более чем один день, чтобы избежать сбоя в закрепление при использовании Роботизированная платформа. Наконец это ключ для использования программы Роботизированная платформа как указано в протоколе (повторяемость, корзины, смешивания и т.д.) для дрожжей для спаривания чтобы быть эффективным и чтобы избежать перекрестного загрязнения между дрожжей клоны эффективно, переносится.

Примеры, которые мы выбрали для иллюстрации использования экранов eY1H соответствуют человеческого гена промоутеров. Однако другие нормативные регионов также могут быть тестированны включая усилители и глушители. Например мы использовали eY1H анализов для оценки TF привязки для человеческого развития усилителей и C. elegans первый интронов12,22. Кроме того учитывая, что взаимодействие проверяются на основе pairwise, eY1H анализов может использоваться для сравнения взаимодействий между некодирующих варианты и TF кодирования последовательности вариантов. Например с помощью eY1H анализов, которые мы определили изменены TF привязки 109 некодирующей варианты, связанные с различными генетическими заболеваниями, а также дифференциальные взаимодействия профилей для TF 58 Миссенс-мутации12,14. Хотя этот протокол посвящен оценке TF привязку человека регулирования регионы, регионы ДНК от других видов также могут быть проверены, при том условии, что жертвой TF доступны или могут быть созданы. Действительно, TF-добычу массивы были созданы для C. elegans10, Drosophila melanogaster23, Mus musculus24, Arabidopsis thaliana25,26, и Zea mays 27. Таким образом, все имеющиеся ресурсы, eY1H анализов могут быть применены к дополнительных систем.

Хотя eY1H анализов помогли определить репертуар TFs, которые связывают различные нормативные регионы в человека и других видов, они не свободны от предостережения8,11,12,19 ,20,25. Одним из ограничений, что взаимодействия тестируются в среде ядра дрожжей, и, хотя chromatinized ДНК приманок, структуре хроматина в дрожжи могут не отражать структуру хроматина в видов откуда возникла ДНК приманка и не будет отражать различия клетки типа наблюдается в естественных условиях. Таким образом взаимодействия, определены eY1H анализы должны быть проверены в репортер или других функциональных анализов. Обратите внимание, мы и другие нашли что TF-ДНК взаимодействия определяется eY1H проверки по ставке 40% – 70% в функциональных анализов11,12,,2023. Еще одним ограничением eY1H анализов является, что он не может обнаружить взаимодействия с участием TFs, которые требуют столб-поступательные изменения отсутствуют в дрожжи для привязки к ДНК, TFs, которые должным образом не складываются в дрожжи когда сливается с AD и TFs, отсутствующих из массива 8. Кроме того, в текущем формате, eY1H анализов не обнаруживать взаимодействия с участием гетеродимерная TFs, как каждой колонии дрождей в массиве TF выражает один TF-добычу. Таким образом дальнейшие улучшения в assay увеличит широту TFs, которые могут быть проверены и расширить возможности eY1H анализов для выявления роман TF-ДНК взаимодействия

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения [R35-GM128625 до J.I.F.B.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

Tags

Генетика выпуск 144 дрожжи 1 гибрид Y1H транскрипция фактор человека eY1H регулирование ДНК Джин
Расширение дрожжи один гибрид экраны для определения фактора транскрипции, привязка к последовательности ДНК человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C.… More

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter