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Artigo de método

Expressão transiente em beterraba vermelha de uma vacina candidata biofarmacêutica para Diabetes tipo-1

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DOI:

10.3791/59298

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19 de março de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, University of Verona

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um candidato de vacina oral contra a diabetes tipo 1 em uma planta comestível.

Resumo

Agricultura molecular de plantas é o uso de plantas para produzir moléculas de interesse. Nesta perspectiva, plantas podem ser utilizadas tanto como biorreatores para produção e purificação subsequente do produto final e para a entrega oral direta de proteínas heterólogos quando utilizar espécies de plantas comestíveis. Neste trabalho, apresentamos o desenvolvimento de uma vacina oral do candidato contra Diabetes tipo 1 (T1D) em sistemas de planta comestível, usando a tecnologia de baseados em vírus recombinante DNA planta desconstruída, entregada com infiltração de vácuo. Nossos resultados mostram que a beterraba vermelha é um hospedeiro adequado para a expressão transiente de um autoantigen derivada humana associada à T1D, considerado um candidato promissor como vacina T1D. Folhas, produzindo o autoantigen completamente foram caracterizadas por sua resistência à digestão gástrica, a presença de carga bacteriana residual e por seu perfil metabólico secundário, dando uma visão geral sobre a produção de processo para o potencial de uso de plantas para entrega oral directa de uma proteína heteróloga. Nossa análise mostrou quase completa degradação da vacina oral liofilizado candidato seguindo uma simulado digestão gástrica, sugerindo que uma estratégia de encapsulamento na fabricação da vacina de origem vegetal GAD é necessária.

Introdução

Desde a revolução de biologia molecular de plantas na década de 1980, os sistemas à base de plantas para a produção de biofármacos podem ser considerados como uma alternativa aos tradicionais sistemas baseados em células de mamíferos e microbiana1. As plantas exibem várias vantagens sobre plataformas tradicionais, com escalabilidade, custo-efetividade e segurança, sendo os mais relevantes2. O produto recombinante pode ser purificado a partir do tecido de planta transformada e administrado, também por via parentérica ou por via oral e, além disso, planta comestível transformada pode ser usada diretamente para entrega oral. Via oral simultaneamente promove a imunidade da mucosa e sistêmica, e elimina a necessidade de agulhas e pessoal médico especializado. Além disso, entrega oral elimina o complexo processamento a jusante, que normalmente responde por 80% do custo total de fabricação de uma proteína recombinante3. Todas essas vantagens podem ser traduzidas em economia de produção, suprimentos e mão de obra reduzindo os custos de cada dose, tornando a droga acessível à maioria da população mundial.

Várias estratégias, tanto para a transformação estável e expressão transiente, foram desenvolvidas para a produção de proteínas recombinantes em plantas. Entre eles, um sistema de expressão baseada em vírus de planta desconstruída de alto rendimento (por exemplo, magnICON) fornece desempenho superior levando altos rendimentos de proteínas recombinantes em prazos relativamente curtos4. Muitos exemplos de expressão transiente, usando o sistema de expressão baseada em vírus de planta em plantas de Nicotiana benthamiana são relatados, sendo o host de produção padrão-ouro. No entanto, esta planta de modelo não é considerada como uma espécie comestível devido os alcaloides e outros metabolitos tóxicos que são acumulados em suas folhas.

Neste trabalho, descrevemos a comparação entre dois sistemas de plantas comestíveis, beterraba vermelha (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) e espinafre (Spinacea oleracea cv Industria), para a expressão de duas formas de candidato do isoform 65 kDa de ácido glutâmico descarboxilase (GAD65), realizado pela planta baseados em vírus vetores5. GAD65 é um autoantigen importante associada a Diabetes tipo 1 (T1D) e é atualmente sob investigação em ensaios clínicos humanos para impedir ou atrasar T1D através da indução de tolerância6. A produção de GAD65 em plantas tem sido estudada extensivamente em espécies de plantas de modelo como tabacum do Nicotiana benthamiana s.4,5,6,e7. Aqui, descrevemos a utilização de espécies vegetais comestíveis para a produção da molécula em tecidos que pode ser destinada a uma entrega oral direta. Do ponto de vista técnico, estudamos e selecionado o sistema de agroinfiltration da planta e a plataforma de planta comestível para produção de GAD65 avaliando parâmetros diferentes: a expressão da proteína recombinante os níveis, a carga microbiana residual em planta tecido destinado a entrega oral, a resistência de GAD65 para a digestão gástrica e a bioequivalência das plantas transformadas com o tipo selvagem.

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Protocolo

1. vermelho cultivo de beterraba e espinafre

  1. Crescer a beterraba vermelha (b. vulgaris cv Moulin Rouge) e espinafre (S. oleracea cv Industria) plantas em uma câmara de crescimento, usando 150 µE de intensidade da luz, umidade relativa de 65%, ciclo claro/escuro de 12 h 23/21 ° c, respectivamente.
  2. Após a germinação de sementes, adubar as plantas duas vezes por semana com uma solução de 1 g/L de um fertilizante comercialmente disponível (Tabela de materiais). Para agroinfiltration use espinafre de cinco semanas e plantas de beterraba vermelha de seis semanas de idade.

2. transiente expressão através da tecnologia baseados em vírus de planta desconstruída

  1. Construção de vetores de expressão de planta
    1. Introduzir os vetores - o módulo 5' (pICH20111), os 3' módulos (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut e pICH7410.eGFP), preparados como descrito anteriormente,1,2,7e o módulo de integrase (pICH14011)- em Agrobacterium tumefaciens GV3101 tensão usando as técnicas padrão. Crescem em meio de LB contendo 50 μg/mL rifampicina e antibióticos apropriados do vetor-específico (carbenicilina 50 de μg/mL para pICH20111, pICH14011 e pICH7410.eGFP), 50 canamicina μg/mL para pICH31070 por 2 dias a 28 ° C.
    2. As colônias por colônia do PCR usando os seguintes primers específicos para cada vetor de tela: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' e 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' para 3' módulos pICH31070.GAD65mut e pICH31070.∆87G65mut, com uma temperatura do recozimento de 55 ° C e um tempo de alongamento de 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' e 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' para o terceiro 3' módulo pICH7410.eGFP, com uma temperatura do recozimento de 53 ° C e tempo de alongamento de 30 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' e 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' para o módulo de 5', com uma temperatura do recozimento de 53 ° C e tempo de alongamento de 20 s e 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3' e 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' para o módulo de integrase com uma temperatura do recozimento de 57 ° C e tempo de alongamento de 45 s.
    3. Realizar a reação de PCR em um volume total de 20 μL usando o seguinte ciclo de reacção específica: 5 min desnaturação inicial a 95 ° C, 35 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s na temperatura de recozimento e a etapa de alongamento a 72 ° C (temperatura e alongamento do tempo de recozimento uma Re específico para cada par de primer) e uma etapa de alongamento final de 7 min a 72 ° C.
  2. Seringa agroinfiltration
    1. Inocular as três transformants da . tumefaciens em 50 mL de LB médio contendo 50 μg/mL, rifampicina e os seguintes antibióticos específicos do vetor apropriados: 50 carbenicilina μg/mL para a. tumefaciens transformada com pICH20111, pICH14011 ou pICH7410.eGFP ou 50 canamicina μg/mL para a. tumefaciens transformada com pICH31070. Crescer por agitação durante a noite a 28 ° C.
    2. Culturas bacterianas durante a noite de pelotas por centrifugação a 4.500 x g por 20 min e Resuspenda-los em 100 mL (ou dois volumes de cultura bacteriana inicial) de solução tampão de infiltração com ácido 4-morpholineethanesulfonic de 10mm (MES; pH 5,5) e 10 mM MgSO4, sem considerar o OD600. Incube as suspensões à temperatura ambiente (RT) para 3h.
    3. Misturar volumes iguais de suspensões bacterianas que contêm um dos três módulos, GAD65mut, ∆87GAD65mut ou eGFP 3' módulo, com 5' módulo e módulo de integrase. Use a mistura de suspensão para infiltração de seringa de folhas vermelhas de beterraba e espinafre.
    4. Coloca 5 mL da suspensão em uma seringa sem a agulha. Pressione a ponta da seringa contra a parte inferior da folha para as plantas de beterraba vermelha e espinafre e enquanto isso, aplicar uma contrapressão suave para o outro lado da folha.
    5. Infiltrar-se as três primeiras folhas completamente expandidas a partir do ápice de cada planta. Rotule as folhas de agroinfiltrated com um tag de papel no caule folha. Retorno as plantas em uma câmara de crescimento sob condições normais.
      Nota: Por razões de saúde e segurança, use luvas e óculos de proteção durante o processo de infiltração.
    6. Agroinfiltrated recolher folhas de 4 a 14 dias pós infecção (dpi) e congelá-los em nitrogênio líquido. Tecido de planta loja a-80 ° C.
  3. Agroinfiltration vácuo
    1. Crescer separadamente as três transformants da . tumefaciens em 50 mL de meio LB contendo 50 μg/mL rifampicina e vetor-específico apropriado antibiótico por agitação durante a noite a 28 ° C.
    2. Pellet de culturas bacterianas durante a noite por centrifugação a 4.500 x g por 20 min. resuspenda o pellet em 1 L de tampão de infiltração para uma OD600 de 0.35 e incubam as suspensões no RT para 3h.
    3. Adicione 0,01% v/v de detergente (polissorbato 20) para cada suspensão. Misturar volumes iguais de suspensões bacterianas que contêm um dos três módulos, GAD65mut, ∆87GAD65mut ou eGFP 3' módulo, com 5' módulo e módulo de integrase.
    4. Inserir uma planta (beterraba vermelha de seis semanas de idade da planta, consulte a secção 1) no suporte. Inverter o titular e coloque em cima de um copo contendo o banho de infiltração (2L) para submergir as folhas na suspensão de infiltração.
      Nota: Certifique-se que todas as folhas estão completamente mergulhadas na suspensão bacteriana. Elevar o nível com a adição de suspensão de infiltração extra se necessário.
    5. O banho de infiltração com a planta submersa de transferência para a câmara de infiltração e fechá-lo. Ligue a bomba de vácuo e abra a válvula de admissão de vácuo na câmara de infiltração.
    6. Uma vez que a pressão na câmara de infiltração foi reduzido para 90 mbar, manter o vácuo de 3 min. lançamento o vácuo para 45 s. Uma vez que a câmara de infiltração retornou à pressão atmosférica, abrir a câmara e retirar a planta infiltrada do banho bacteriano.
    7. Retorno as plantas em uma câmara de crescimento sob condições normais.
    8. Recolher folhas de agroinfiltrated em dpi a expressão máxima, dependendo da proteína recombinante e congelá-los em nitrogênio líquido. Tecido de planta loja a-80 ° C.

3. análise da expressão da proteína recombinante

  1. Extração de proteínas solúveis totais (TSP)
    1. Moer a seringa ou vácuo infiltrada vermelhas folhas de beterraba e espinafre, recolhidas nas etapas 2.2.6 e 2.3.8, para pó fino em nitrogênio líquido, usando o almofariz e pilão. Transferir o pó para tubos de plástico de 15 mL e armazenar o material a-80 ° C.
    2. Adicione 900 µ l de tampão de extração (50 mM de fosfato de sódio pH 8.0, metabissulfito de sódio 20 mM) a 300 mg de pó de folha.
      Nota: A relação selecionada entre peso do tecido de planta (mg) para volume de tampão (µ l) é de 1:3.
    3. Homogeneizar a mistura vortexing por 1 min, em seguida, centrifugar a 30.000 x g durante 40 min a 4 ° C.
    4. Recolher o sobrenadante em um tubo limpo e guarde-a-80 ° C.
  2. Planta eGFP visualização e quantificação
    1. Carrega 100 µ l de cada extrato obtido eGFP expressando folhas, em três repetições de técnicas, em uma placa de 96 poços.
    2. Colocar a placa de 96 poços em um leitor de fluorescência e iniciar a medição. Use o filtro de 485/535 nm conjunto necessário para a deteção de fluorescência eGFP.
    3. Para a quantificação absoluta, no mesmo prato prepare uma curva de calibração quantidades diferentes de carregamento (62.5, 125, 500, 750 e 1.000 ng) de um eGFP purificado.
  3. Ácido Bicinchoninic (BCA) de ensaios para quantificação de TSP
    1. Mix 50 partes de Reagente A (Tabela de materiais) com 1 parte de Reagente B (Tabela de materiais). Prepare um volume suficiente de solução de trabalho de BCA fresco para as amostras para ser analisada e os padrões de calibração.
      Nota: O volume de solução de trabalho de BCA exigido para cada amostra é 1,9 mL. Para o procedimento padrão com 9 padrões (incluindo um espaço em branco), 17,1 mL de solução de trabalho de BCA é necessária.
    2. Pipete 0,1 mL de cada padrão (incluindo um espaço em branco) e extratos TSP em um tubo rotulado.
      Nota: Como padrões de calibração, preparar um novo conjunto de albumina de soro bovino padrões (BSA) no intervalo 10-1.000 μg/mL, de preferência usando o mesmo diluente de amostras, tais como água. O espaço em branco consiste em 0,1 mL do diluente usado para calibração padrão e preparação da amostra.
    3. Adicione 1,9 mL de solução de trabalho de BCA e misture bem. Cobrir os tubos e incubar a 37 ° C por 30 min.
    4. Legal os tubos RT. medir a absorvância a 562 nm das amostras dentro de 10 min.
      Nota: Mesmo em RT, continua o desenvolvimento de cor. Não será introduzido nenhum erro significativo se as medidas de absorvância de todos os tubos são feitas dentro de 10 min.
    5. Subtrai o valor de absorvância 562 nm do branco das leituras das normas e os extractos TSP.
    6. Sinopse o 562 em branco-corrigido nm leitura para cada norma na sua concentração. Determine a concentração de proteína de cada extrato.
  4. Execute Coomassie gel mancha como descrito anteriormente no Gecchele et al.8.
  5. Análise ocidental do borrão
    1. Efectuar a análise ocidental do borrão, conforme descrita em Gecchele et al.8.
    2. Após a separação eletroforética de proteínas, transferi-los para uma membrana de nitrocelulose, usando as técnicas padrão. Prepare a solução de bloqueio através da mistura de leite de 4% em tampão fosfato salino (PBS) de pH 7,4. Bloquear a membrana com 10 mL da solução de bloqueio no RT por 1h.
    3. Prepare o anticorpo primário de coelho em 1:10,000 para o anti-GAD65/67 e anti-LHCB2 e em 1: 20.000 para o anti-eGFP em 5 mL de solução de bloqueio com 0.1% de detergente. Incube a membrana com as soluções de anticorpo primário preparado durante a noite a 4 ° C ou para 4h no RT com agitação constante.
    4. Descartar o anticorpo primário e lave a membrana 3 vezes durante 5 min cada com bloqueio solução contendo 0,1% de detergente.
    5. Preparar a peroxidase de rábano (HRP)-conjugado anticorpo anticoelho no 1:10,000 em solução com detergente de 0,1% de bloqueio. Incube a membrana por 1,5 h em RT com agitação constante.
    6. Descartar o anticorpo secundário e lave a membrana 5 vezes por 5 min cada com PBS-T (PBS suplementado com 0,1% de detergente).
    7. Incube a membrana com uma solução de luminol comercialmente disponíveis seguindo as instruções do fabricante. Detecta o sinal, usando um sistema de imageamento de quimioluminescência.

4. a unidade de transformação de material

  1. Colheita da beterraba vermelha ∆87GAD65mut-expressando agroinfiltrated vácuo deixa no auge expressão (11 dpi) e congelá-los em nitrogênio líquido.
  2. Lyophilize as folhas congeladas por 72 h a-50 ° C e 0,04 mbar. Armazená-los a-80 ° C.
  3. Triturar as folhas a pó fino e armazená-lo em RT em um recipiente selado com gel de silicone para eliminar a umidade.

5. análise de integridade de simulação e célula gástrica da digestão

  1. Simulação de digestão gástrica
    1. Pesar 100 mg de folhas de beterraba vermelha liofilizado moído e ressuspendê-lo em 6 mL de PBS (pH 7,4).
    2. Ajuste o pH da amostra a 2, com 6 M de HCl.
    3. Adicione pepsina 4 mg/mL de suínos mucosa gástrica de HCl para obter uma concentração de pepsina final de 1 mg/mL ou um rácio de 01:20 de proteínas solúveis totais de 10 milímetros. Agite a amostra a 37 ° C durante 120 min.
    4. Ajuste as amostras de pH 8 com 1 M NaOH para inativar a pepsina.
    5. Centrifugue a 750 alíquotas µ l de cada amostra a 20.000 x g por 20 min a 4 ° C. Recolher separadamente o sobrenadante e ressuspender o precipitado em um volume sobrenadante do tampão de carregamento (1,5 M Tris HCl, pH 6,8, 4% de 2-Mercaptoetanol, 15% de glicerol e 3% SDS).
      Nota: Por razões de saúde e segurança, use luvas e trabalhar sob a coifa para a preparação da amostra.
    6. Analise tanto o sobrenadante e ressuspenso pelo borrão ocidental análise8.
  2. Análise de integridade celular
    1. Preparar duas amostras de 100 mg de folhas de beterraba vermelha liofilizado moído e ressuspender ambos em 6 mL de PBS (pH 7,4).
    2. Ajuste o pH de somente uma amostra de 2, com 6 M HCl. Shake ambas as amostras a 37 ° C durante 120 min.
    3. Centrifugue a 750 alíquotas µ l de cada amostra a 20.000 x g por 20 min a 4 ° C. Recolher separadamente o sobrenadante e ressuspender o precipitado em um volume sobrenadante do tampão de carregamento.
    4. Analise tanto o sobrenadante e ressuspenso por análise ocidental do borrão.

6. Bioburden ensaio

  1. Pese 100 mg de folhas de beterraba vermelha liofilizado. Ressuspender o pó em 8 mL de PBS estéril (pH 7,4) e o vórtice por 1 min.
  2. Prepare o meio LB sem antibióticos ou contendo (i) 50 rifampicina µ g/mL, (ii) 50 µ g/mL cada de rifampicina e carbenicilina, (iii) 50 µ g/mL cada de rifampicina e canamicina ou (iv) 50 µ g/mL cada de rifampicina, carbenicilina e canamicina.
  3. Placa 1 mL de cada folha liofilizado homogeneizado em um dos 5 LB mídia seletiva.
  4. Incubar as placas todas por 3 dias a 28 ° C.
  5. Conte as colônias de Agrobacterium crescidas em cada prato.
  6. Calcular e definir a carga bacteriana residual, como o número de unidades formadora de Colônia (UFC) por mL de homogeneizado a folha liofilizado (UFC/mL).

7. extração de metabólito

  1. Extração de metabólito primário
    1. Pesa 30 mg de-80 ° C armazenados, vácuo agroinfiltrated ∆87GAD65mut-expressando pó de folha de beterraba vermelha em um tubo de plástico de 2 mL.
    2. Adicione 750 µ l de frio (v/v) de 70/30 metanol/clorofórmio e vórtice por 30 s. Incubar a-20 º C por 2 h.
      Nota: Todos os solventes e aditivos devem ser de grau LC-MS.
    3. Adicione 600 µ l de água fria e centrifugar 17.900 x g a 4 ° C por 10 min. coletar e transferir a fase hidroalcoólica superior para um novo tubo de 2 mL. Descarte a fase inferior clorofórmico e a interfase.
    4. Colocar as amostras em um vácuo concentrador para 3h para evaporar o solvente.
    5. Dissolva a pelota Obtida de passo 7.1.4 em 300 µ l de 50/50 (v/v) acetonitrila/água e proceda à sonicação das amostras por 3 min.
    6. Passar as soluções 0,2 μm filtros de membrana e colocá-los em um transparente fixo 300 µ l inserir tubos de vidro.
  2. Extração de metabólito secundário
    1. Pesar de 300 mg de-80 ° C armazenados, vácuo agroinfiltrated ∆87GAD65mut-expressando pó de folha de beterraba vermelha em um tubo plástico de 15 mL.
    2. Adicionar 3 mL de metanol, vórtice por 30 s e proceda à sonicação em 40 kHz durante 15 min.
      Nota: Todos os solventes e aditivos devem ser de grau LC-MS.
    3. Centrifugar as amostras a 4.500 x g a 4 ° C por 10 min e transferir os sobrenadantes para novos tubos de 15 mL.
    4. Diluir 100 µ l de extrato 1:3 (v/v) com água e passe a solução através de um filtro de membrana de 0,2 μm.
    5. Colocar a solução em um tubo transparente em fixo 300 µ l vidro de inserção.
  3. Extração de lipídios polares
    1. Pesar 200 mg de-80 ° C armazenados, vácuo agroinfiltrated ∆87GAD65mut-expressando pó de folha de beterraba vermelha em um tubo plástico de 15 mL.
    2. Adicionar 200 µ l de água e, em seguida, 2 mL de metanol e ficar no gelo por 1h.
      Nota: Todos os solventes e aditivos devem ser de grau LC-MS.
    3. Vórtice por 30 s e proceda à sonicação em 40 kHz durante 15 min.
    4. Centrifugar as amostras a 4.500 x g a 4 ° C por 25 min. coleta e transferência a fase de clorofórmio para tubos de 2 mL. Descarte a fase superior hidroalcoólico e a interfase.
    5. Colocar as amostras em um vácuo concentrador para 3h para evaporar o solvente.
    6. Dissolva a pelota Obtida de passo 7.3.5 com 600 µ l de metanol.
    7. Diluir 100 µ l de extrato 1:5 (v/v) com metanol e transferir a solução através de um filtro de membrana de 0,2 μm.
    8. Colocar a solução em um tubo transparente em fixo 300 µ l vidro de inserção.

8. análise de espectrometria de massa de cromatografia líquida e processamento de dados

  1. Configure o sistema de LC-MS, conforme recomendado pelo fornecedor.
    Nota: A seção de LC consiste de um mostruário juntamente com HPLC equipada com uma coluna de guarda de C18 (75 x 2.1 mm, partícula tamanho 5 µm) em frente a uma coluna C18 (150 x 2.1 mm, partícula tamanho 3 µm) para a análise de metabólitos secundários e lipídios polares , Considerando que, com uma coluna de guarda HILIC (7,5 x 2.1 mm, 3 µm) na frente de uma coluna HILIC (150 x 2.1 mm, partícula tamanho 2,7 µm). O MS é um espectrômetro de massa ion trap fornecido com uma ionização electrospray (ESI) ou fontes de ionização química (APCI) uma pressão atmosférica.
  2. Prepare os solventes adequados para os gradientes HPLC. Para análise de metabólito primário, use formiato de amônio 20 mM como A solvente; acetonitrilo de 95%, 5% de água além de formiato de amônio 10 mM como solvente B. Para análise de metabólito secundário, use água + 0,05% de ácido fórmico (A) e acetonitrilo + 0,05% de ácido fórmico (B). Para análise de lipídios polares, use água mais 0,05% de ácido fórmico (A) e 100% acetonitrila (B).
    Nota: Os solventes e aditivos devem ser o grau de LC-MS.
  3. Use os gradientes relatados na tabela 1 para a eluição do metabólito. Conjunto o fluxo taxa em 0,2 mL/min. injectar 10 µ l de cada amostra para metabólitos secundários e lipídios polares, Considerando que injetar 5 µ l de metabólitos primários.
  4. Prepare uma amostra de controle de qualidade (QC) misturando partes iguais de amostras diferentes para ter uma mistura representativa de cada condição experimental. Analise a amostra QC durante o experimento para monitorar a eficiência do instrumento. Especificamente, inserir uma análise de amostra QC depois de cada amostra-lote 10.
  5. Randomize as amostras para evitar efeitos orientado para o instrumento.
  6. Após 9 análises, inserir uma coluna limpeza método e uma análise em branco imediatamente após.
    Nota: Execute um gradiente lento entre os dois solventes com uma eluição isocrática em alta porcentagem do solvente mais forte. O espaço em branco é composto por uma injeção de um puro metanol: água (50/50, v/v) para melhorar a reprodutibilidade do tempo de retenção na análise seguinte.
  7. Configure o instrumento para adquirir os espectros de massa em modos alternativos de ionização positiva e negativa, usando os parâmetros listados na tabela 2.
    Nota: Outros parâmetros dependem da plataforma específica.
  8. Execute o processamento de dados seguinte conforme explicado no Dal Santo et al.9.

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Resultados

Neste trabalho, é apresentado o fluxo de trabalho para o desenvolvimento de uma vacina oral em tecidos vegetais comestíveis. O foco deste trabalho é a expressão de uma proteína do alvo em uma espécie de planta comestível do anfitrião e a caracterização da vacina oral potencial.

A primeira etapa envolveu a avaliação da adequação da tecnologia de expressão baseada em vírus planta para a produção de proteínas recombinantes em siste...

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Discussão

Neste estudo mostramos análise preliminar para a concepção de uma vacina oral contra o candidato para diabetes auto-imune. A proteína do alvo para este experimento foi uma forma mutante do humano 65 kDa glutamato descarboxilase, que produção e funcionalidade são facilmente detectáveis e mensuráveis12. Sua expressão em tecidos diferentes vegetais comestíveis foi mediado por vetores5, que mediar um elevado nível de produção de proteínas recombinantes em um período muito curto...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo projeto comum "O uso de plantas para a produção de uma vacina comestível de diabetes auto-imune (eDIVA)" (projeto ID: 891854) financiado pela Universidade de Verona, no âmbito da chamada de 2014.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0.2-μ m Filtros de membrana Minisart RC4Sartorius-Stedim17764
2– mercaptoetanolSigmaM3148Tóxico; 4 % para fazer tampão de carga com glicerol, SDS e Tris-HCl
Ácido 4-morfolineetanossulfônico (MES)SigmaM8250pH 5,5
Placa de 96 poçosSarstedt833924
Ácido acéticoSigma27221
Acetonitrila corrosiva LC-MS grauSigma34967
AcetosiringonaSigmaD134406Tóxico – 0,1 M estoque em
DMSO Agar Bacteriological GradeApplichemA094915 g/L para fazer meio LB (pH 7,5 com NaOH) com extrato de levedura, NaCl e Triptona
Formiato de amônioSigma70221
Anti-eGFP anticorpoABCamab290
Anti-GAD 65/67 anticorpoSigmaG5163
Anticorpo anti-LHCB2AgriseraAS01 003
Brilliant Blue R-250SigmaB7920
C18 ColumnGrace    -Alltima HP C18 (150 mm x 2,1 mm; 3 μ m) Coluna
C18 Guarda Coluna Grace    -Alltima HP C18 (7,5 mm x 2,1 mm; 5 μ m) Guarda  Coluna
CalMag GrowerPeter Excel15-5-15Fertilizante
Carpenicilina dissódicaDuchefa BiochemieC0109
Sistema de imagem de quimioluminescênciaBioRad1708370ChemiDoc Touch Imaging System
ClorofórmioSigmaC2432
DetergenteSigmaP5927Polissorbato 20
Leitor de fluorescênciaPerkin-Elmer  1420-011VICTOR Multilabel Counter
Ácido fórmico LC-MS grau Sigma94318
GlicerolSigmaG551615% para fazer tampão de carregamento com Tris-HCl, SDS e 2– mercaptoetanol
GoTaq G2 polimerasePromegaM7841
HClSigmaH1758Corrosive
HILIC ColumnGrace    -Ascentis Express HILIC (150 mm x 2,1 mm; tamanho das partículas 2,7 μ m) Coluna
HILIC Guard ColunaGrace    -Vision HT HILIC (7,5 mm x 2,1 mm; 3 μ m) Guarda  Coluna
Hardradish peroxidase (HRP)-conjugado anti-coelho anticorpoSigmaA6154Não congele/descongele muitas vezes
HPLC AutosamplerBeckman Coulter    -System Gold 508 Autosampler
HPLC System BeckmanCoulter    -Sistema Gold 128 Módulo de Solvente HPLC
IsopropanolSigma24137
Sulfato de canamicinaSigmaK4000
KCl tóxico KClP95412 g / L com NaCl, Na2< / sub>HPO4< / sub> e KH2< / sub>PO4< / sub> para fazer PBS
KH2< / sub>PO4< / sub> SigmaP97912,4 g/L com NaCl, Na2HPO4 e KCl para fazer
Luminol de Buffer de Carga
PBS Ge HealthcareRPN2232Prepare a solução usando o kit comercial ECL Prime Western Blotting System
Lyophilizator5PascalLIO5P0000DGT
Mass SpectometerBruker Daltonics  -Bruker Esquire 6000; o espectrômetro de massa foi equipado com uma fonte ESI e o analisador era uma armadilha de íons
MetanolSigma32213
MgSO4SigmaM7506
Solução de bloqueio de leiteRistora    -3 % em PBS
Na2HPO4SigmaS7907Utilizar com NaH2PO4 para fazer tampão de fosfato de sódio
NaClSigmaS301480 g/L com KCl, Na2HPO4 e KH2PO4 para fazer PBS; 10 g/L para fazer meio LB (pH 7,5 com NaOH) com extracto de levedura, Triptona e Ágar Grau Bacteriológico
NaH2PO4SigmaS8282  Use com Na2HPO4 para fazer tampão de fosfato de sódio; 14,4 g/L para fazer PBS
NaOHSigmaS8045
Membrana de nitrocelulaseGe Healthcare10600002
Pepsina da mucosa gástrica suínaSigmaP7000
ECLGE HealthcareRPN2235Material sensível à luz
Bomba Prensa a vácuoVWR111400000098
Reagente ASigmaB9643Use 50 partes deste reagente com 1 parte do reagente B para preparar a solução de trabalho BCA
Reagente BSigmaB9643Use 1 parte deste reagente com 50 partes do reagente A para preparar a solução de trabalho BCA
RifampicinaDuchefa BiochemieR0146Tóxico – 25 mg/mL estoque em DMSO
SDS (Dodecil sulfato de sódio)SigmaL3771Estoque descartável, corrosivo-10%; 3% para fazer tampão de carregamento com Tris-HCl, Glicerol e 2– mercaptoetanol
Metabissulfito de sódioSigma7681-57-4
Sistema SonicatorSoltec090.003.0003Sonica® 2200 MH; frequência 40 khz
SeringaTerumo    -
Transparente fixo 300-µ L insira tubos de vidroThermo Scientific11573680
Trizma BaseSigmaT1503Ajuste o pH com 1N HCl para fazer o tampão Tris-HCl, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) para fazer o tampão de carregamento com SDS, Glicerol e 2– mercaptoetanol
TriptonaFormediumTRP0310 g/L para fazer LB médio (pH 7,5 com NaOH) com extrato de levedura, NaCl e ágar Concentrador de vácuo de grau bacteriológico
Heto3878 F1-3Sistema Speed-vac
Água LC-MS grau Sigma39253
Extrato de leveduraSigmaY13335 g/L para fazer meio LB (pH 7,5 com NaOH) com triptona, NaCl e ágar Grau Bacteriológico
tóxica flamável a solução de Substrato de peroxidase

Referências

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