Summary
Ce protocole présente une méthode pour la décellularisation et la formation suivante d'hydrogel des garnitures de graisse mammaire murine suivant l'irradiation ex vivo.
Abstract
La radiothérapie est une thérapie pour les patients atteints d'un cancer du sein triple négatif. L'effet du rayonnement sur la matrice extracellulaire (ECM) du tissu sain de sein et son rôle dans la répétition locale au site primaire de tumeur sont inconnus. Ici nous présentons une méthode pour la décellularisation, la lyophilisation, et la fabrication des hydrogels d'ECM dérivés des garnitures de graisse mammaire murine. Les résultats sont présentés sur l'efficacité du processus de décellularisation, et des paramètres rhéologiques ont été évalués. Les cellules de cancer du sein GFP- et luciferase-étiquetées encapsulées dans les hydrogels ont démontré une augmentation de la prolifération des hydrogels irradiés. Enfin, la coloration conjuguée de phalloidin a été employée pour visualiser l'organisation de cytosquelette des cellules encapsulées de tumeur. Notre objectif est de présenter une méthode de fabrication d'hydrogels pour l'étude in vitro qui imitent l'environnement in vivo des tissus mammaires et sa réponse au rayonnement afin d'étudier le comportement des cellules tumorales.
Introduction
Le cancer se caractérise par une prolifération excessive de cellules qui peuvent échapper à l'apoptose et métastasent également des sites éloignés1. Le cancer du sein est l'une des formes les plus courantes chez les femmes aux États-Unis, avec environ 266 000 nouveaux cas et 40 000 décès en 20182. Un sous-type particulièrement agressif et difficile à traiter est le cancer du sein triple négatif (TNBC), qui manque de récepteur d'oestrogène (ER), de récepteur de progestérone (PR), et de facteur de croissance épidermique humain (HER2). La radiothérapie est couramment utilisée dans le cancer du sein pour éliminer les cellules tumorales résiduelles après la tumorectomie, mais plus de 13% des patients de TNBC éprouvent toujours la répétition au site primaire de tumeur3.
On sait que la radiothérapie est efficace pour atténuer les métastes et les récidives parce que la combinaison de la tumorectomie et de la radiothérapie entraîne la même survie à long terme que la mastectomie4. Cependant, il a été récemment démontré que le traitement de rayonnement est associé à la répétition locale au site primaire de tumeur dans les arrangements immunocompromis5,6. En outre, il est bien connu que le rayonnement modifie la matrice extracellulaire (ECM) du tissu normal en induisant la fibrose7. Par conséquent, il est important de comprendre le rôle des changements induits par rayonnement DMC dans la dictée du comportement des cellules tumorales.
Les tissus décellularisés ont été utilisés comme modèles in vitro pour étudier la maladie8,9. Ces tissus décellularisés préservent la composition d'ECM et récapitulent le complexe in vivo ECM. Ce tissu décellularisé ECM peut être traité et digéré pour former des hydrogels ECM reconstitués qui peuvent être utilisés pour étudier la croissance cellulaire et la fonction10,11. Par exemple, les hydrogels injectables dérivés du lipoaspirate humain décellularisé et du tissu myocardique ont servi de méthodes non invasives d'ingénierie tissulaire, et un hydrogel dérivé du tissu pulmonaire porcin a été utilisé comme méthode in vitro de test l'attachement et la viabilité des cellules souches mésenchymales12,13,14. L'effet des dommages normaux de rayonnement de tissu sur des propriétés d'ECM, cependant, n'a pas été étudié.
Les hydrogels dérivés de l'ECM ont le plus grand potentiel d'étude in vitro des phénomènes in vivo. Plusieurs autres matériaux ont été étudiés, y compris le collagène, la fibrine et le matrigel, mais il est difficile de récapituler synthétiquement la composition de l'ECM13. Un avantage de l'utilisation d'hydrogels dérivés de l'ECM est que l'ECM contient les protéines et les facteurs de croissance nécessaires pour un tissu particulier14,15. L'irradiation du tissu normal pendant la tumorectomie provoque des changements significatifs à l'ECM, et les hydrogels ECM-dérivés peuvent être employés pour étudier cet effet in vitro. Cette méthode pourrait conduire à des modèles in vitro plus complexes et plus précis de la maladie.
Dans cette étude, nous avons soumis les coussinets de graisse mammaire murine (MFP) au rayonnement ex vivo. Les MFP ont été décellularisés et transformés en solution prégel. Les hydrogels ont été formés avec les cellules 4T1 incorporées, une ligne de cellules murine de TNBC. Les propriétés rhéologiques du matériel d'hydrogel ont été examinées, et la dynamique de cellules de tumeur ont été évaluées dans les hydrogels. Les hydrogels fabriqués à partir des MFPs irradiés ont amélioré la prolifération de cellules de tumeur. De futures études incorporeront d'autres types de cellules pour étudier les interactions cellules-cellules dans le contexte de la récidive du cancer après la thérapie.
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Protocol
Les études sur les animaux ont été réalisées conformément aux lignes directrices et protocoles institutionnels approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Vanderbilt.
1. Préparation et irradiation ex vivo des MFP
- Sacrifier les souris nu/Nu athymiques (8 à 10 semaines) en utilisant l'asphyxie au CO2 suivie d'une luxation cervicale.
- Nettoyer la peau à l'aide de 70 % d'éthanol.
- Recueillir des coussinets de graisse mammaire (MPF) à l'aide de souris sacrifiées à l'aide de ciseaux et de forceps pré-stérilisés dans un tube conique de 15 ml contenant des milieux RPMI complets (RPMI complété par 1 % de pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum bovin fœtal) (voir le Tableau des matériaux ).
- Irradier les échantillons à 20 Gy à l'aide d'une source de césium.
- Apportez les MFP irradiés et complétez les supports RPMI dans un cabinet de biosécurité. Les médias dépendront de la lignée cellulaire à cultiver dans l'hydrogel final. Remplir la vaisselle de 6 cm ou 10 cm avec suffisamment de supports pour submerger les MFP. Pour la vaisselle de 6 cm, utiliser 8 ml de support et pour 10 cm de vaisselle, utiliser 20 ml de support.
- Incuber dans un incubateur de CO2 de 37 oC/5 % pendant deux jours. La durée de l'incubateur peut être ajustée.
- Rincer les tissus dans la saline tamponnée par le phosphate (PBS), effacer l'excès d'humidité et placer les MFP dans des tubes coniques de 15 ml pour le stockage à -80 oC jusqu'à la décellularisation. Cette étape de congélation facilite l'étape de décellularisation et l'échantillon doit être gelé même si les prochaines étapes sont autrement prêtes.
2. Décellularisation (adaptée des références12,16,17)
REMARQUE : Cette procédure a été adaptée des méthodes précédemment éditées se concentrant sur la décellularization adipose, qui a inclus le détergent ionique de déoxycholate de sodium plutôt que le sulfate de dodecyl de sodium pour enlever l'ADN efficacement12,16 , 17.
- Le jour1, retirer les MFP congelés de -80 oC et décongeler à température ambiante.
- Une fois décongelés, sécher brièvement les MFP sur une lingette délicate. Peser les MFP à l'aide d'une échelle analytique.
- À l'aide d'une paire de forceps avec des ciseaux ou un scalpel, diviser le tissu en échantillons de 3 mm x 3 mm x 3 mm pour l'étude de l'ECM intact et du tissu restant pour la production d'hydrogel.
REMARQUE : Le nombre d'échantillons dépend du nombre de méthodes d'essai, par exemple la collecte de deux échantillons est décrite ci-dessous : une pour l'incorporation de paraffine (étape 2.5) et une pour la congélation dans le milieu d'incorporation cryostat, si désiré (voir le tableau des matériaux et l'étape 2.6). - Pesez les tissus. Si vous encastrez dans la paraffine pour la section, continuez à l'étape 2.5. Si la congélation dans le milieu d'incorporation de cryostat pour la section, continuez à l'étape 2.6.
- Dans une hotte chimique, immerger le tissu dans une formaline tamponnée neutre de 10 % (NBF) (voir le Tableau des matériaux)pendant 24 h à 4 oC. Laver 3 fois en PBS pendant 5 min chacun. Immerger le tissu dans 30% de saccharose pendant 48 h à 4 oC.
- Pesez le tissu maintenant que cette pièce a été enlevée. Continuer à l'étape 2.6.
- Dans une hotte chimique, placer les morceaux de MFP dans une cassette étiquetée préparée avec un milieu d'intégration cryostat. Ajouter plus de cryostat en incorporant le milieu pour couvrir le tissu.
- Placer la cassette dans un bécher de 2-méthylbutane (voir le tableau des matériaux)qui est pré-refroidi avec de l'azote liquide. Le bécher devrait avoir assez de 2-méthylbutane pour couvrir le fond, mais pas assez pour submerger la cassette parce que le milieu d'intégration cryostat ne devrait pas toucher le 2-méthylbutane. Laisser la cassette s'asseoir dans le 2-méthylbutane jusqu'à ce que le cryostat encastré milieu gèle et devienne opaque.
- Envelopper la cassette dans du papier d'aluminium, l'étiqueter et laisser à -80 oC jusqu'à ce qu'il soit utilisé pour la section.
REMARQUE : Les tissus placés immédiatement dans le milieu d'incorporation de cryostat ont été sectionnés à 5 m tandis que les tissus incubés dans le saccharose ont été sectionnés à 30 m pour retenir la morphologie d'adipocyte.
- Utilisez des forceps pour masser manuellement le tissu restant.
REMARQUE : Les morceaux de tissu peuvent également être placés dans 10% NBF pendant 24-48 h, rincés dans le PBS, et laissés dans l'éthanol de 70% jusqu'à l'intégration dans la paraffine. Après l'incorporation, des sections de 5 m peuvent être utilisées pour la coloration de l'hématoxylin et de l'éosine (H et E) (voir la section 7 ci-dessous). - Placez les MFP dans des plats de 6 cm avec 5 mL 0,02 % de trypsine/0,05 % de solution EDTA. Incuber à 37 oC pendant 1 h. Vaporiser et essuyer les plats avec 70 % d'éthanol avant de les placer dans l'incubateur.
- Utilisez des passoires de 0,7 mm pour laver les MFP avec de l'eau déionisée (DI) en versant de l'eau sur le tissu trois fois. Utilisez des forceps pour masser manuellement le tissu entre les lavages.
- Tissu sec brièvement sur une tâche délicate essuyer et peser. Placer les tissus dans un bécher pré-autoclave d'une barre d'agitation de taille appropriée. Couvrir les tissus de 60 ml de 3 % t-octylphenoxypolyethoxyethanol (voir le tableau des matériaux)par 1 g de tissu et remuer pendant 1 h à température ambiante. Utiliser un minimum de 20 ml.
- Verser le tissu et le contenu dans une passoire. Rincer le bécher avec de l'eau DI et verser sur les tissus. Répétez deux fois de plus. Utilisez des forceps pour masser manuellement le tissu entre les rince-à-tout.
- Tissu sec brièvement sur une tâche délicate essuyer et peser. Placer les tissus et remuer les barres dans les mêmes béchers, et couvrir de 60 ml d'acide désoxycholique de 4 % par 1 g de tissu. Remuer pendant 1 h à température ambiante. Utiliser un minimum de 20 ml.
- Verser le tissu et le contenu dans une passoire en maille. Rincer le bécher avec de l'eau DI et verser sur les tissus. Répétez deux fois de plus. Utilisez des forceps pour masser manuellement le tissu entre les rince-à-tout.
- Tissu sec brièvement sur une tâche délicate essuyer et peser.
- Placer les tissus dans le même bécher avec de l'eau d'Inde fraîche complétée de 1% pénicilline-streptomycine. Couvrir étroitement de film de paraffine. Laisser la nuit à 4 oC.
- Laver les passoires et les béchers pour les utiliser le lendemain.
- Le jour2, égoutter le contenu du bécher dans une passoire. Tissu sec brièvement sur une tâche délicate essuyer et peser.
- Placez les MFP dans le même bécher avec une barre d'agitation de taille appropriée. Couvrir de 60 ml 4 % d'éthanol/0,1 % de solution d'acide peracétique par 1 g de tissu. Utiliser un minimum de 20 ml. Remuer pendant 2 h à température ambiante.
- Verser le tissu et le contenu dans une passoire de 0,7 mm. Utilisez des forceps pour masser manuellement le tissu. Remettre le contenu dans le bécher. Laver les tissus en le recouvrant de 60 ml de 1x PBS par 1 g de tissu. Utiliser un minimum de 20 ml. Remuer pendant 15 min à température ambiante. Répétez une fois.
- Verser le tissu et le contenu dans une passoire de 0,7 mm. Utilisez des forceps pour masser manuellement le tissu. Remettre le contenu dans le bécher. Laver les tissus en le recouvrant de 60 ml d'eau DI par 1 g de tissu. Utiliser un minimum de 20 ml. Remuer pendant 15 min à température ambiante. Répétez une fois.
- Tissu sec brièvement sur une tâche délicate essuyer et peser. Verser le tissu et le contenu dans une passoire. Utilisez des forceps pour masser manuellement le tissu.
- Remettre le contenu dans le bécher. Couvrir les tissus de 60 ml de 100 % de n-propanol par 1 g de tissu. Utiliser un minimum de 20 ml. Remuer pendant 1 h à température ambiante.
- Tissu sec brièvement sur une tâche délicate essuyer et peser. Verser le tissu et le contenu dans une passoire de 0,7 mm. Utilisez des forceps pour masser manuellement le tissu.
- Remettre le contenu dans le bécher. Laver les tissus en le recouvrant de 60 ml d'eau DI par 1 g de tissu. Utiliser un minimum de 20 ml. Remuer pendant 15 min à température ambiante. Répétez trois fois.
- Verser le tissu et le contenu dans une passoire. Répétez les étapes 2.3-2.6 pour recueillir des morceaux de tissu pour l'incubation du saccharose et la congélation dans le milieu d'intégration cryostat.
- Tissu sec brièvement sur une tâche délicate essuyer et peser. Placer dans un tube étiqueté de 15 ml. Congeler à -80 oC pendant la nuit.
3. Lyophilisation
- Retirer les tubes de 15 ml de -80 oC et les placer sur de la glace sèche. Conserver les échantillons congelés sur de la glace sèche jusqu'à ce qu'il soit sur le lyophilisateur.
- Retirer les bouchons. Utilisez un élastique pour attacher une lingette délicate sur le dessus pour couvrir l'ouverture. Mettre des échantillons sur le lyophiliseur pendant au moins 2 jours.
- Retirer les échantillons du lyophilisateur et placer les tubes sur la glace sèche. Enlever les lingettes délicates de tâche pèsent chaque échantillon sur une échelle analytique. Fixer les bouchons et les placer à -80 oC pendant la nuit.
4. Fraisage
- Remplir un récipient peu profond d'azote liquide. Retirer les échantillons du congélateur de -80 oC. Peser chaque MFP lyophilisé.
- Placer un échantillon dans le mortier. Utilisez un gant cryogénique pour tenir le mortier dans l'azote liquide.
- Utilisez un pilon attaché à une perceuse de poche pour moudre l'échantillon. Moudre à intervalles de 1 min pour vérifier les progrès et retirer la main gantée de l'azote liquide. Moulin pour un minimum de 5 min.
- Répéter l'opération pour tous les échantillons. Vaporiser et essuyer le mortier et le pilon avec de l'éthanol entre chaque échantillon.
- Conserver les échantillons en poudre dans des tubes de 15 ml à -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient prêts à l'emploi.
REMARQUE : Les échantillons peuvent être utilisés immédiatement ou stockés pendant la nuit.
5. Formation d'hydrogel
- S'il est entreposé à -80 oC pendant la nuit, retirer et décongeler à température ambiante. Pendant la décongélation, calculer le poids nécessaire de la pepsine (voir tableau des matériaux)et le volume d'acide chlorhydrique (HCl) nécessaire pour chaque échantillon qui donne lieu à une solution avec 1 % de poudre d'échantillon w/v et 0,1 % de pepsine w/v en 0,01 M HCl. Ajouter la pepsine au HCl pour former une solution pepsin-HCl.
- Ajouter la poudre d'échantillon et la solution pepsin-HCl à un tube de 15 ml. Ajouter une petite barre à remuer et remuer pendant 48 h.
- Placer les tubes sur la glace pendant 5 min. Calculer le volume nécessaire de 10x PBS nécessaire pour chaque échantillon qui aboutit à une solution avec une concentration de 1x PBS. Ajouter le volume approprié de 10x PBS à chaque tube.
- Ajoutez 10 % v/v 0,1 M NaOH à chaque solution pour atteindre le pH 7,4. Utilisez un papier pH pour tester individuellement.
REMARQUE : La solution de gel peut être stockée à 4 oC pendant une semaine.
6. Encapsululating cellules dans les hydrogels
- Utilisation de cellules étiquetées GFP et luciferase
- À l'aide de la solution de gel pH 7.4, resuspendre les cellules 4T1 étiquetées GFP et luciferase à une concentration de 500 000 ou 1 000 000 de cellules/mL de solution de gel. Ajouter 16 l de solution gel-cellule à chaque puits d'une glissière de chambre de 16 puits. Incuber pendant 30 min à 37 oC.
- Ajoutez 100 l de supports RPMI complets à chaque puits. Poursuivre l'incubation pendant 48 h à 37 oC. Les cellules étiquetées GFP et luciferase peuvent être visualisées à l'aide de la microscopie à la fluorescence à 0 heure, 24 heures et 48 heures après la gélation.
REMARQUE : La prolifération cellulaire peut être mesurée pour les cellules 4T1 étiquetées GFP et luciferase utilisées ici en ajoutant (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxyl acide potassium sel (voir le tableau des matériaux)aux puits pendant 10 min et l'imagerie par bioluminescence à l'aide d'un système d'imagerie par bioluminescence (voir Tableau des matériaux). Après la formation image de bioluminescence, le cytosquelette peut être visualisé (voir la section 10).
- Utilisation de cellules non étiquetées
- À l'aide de la solution de gel pH 7.4, resuspendre les cellules 4T1 non étiquetées à une concentration de 500 000 ou 1 000 000 de cellules/mL de solution de gel. Ajouter 16 l de solution gel-cellule à chaque puits d'une glissière de chambre de 16 puits et une plaque de 96 puits. Incuber pendant 30 min à 37 oC.
- Ajouter 100 l de support à chaque puits. Poursuivre l'incubation pendant 48 h à 37 oC.
REMARQUE : La viabilité cellulaire peut être mesurée (voir la section 11). La glissière de chambre de 16 puits peut être utilisée pour l'imagerie, et la plaque de 96 puits peut être utilisée pour la quantification.
7. Coloration H et E
- Pour les tissus intégrés à la formaline, les lames immergées contenant des sections de 5 m deux en xylène à 100 % (5 à 10 min) pour la désaffinalisation. Réhydratez-vous en submergeant 100 %, 95 %, 85 % et 70 % d'éthanol pendant 5 min chacun, suivi de l'eau DI pendant 5 min. Continuer à l'étape 7,6.
- Pour les sections de tissus congelés, prendre les sections immédiatement du congélateur et les immerger dans 10 % de FNB pendant 10 min. Laver en 1x PBS trois fois pendant 5 min chacun. Rincer à l'eau pendant 5 min.
- Tainer les noyaux avec de l'hématoxyline pendant 3 min. Rincer à l'eau courante du robinet.
- Différencier en trempant 1 à 2 fois dans 0,3 % d'alcool acide (0,3 % de HCl dans 70 % d'éthanol). Rincer à l'eau courante du robinet pendant 5 min.
- Ajouter l'agent rougissant pendant 30 s. Rincer à l'eau courante du robinet pendant 5 min. Submergez-les à 95 % d'éthanol pendant 30 s.
- Incuber avec de l'éosine pendant 90 s à température ambiante. Déshydrater en 3 changements de 100% d'éthanol pendant 5 min chacun.
- Immerger deux fois dans 100% xylène pendant 5 min chacun. Ajouter le distyrene-plasticiser-xylène (dPX0 support de montage à la diapositive et ajouter un bordereau. Laissez-le guérir toute la nuit avant l'imagerie.
8. 1-([Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol coloration
- Préparer une solution 1-([Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol.
- Ajouter 0,5 g de poudre de 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol à un bécher avec 100 ml de propylène glycol. Chauffer jusqu'à 95 à 100 oC en remuant pendant au moins 30 min. Empêcher la température de dépasser 100 oC.
- Retirer le bécher du feu et laisser refroidir légèrement. Verser la solution dans le papier filtre qualitatif de grade 4 pour enlever les particules résiduelles.
REMARQUE : La solution peut être stockée à température ambiante et doit être filtrée par un filtre à seringues de 0,45 m immédiatement avant de les tacher.
- Tachez les sections de tissus congelés.
- Retirer les glissières du congélateur à -80 oC et sécher à l'air pendant 30 min. Pré-refroidir 10 % NBF à -20 oC pendant 30 min dans un bocal Coplin. Fixer les glissières à température ambiante pendant 10 min. Laver dans l'eau DI 3 fois pendant 5 min chacun.
- Retirer l'excès d'eau à l'aide d'une lingette délicate avant de plonger dans le propylène glycol 2 fois pendant 5 min chacun. Retirer les lames du propylène glycol. Ne pas rincer.
- Placer les glissières dans la seringue filtrée Huile Rouge O solution de coloration pendant 3 h à température ambiante.
- Différencier en plaçant des lames dans 85 % de propylène glycol pendant 5 min. Rincer les échantillons dans le PBS deux fois pendant 5 min chacun.
- Tergissement des échantillons d'hématoxyline pendant 30 s. Laver dans l'eau courante du robinet pendant 5 min, puis placer les glissières dans l'eau DI.
- Monter les échantillons à l'aide d'un milieu de montage à base d'aqueux et permettre aux médias de sécher pendant la nuit avant l'imagerie.
9. Rhéologie
- Apportez des solutions de prégel de l'étape 5.4 au rhéomètre sur la glace.
- Fixer un bras et une plaque de 25 mm au rhéomètre. Ouvrez le logiciel de rhéologie sur l'ordinateur connecté au rhéomètre.
- Effectuez la cartographie de rotation et déterminez l'écart zéro. Levez le bras une fois terminé.
- Pipette 500 l de prégel sur la plaque. Baisser le bras jusqu'à ce que la solution prégel occupe complètement l'espace entre la plaque et le bras. Soyez prudent parce que l'abaissement du bras au-delà de ce point se traduira par une solution pré-gel se déversant sur le côté.
- Effectuer un balayage de fréquence sur la solution pré-gel de 0,1 à 100 Hz après qu'il soit resté à 37 oC pendant 30 min.
- Levez le bras de rhéomètre une fois terminé. Essuyez le liquide avec un lingette délicate. Rincer à l'eau DI et essuyer avec une lingette délicate. Répétez les étapes 9.4-9.6 avec des échantillons supplémentaires.
10. Phalloidin conjugué coloration de F-actin
- Apportez la solution conjuguée de phalloidin à la température ambiante. Brièvement centrifugeuse à basse vitesse avant l'ouverture. Aliquot solution assez pour l'assay, et stocker le reste à -20 oC.
- Diluer 1000x phalloidin conjuguer la solution de stock à une solution de travail 1x en ajoutant 1 solution de stock de L à 1 mL 1x PBS - 1% d'albumine de sérum bovin (BSA). Cela en fait assez pour 10 puits (100 l/puits).
REMARQUE: On peut utiliser plaine 1x PBS, mais 1x PBS - BSA est préféré pour empêcher la phalloidin conjugué de coller au tube. Ne stockez pas cette solution après l'assidu. 1 l de colorant fluorescent bleu (voir le tableau des matériaux)solution de travail peut être ajouté à la tache pour les noyaux. La solution de travail peut être faite en mélangeant 1 l de 20 mM de colorant fluorescent bleu avec 11,3 L 1x PBS. - Aspirez les médias des puits (étape 6.1). Rincer les puits avec 1x PBS.
- Ajouter 10% FnB. Incuber les puits avec 10% NBF pendant 20 min à température ambiante. Enlever le supernatant. Laver 3 fois avec du PBS pendant 5 min à chaque fois.
- Ajouter 0,1 % t-Octylphenoxypolyethoxyethanol dans PBS pendant 5 min. Aspirate et laver 3 fois avec pbS pendant 5 min à chaque fois.
- Ajouter 100 l de solution de travail à partir de l'étape 10.2 à chaque puits. Incuber pendant 1 h à température ambiante. Aspirer et laver 3 fois avec PBS pendant 5 min à chaque fois. Laisser dans le PBS à 4 oC.
- Aspirer et retirer les puits du joint sur la glissière de la chambre. Utilisez une pince à épiler pour enlever le joint de la glissière. Échantillons de mont et de glissement de couverture à l'aide d'un milieu de montage à base d'aqueux. Laisser guérir (5 min).
- Observez les cellules sous un microscope à fluorescence à l'excitation/émission de 590/618 nm.
11. L'assay de viabilité
- Rincer les cellules avec le PBS (DPBS) de Dulbecco. Ajouter 100 L de DPBS contenant 1 m de calcéinam et 2 homodimères d'éthidium M à chaque puits. Incuber 30 min à température ambiante.
- Imagez la diapositive de chambre de 16 puits par microscopie de fluorescence. L'acétoxique de Calcénein (calcéin AM) peut être observé à l'excitation/émission 494/517 nm. L'homodimère d'éthidium peut être observé à l'excitation/émission 528/645 nm.
- Lisez la plaque de 96 puits sur un lecteur de plaque en utilisant les mêmes longueurs d'onde à l'étape 11.2.
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Representative Results
Les MFP ont été décellularisés à la suite de l'irradiation à l'aide de la procédure indiquée à la figure 1A. Les MPF pré-décellularisation (figure 1B) et post-décellularisation (figure 1C) sont montrés. La décellularisation a été confirmée à l'aide de l'hématoxylin et de l'éosine (H et E) tainingent, et 1-[4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol coloration a été utilisé pour évaluer la teneur en lipides (Figure 2). Les propriétés rhéologiques des hydrogels ECM ont également été évaluées à 37 oC (figure3). Le modulus de stockage était plus élevé que le modulus de perte pour toutes les conditions, démontrant la formation stable d'hydrogel.
Des cellules de carcinome mammaire 4T1 GFP- et luciferase-étiquetées ont été encapsulées dans les hydrogels. La prolifération cellulaire a été examinée par microscopie de fluorescence, mesures de bioluminescence, et coloration de viabilité 48 h après encapsulation (figure 4). Les hydrogels irradiés ont montré une tendance croissante dans la prolifération de cellules de tumeur. Phalloidin conjugué a été utilisé pour visualiser F-actin dans les cellules encapsulées (Figure 5). Cette technique peut être utilisée pour examiner la morphologie cellulaire et les propriétés cytosquelettiques.
Figure 1 : Flux de travail expérimental. (A) Schéma de formation d'hydrogel. Des images d'appareils photo numériques ont été prises de MFP pré- (B) et post-décellularisation (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Confirmation de la décellularisation et de la délipidation dans les MFP. La coloration de l'hématoxylin et de l'éosine (H et E) des MPF irradiés encastrés dans la paraffine et sectionnées à 5 m (A) a été comparée aux MFP congelés dans le milieu d'embedding cryostat (5 sections de m) avant (B) et après la décellularisation (C), incubé avec du saccharose avant de congeler dans le milieu d'incorporation cryostat et sectionné à 30 m (D). 1-([Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol coloration a été fait pour visualiser la rétention de lipides dans les MFP congelés dans le milieu d'intégration cryostat (5 sections de m) avant (E) et après la décellularisation (F) et incubé avec le saccharose avant la congélation dans cryostat encastré milieu et sectionné à 30 sections m (G). Les barres d'échelle représentent 50 m. Decell et décellularisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Confirmation de la formation d'hydrogel. La rhéologie a été utilisée pour déterminer le modulus de stockage et de perte de contrôle (A) et irradié (B) solution pré-gel faite à partir de MFPs à 37 oC et 0,5 % souche. Les barres d'erreur montrent l'écart standard. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Prolifération des cellules tumorales dans les hydrogels ECM irradiés. La prolifération des cellules 4T1 48 h après l'inoculation est montrée avec le prégel dérivé du contrôle (A) et irradié (B) MFPs. (C) Signal de bioluminescence des cellules 4T1 incorporées dans le contrôle et les hydrogels irradiés. Les cellules vivantes tachées de Calcein AM et les cellules mortes teintées d'éthidium homodimer ont été évaluées dans le contrôle (D) et les hydrogels irradiés (E), et le rapport vivant/mort a été quantifié (F). Les barres d'échelle représentent 200 m. Les barres d'erreur affichent l'erreur standard. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Propriétés cytosquelettiques dans les hydrogels ECM. Les cellules à l'intérieur (A) contrôlent et (B) les hydrogels eCM irradiés sont tachés de phalloidin conjugué pour visualiser la teinture fluorescente F-actine (rouge) et bleue pour visualiser les noyaux (bleu) dans les MFP irradiés. La barre d'échelle représente 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Poids tissulaire (g) | autorité (0 Gy) |
Irradiés (20 Gy) |
| Poids MFP initial | 0,461 | 0,457 |
| Poids MFP après l'enlèvement de l'échantillon d'histologie | 0,423 | 0,416 |
| Poids MFP après décellularisation | 0,025 | 0,025 |
| Poids MFP décellularisé après l'enlèvement d'échantillon d'histologie | 0,015 | 0,016 |
Tableau 1 : Poids tissulaires avant et après la décellularisation. Des poids représentatifs de tissu pour chaque condition ont été mesurés avant et après la décellularisation de MFP.
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Discussion
Cette méthode de formation d'hydrogel dépend en grande partie de la quantité de tissu de départ. Les MPF murines sont petits, et le processus de décellularisation entraîne une réduction significative du matériel (tableau 1). Le processus peut être répété avec plus de MFP pour augmenter le rendement final. Le fraisage est une autre étape importante qui peut entraîner la perte de matériel. D'autres ont montré le succès avec un moulin cryogénique, mais ce protocole est basé sur le fraisage par l'intermédiaire d'un mortier de poche et d'une perceuse électrique avec un pilon attaché8,17. Cela a l'avantage de réduire les coûts en capital et de minimiser les pertes matérielles, mais peut introduire une variabilité dans le produit final.
Un défi à la confirmation de la décellularisation et de la délipidation est dans le tissu adipeux de congélation dans le milieu d'intégration de cryostat. La figure 2A montre la coloration H et E d'un MFP irradié intégré et sectionné dans de la paraffine. Des noyaux distincts sont visibles sur les bords des cellules adipeuses près des jonctions avec d'autres cellules, et la morphologie des adipocytes est bien entretenue. Figure 2B ,C,E,F montrent des MFP préparés en incorporant et en congelant des MFP dans le milieu d'embedding cryostat et en sectionnant 5 tranches de m. Ce processus n'a pas été en mesure de conserver la morphologie et la forme des adipocytes. Cependant, la décellularisation a été confirmée par la perte de noyaux et d'autres traces d'ADN (Figure 2C), et la délipidation a été visualisée avec la perte de coloration neutre de teneur en lipides (Figure 2F). La morphologie d'adipocyte a été maintenue en incubant des MFP dans le saccharose, en incorporant et en congelant dans le milieu d'embedding de cryostat, et en sectionnant 30 tranches de m (figure 2D,G). Bien que la visualisation de la coloration H et E ait été difficile avec cette méthode (Figure 2D), 1-([Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol colorant a confirmé la rétention de la morphologie des adipocytes (Figure 2G).
Nous avons développé un modèle hydrogel in vitro qui peut imiter le microenvironnement normal in vivo de tissu et sa réponse aux dommages de rayonnement. Les hydrogels d'ECM ont été fabriqués dans des études semblables, maisl'impact des dommages de rayonnement sur le comportement de cellules de tumeur n'a pas été évalué 9,12,16,17,18. Nous nous attendons à ce que l'irradiation des MFP modifie le remodelage et la composition de l'ECM, et ces changements de composition seront caractérisés dans de futures études. Nous avons observé une tendance croissante à la prolifération des cellules 4T1 dans les hydrogels ECM irradiés utilisant à la fois l'imagerie par bioluminescence et la coloration de viabilité (Figure 4). En outre, nous avons employé la conjugaison de phalloidin pour tacher des filaments de F-actin dans les cellules de tumeur encapsulées et avons trouvé une augmentation qualitative de l'alignement d'actinet et de l'allongement de cellules de tumeur dans les hydrogels irradiés d'ECM, qui suggère une augmentation de la force d'adhérence et capacité envahissante (Figure 5)19,20. De futures expériences exploreront les changements dans la dynamique d'adhérence focale et le remodelage protéaté-négocié pour l'évaluation de la migration cellulaire et de l'invasion.
Cette méthode a été développée à l'aide d'une lignée cellulaire murine TNBC, mais cette méthode peut être utilisée comme une plate-forme pour évaluer la prolifération et l'invasivité d'autres types de cellules. Les études futures pourraient incorporer des cellules immunitaires pour déterminer leur rôle dans la réponse aux radiations ainsi que d'autres formes de lésions tissulaires (p. ex., chirurgie). Bien que cette étude ait évalué les hydrogels d'ECM des MFP irradiés ex vivo, des études additionnelles exploreront le rayonnement in vivo des MFP pour évaluer l'effet de la réponse physiologique de rayonnement et de l'infiltration des cellules immunitaires sur des caractéristiques d'ECM. Nous avons établi une méthode pour fabriquer des hydrogels d'ECM des MFp de souris pour étudier l'effet du rayonnement normal de tissu sur le comportement de cellules de tumeur, et cette technique peut être étendue aux tissus humains pour un modèle plus pertinent d'hydrogel. Dans l'ensemble, l'examen des lésions tissulaires normales par les hydrogels ECM peut mener à des aperçus dans le rôle des changements d'ECM suivant la radiothérapie dans la répétition locale.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient la Dre Laura L. Bronsart d'avoir fourni les cellules GFP- et luciferase-4T1, le Dr Edward L. LaGory pour ses conseils sur 1-([Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol, le Dr Craig L. Duvall pour l'utilisation de l'IVIS et du lyophiliseur, et le Dr Scott A. Guelcher pour le rhéomètre utiliser. Cette recherche a été financée par les subventions des NIH #R00CA201304.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | - |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | - |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | - |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | - |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | - |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | - |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | - |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | - |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | - |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | - |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | - |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | - |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | - |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | - |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | - |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | - |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | - |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
References
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