Summary
Este protocolo presenta un método para la descelularización y posterior formación de hidrogel de almohadillas de grasa mamaria murina después de la irradiación ex vivo.
Abstract
La radiación es una terapia para pacientes con cáncer de mama triple negativo. Se desconoce el efecto de la radiación en la matriz extracelular (ECM) del tejido mamario sano y su papel en la recurrencia local en el sitio del tumor primario. Aquí presentamos un método para la descelularización, liofilización y fabricación de hidrogeles ECM derivados de almohadillas de grasa mamaria murina. Se presentan resultados sobre la eficacia del proceso de descelularización, y se evaluaron los parámetros reológicos. Las células de cáncer de mama etiquetadas por GFP y luciferasse encapsuladas en los hidrogeles demostraron un aumento de la proliferación en hidrogeles irradiados. Finalmente, se empleó la tinción conjugada con phalloidin para visualizar la organización del citoesqueleto de las células tumorales encapsuladas. Nuestro objetivo es presentar un método para la fabricación de hidrogeles para el estudio in vitro que imitan el entorno del tejido mamario in vivo y su respuesta a la radiación con el fin de estudiar el comportamiento de las células tumorales.
Introduction
El cáncer se caracteriza por la proliferación excesiva de células que pueden evadir la apoptosis y también hacer metástasis en sitios distantes1. El cáncer de mama es una de las formas más comunes entre las mujeres en los Estados Unidos, con un estimadode 266.000 nuevos casos y 40.000 muertes en 2018 2. Un subtipo particularmente agresivo y difícil de tratar es el cáncer de mama triple negativo (TNBC), que carece del receptor de estrógeno (ER), el receptor de progesterona (PR) y el factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). La radioterapia se utiliza comúnmente en el cáncer de mama para eliminar las células tumorales residuales después de la tumorectomía, pero más del 13% de los pacientes con TNBC todavía experimentan recurrencia en el sitio primario del tumor3.
Se sabe que la radioterapia es eficaz para mitigar la metástasis y la recurrencia porque lacombinación de lumpectomía y radiación da como resultado la misma supervivencia a largo plazo que la mastectomía 4. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que el tratamiento de radiaciónestá asociado con la recurrencia local al sitio del tumor primario en entornos inmunocomprometidos 5,6. Además, es bien sabido que la radiación cambia la matriz extracelular (ECM) del tejido normal induciendo la fibrosis7. Por lo tanto, es importante entender el papel de los cambios de ECM inducidos por la radiación en la dictación del comportamiento de las células tumorales.
Los tejidos descelularizados se hanutilizado como modelos in vitro para estudiar la enfermedad 8,9. Estos tejidos descelularizados preservan la composición de la ECM y recapitulan el complejo in vivo ECM. Este eCM de tejido descelularizado se puede procesar y digerir para formar hidrogeles ECM reconstituidos que se pueden utilizar para estudiar el crecimiento celular y la función10,11. Por ejemplo, los hidrogeles inyectables derivados del lipoaspirato humano descelularizado y del tejido miocárdico sirvieron como métodos no invasivos de ingeniería tisular, y un hidrogel derivado del tejido pulmonar porcino se utilizó como método in vitro de prueba accesorio de células madre mesenquimales y viabilidad12,13,14. Sin embargo, no se ha investigado el efecto del daño normal por radiación tisular en las propiedades de ECM.
Los hidrogeles derivados de ECM tienen el mayor potencial para el estudio in vitro de fenómenos in vivo. Se han estudiado otros materiales, incluyendo colágeno, fibrina y matrigel, pero es difícil recapitular sintéticamente la composición del ECM13. Una ventaja del uso de hidrogeles derivados de ECM es que el ECM contiene las proteínas y factores de crecimiento necesarios para un tejido en particular14,15. La irradiación de tejido normal durante la tumorectomía causa cambios significativos en el ECM, y los hidrogeles derivados de ECM se pueden utilizar para estudiar este efecto in vitro. Este método podría conducir a modelos in vitro más complejos y más precisos de la enfermedad.
En este estudio, sometimos almohadillas de grasa mamaria murinos (MFP) a radiación ex vivo. Los equipos multifunción se descelularizaron y se convirtieron en una solución pregel. Los hidrogeles se formaron con células 4T1 incrustadas, una línea celular de TNBC murina. Se examinaron las propiedades reológicas del material hidrogel y se evaluó la dinámica de las células tumorales dentro de los hidrogeles. Los hidrogeles fabricados a partir de equipos multifunción irradiados mejoraron la proliferación de células tumorales. Estudios futuros incorporarán otros tipos de células para estudiar las interacciones células celulares en el contexto de la recurrencia del cáncer después de la terapia.
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Protocol
Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las directrices y protocolos institucionales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Vanderbilt.
1. Preparación y irradiación ex vivo de los equipos de multifunción
- Sacrificar ratones Nu/Nu atímicos (8-10 semanas) usando asfixia porCO2 seguida de luxación cervical.
- Limpie la piel con 70% de etanol.
- Recoger almohadillas de grasa mamaria (MFP) de ratones sacrificados usando tijeras preesterilizadas y fórceps en un tubo cónico de 15 ml que contiene medios RPMI completos (RPMI complementado con 1% penicilina-estreptomicina y 10% suero bovino fetal) (ver la Tabla de Materiales) (ver la Tabla de Materiales) ).
- Irradiar muestras a 20 Gy utilizando una fuente de cesio.
- Lleve los equipos multifunción irradiados y los medios RPMI completos a un gabinete de bioseguridad. Los medios dependerán de la línea celular que se va a cultivar en el hidrogel final. Llene los platos de 6 cm o 10 cm con suficientes medios para sumergir los equipos multifunción. Para platos de 6 cm, utilizar 8 ml de medios, y para platos de 10 cm, utilizar 20 ml de medios.
- Incubar en una incubadora de CO2 de 37oC/5% durante dos días. El tiempo en la incubadora puede ajustarse.
- Enjuague los tejidos en solución salina con fosfato (PBS), desplace el exceso de humedad y coloque las mFP en tubos cónicos de 15 ml para su almacenamiento a -80 oC hasta la descelularización. Este paso de congelación ayuda al paso de descelularización y la muestra debe congelarse incluso si los siguientes pasos están listos.
2. Descelularización (adaptada a partir de las referencias12,16,17)
NOTA: Este procedimiento se adaptó a partir de métodos publicados anteriormente centrados en la descelularización adiposa, que incluían el detergente iónico desoxicolato de sodio en lugar de sulfato de dodecilo sódico para eliminar el ADN de manera eficiente12,16 , 17.
- En el día1, retire los equipos multifunción congelados de -80 oC y descongele a temperatura ambiente.
- Una vez descondezcados, seque brevemente los equipos multifunción secos en una delicada toallita de tarea. Pesar los equipos multifunción utilizando una escala analítica.
- Usando un par de fórceps con tijeras o un bisturí, divida el tejido en muestras de 3 mm x 3 mm x 3 mm para el estudio del ECM intacto y el tejido restante para la producción de hidrogel.
NOTA: El número de muestras depende del número de métodos de prueba, por ejemplo, la recopilación de dos muestras se describe a continuación: una para la incrustación de parafina (paso 2.5) y otra para la congelación en el medio de incrustación de criostato, si lo desea (consulte la Tabla de Materiales y el paso 2.6). - Pesar los tejidos. Si se incrusta en parafina para la sección, continúe con el paso 2.5. Si se congela en el medio de incrustación criostato para su sección, continúe con el paso 2.6.
- En una campana química, sumerja el tejido en una formalina tamponada neutra al 10% (NBF) (ver la Tabla de Materiales)durante 24 h a 4oC. Lavar 3 veces en PBS durante 5 min cada uno. Sumerja el tejido en sacarosa al 30% durante 48 h a 4oC.
- Pesar el tejido ahora que esta pieza ha sido removida. Continúe con el paso 2.6.
- En una campana química, coloque las piezas de mFP en un cassette etiquetado preparado con medio de incrustación de criostato. Agregue más medio de incrustación de criostato para cubrir el tejido.
- Coloque el cassette en un vaso de precipitados de 2-metilbutano (ver la Tabla de Materiales)que esté preenfriado con nitrógeno líquido. El vaso de precipitados debe tener suficiente 2-metilbutano para cubrir la parte inferior, pero no lo suficiente para sumergir el cassette porque el medio de incrustación de criostato no debe tocar el 2-metilbutano. Deje que el cassette se quede en el 2-metilbutano hasta que el medio de incrustación de criostato se congele y se vuelva opaco.
- Envuelva el cassette(s) en papel de aluminio, etiquete y deje a -80 oC hasta que se utilice para el seccionamiento.
NOTA: Los tejidos colocados inmediatamente en el medio de incrustación de criostatos se seccionaron a 5 m, mientras que los tejidos incubados en sacarosa se seccionaron a 30 m para retener la morfología de los adipocitos.
- Use fórceps para masajear manualmente el tejido restante.
NOTA: Las piezas de tejido también se pueden colocar en 10% NBF durante 24-48 h, enjuagarse en PBS y dejarse en 70% de etanol hasta que se lainten en parafina. Después de la incrustación, se pueden utilizar secciones de 5 m para la tinción de hematoxilina y eosina (H & E) (ver sección 7 a continuación). - Coloque los equipos multifunción en platos de 6 cm con una solución de 5 ml de trippsina/0,05% EDTA. Incubar a 37oC durante 1 h. Rocíe y limpie los platos con 70% de etanol antes de colocarlos en la incubadora.
- Utilice coladores de 0,7 mm para lavar los equipos multifunción con agua desionizada (DI) vertiendo agua sobre el tejido tres veces. Use fórceps para masajear manualmente el tejido entre lavados.
- Seque brevemente el tejido en una tarea delicada, limpie y pese. Coloque los tejidos en un vaso de precipitados preautoclave que contenga una barra de agitación de tamaño adecuado. Cubra los tejidos con 60 ml de 3% t-octilphenoxypolyethoxyethanolethanol (ver la Tabla de Materiales)por 1 g de tejido y revuelva durante 1 h a temperatura ambiente. Utilice un mínimo de 20 ml.
- Vierta el tejido y el contenido en un colador. Enjuague el vaso de precipitados con agua DI y vierta sobre los tejidos. Repita dos veces más. Utilice fórceps para masajear manualmente el tejido entre enjuagues.
- Seque brevemente el tejido en una tarea delicada, limpie y pese. Vuelva a colocar los tejidos y las barras de revuelo en los mismos vasos de precipitados y cubra con 60 ml de ácido desoxicólico al 4% por 1 g de tejido. Revuelva durante 1 h a temperatura ambiente. Utilice un mínimo de 20 ml.
- Vierta el tejido y el contenido en un colador de malla. Enjuague el vaso de precipitados con agua DI y vierta sobre los tejidos. Repita dos veces más. Utilice fórceps para masajear manualmente el tejido entre enjuagues.
- Seque brevemente el tejido en una tarea delicada, limpie y pese.
- Coloque los tejidos en el mismo vaso de precipitados con agua DI fresca suplementada con 1% penicilina-estreptomicina. Cubrir firmemente con película de parafina. Dejar pasar la noche a 4oC.
- Lave los coladores y vasos para usarlos al día siguiente.
- En el día2, drenar el contenido del vaso de precipitados en un colador. Seque brevemente el tejido en una tarea delicada, limpie y pese.
- Coloque los equipos multifunción en el mismo vaso de precipitados con una barra de agitación de tamaño adecuado. Cubrir con 60 ml 4% de etanol/0,1% solución de ácido peracético por 1 g de tejido. Utilice un mínimo de 20 ml. Revuelva durante 2 h a temperatura ambiente.
- Vierta el tejido y el contenido en un colador de 0,7 mm. Use fórceps para masajear manualmente el tejido. Vuelva a colocar el contenido en el vaso de precipitados. Lavar el tejido cubriéndolo con 60 ml de 1x PBS por 1 g de tejido. Utilice un mínimo de 20 ml. Revuelva durante 15 min a temperatura ambiente. Repita una vez.
- Vierta el tejido y el contenido en un colador de 0,7 mm. Use fórceps para masajear manualmente el tejido. Vuelva a colocar el contenido en el vaso de precipitados. Lavar el tejido cubriéndolo con 60 ml de agua DI por 1 g de tejido. Utilice un mínimo de 20 ml. Revuelva durante 15 min a temperatura ambiente. Repita una vez.
- Seque brevemente el tejido en una tarea delicada, limpie y pese. Vierta el tejido y el contenido en un colador. Use fórceps para masajear manualmente el tejido.
- Vuelva a colocar el contenido en el vaso de precipitados. Cubrir los tejidos con 60 ml de 100% n-propanol por 1 g de tejido. Utilice un mínimo de 20 ml. Revuelva durante 1 h a temperatura ambiente.
- Seque brevemente el tejido en una tarea delicada, limpie y pese. Vierta el tejido y el contenido en un colador de 0,7 mm. Use fórceps para masajear manualmente el tejido.
- Vuelva a colocar el contenido en el vaso de precipitados. Lavar el tejido cubriéndolo con 60 ml de agua DI por 1 g de tejido. Utilice un mínimo de 20 ml. Revuelva durante 15 min a temperatura ambiente. Repita tres veces.
- Vierta el tejido y el contenido en un colador. Repita los pasos 2.3–2.6 para recoger trozos de tejido para la incubación y congelación de sacarosa en el medio de incrustación de criostato.
- Seque brevemente el tejido en una tarea delicada, limpie y pese. Colocar en un tubo de 15 ml etiquetado. Congele a -80 oC durante la noche.
3. Liofilización
- Retirar los tubos de 15 ml de -80 oC y colocarlos sobre hielo seco. Mantenga las muestras congeladas en hielo seco hasta que estén en el liofilizador.
- Retire las tapas. Utilice una banda de goma para fijar una delicada toallita de tarea en la parte superior para cubrir la abertura. Ponga muestras en el liofilizador durante al menos 2 días.
- Retire las muestras del liofilizador y coloque los tubos en hielo seco. Elimine las toallitas de tarea delicadas que pesan cada muestra en una escala analítica. Fije las tapas y colóquelas a -80 oC durante la noche.
4. Fresado
- Llene un recipiente poco profundo con nitrógeno líquido. Retirar las muestras del congelador de -80 oC. Pesar cada mFP liofilizada.
- Coloque una muestra en el mortero. Utilice un guante criogénico para sujetar el mortero en el nitrógeno líquido.
- Utilice un pestillo unido a un taladro de mano para fresar la muestra. Fresa en intervalos de 1 min para comprobar el progreso y eliminar la mano enguantada del nitrógeno líquido. Molino durante un mínimo de 5 min.
- Repita el proceso para todas las muestras. Rocíe y limpie el mortero y pestle con etanol entre cada muestra.
- Almacene las muestras en polvo en tubos de 15 ml a -80 oC hasta que estén listas para su uso.
NOTA: Las muestras se pueden utilizar inmediatamente o almacenar durante la noche.
5. Formación de hidrogel
- Si se almacena a -80 oC durante la noche, retirar y descongelar a temperatura ambiente. Mientras se descongela, calcule el peso necesario de la pepsina (ver Tabla de Materiales)y el volumen de ácido clorhídrico (HCl) necesario para cada muestra que dé como resultado una solución con 1% p/v de muestra de polvo y 0,1% p/v de pepsina en 0,01 M HCl. Añadir la pepsina al HCl para formar una solución de pepsina-HCl.
- Agregue el polvo de muestra y la solución de pepsina-HCl a un tubo de 15 ml. Agregue una pequeña barra de agitación y revuelva durante 48 horas.
- Colocar los tubos en hielo durante 5 min. Calcular el volumen necesario de 10x PBS necesario para cada muestra que resulte en una solución con una concentración de PBS 1x. Agregue el volumen apropiado de 10pbS a cada tubo.
- Agregue 10% v/v 0.1 M NaOH a cada solución para alcanzar el pH 7.4. Utilice un papel de pH para analizar individualmente.
NOTA: La solución de gel puede conservarse a 4oC durante una semana.
6. Encapsulación de células en hidrogeles
- Uso de células etiquetadas con GFP y luciferasa
- Utilizando la solución de gel pH 7.4, resuspenda las células 4T1 con etiqueta GFP y luciferasa a una concentración de 500.000 o 1.000.000 de células/ml de solución de gel. Añadir 16 l de solución de células de gel a cada pocal de una corredera de cámara de 16 pozos. Incubar durante 30 min a 37oC.
- Agregue 100 s de medios RPMI completos a cada pocto. Continuar la incubación durante 48 h a 37oC. Las células etiquetadas con GFP y luciferasa se pueden visualizar mediante microscopía de fluorescencia a las 0 horas, 24 horas y 48 horas después de la gelación.
NOTA: La proliferación celular se puede medir para las células 4T1 etiquetadas por GFP y luciferasa utilizadas aquí añadiendo (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiaazolecarboxylic ácido potasio sal (ver la Tabla de Materiales) a los pozos durante 10 minutos durante 10 minutos y realizar imágenes de bioluminiscencia utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia (ver Tabla de Materiales). Tras la toma de imágenes de bioluminiscencia, se puede visualizar el citoesqueleto (ver sección 10).
- Uso de celdas sin etiquetar
- Utilizando la solución de gel pH 7.4, resuspenda las células 4T1 no etiquetadas peletizadas a una concentración de 500.000 o 1.000.000 de células/ml de solución de gel. Añadir 16 l de solución de gel-célula a cada pocal de un portaobjetos de cámara de 16 pocillos y una placa de 96 pocillos. Incubar durante 30 min a 37oC.
- Añadir 100 s l de medios a cada poca. Continuar la incubación durante 48 h a 37oC.
NOTA: Se puede medir la viabilidad celular (ver sección 11). El portaobjetos de cámara de 16 pocillos se puede utilizar para la toma de imágenes, y la placa de 96 pocillos se puede utilizar para la cuantificación.
7. Tinción H & E
- Para el tejido fijado en formalina, incrustado en parafina, se subsuvan las diapositivas que contienen 5 secciones de m dos veces en 100% de xileno (5-10 min) para la desparafinación. Rehidratar sumergiendo en 100%, 95%, 85%, y 70% etanol durante 5 min cada uno seguido de agua DI durante 5 min. Continúe en el paso 7.6.
- Para secciones de tejido congelado, tome secciones inmediatamente del congelador y sumerjalas en 10% NBF durante 10 min. Lavar en 1pbS tres veces durante 5 min cada una. Enjuagar en agua durante 5 min.
- Núcleos de manchas con hematoxilina durante 3 min. Enjuague en agua corriente del grifo.
- Diferenciar por inmersión 1–2 veces en 0.3% alcohol ácido (0.3% HCl en 70% etanol). Enjuague con agua corriente del grifo durante 5 min.
- Añadir agente de color adolece para 30 s. Enjuague en agua corriente del grifo durante 5 min. Sumergir en etanol 95% durante 30 s.
- Incubar con eosina durante 90 s a temperatura ambiente. Deshidratar en 3 cambios de etanol 100% durante 5 min cada uno.
- Sumerja dos veces en 100% xileno durante 5 min cada uno. Añadir distyrene-plasticiser-xileno (medio de montaje DPX0 a la diapositiva y añadir un cubreobjetos. Deje que se cure durante la noche antes de tomar imágenes.
8. 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol manchado
- Prepare 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol solución.
- Añadir 0.5 g de 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-polvo de naftalina a un vaso de precipitados con 100 ml de propilenglicol. Calentar a 95–100 oC mientras se agita durante al menos 30 min. Evitar que la temperatura supere los 100 oC.
- Retire el vaso de precipitados del fuego y deje enfriar ligeramente. Vierta la solución a través del papel de filtro cualitativo de grado 4 para eliminar las partículas residuales.
NOTA: La solución se puede almacenar a temperatura ambiente y debe filtrarse a través de un filtro de jeringa de 0,45 m inmediatamente antes de la tinción.
- Manchas de tejido congelado.
- Retirar los portaobjetos del congelador de -80 oC y secar al aire durante 30 min. Preenfríe 10% NBF a -20 oC durante 30 minutos en un frasco de Coplin. Fijar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Lavar en agua DI 3 veces durante 5 min cada uno.
- Retire el exceso de agua con una delicada toallita antes de sumergirse en propilenglicol 2 veces durante 5 minutos cada uno. Retire las diapositivas del propilenglicol. No enjuague.
- Coloque los portaobjetos en la solución de tinción oil Red O filtrada por jeringa durante 3 h a temperatura ambiente.
- Diferenciar colocando diapositivas en 85% propilenglicol durante 5 min. Enjuague las muestras en PBS dos veces durante 5 min cada una.
- Muestras de manchas con hematoxilina durante 30 s. Lavar en agua corriente del grifo durante 5 minutos y luego colocar los portaobjetos en agua DI.
- Monte las muestras utilizando un medio de montaje acuoso y permita que los medios se sequen durante la noche antes de tomar imágenes.
9. Reología
- Lleve las soluciones pregel del paso 5.4 al reómetro sobre hielo.
- Fije un brazo y una placa de 25 mm al reómetro. Abra el software de reología en el ordenador conectado al reómetro.
- Realice la asignación rotacional y determine la separación cero. Levante el brazo cuando esté completo.
- Pipetear 500 l de pre-gel en la placa. Baje el brazo hasta que la solución pregel ocupe completamente el espacio entre la placa y el brazo. Sea conservador porque bajar el brazo más allá de este punto resultará en la solución pre-gel derramarse fuera del lado.
- Realizar un barrido de frecuencia en la solución pregel de 0,1-100 Hz después de que se haya mantenido a 37 oC durante 30 minutos.
- Levante el brazo del reómetro cuando esté completo. Limpie el líquido con una toallita de tarea delicada. Enjuagar con agua DI y limpiar con una delicada toallita de tarea. Repita los pasos 9.4–9.6 con muestras adicionales.
10. Tinción conjugada con falloidina de F-actina
- Lleve la solución conjugada con phalloidin a temperatura ambiente. Centrifugar brevemente a baja velocidad antes de la apertura. Alícuota suficiente solución para el ensayo, y almacenar el resto a -20 oC.
- Diluir 1000x solución de material conjugado de faloidina a una solución de trabajo 1x mediante la adición de 1 solución de stock de L a 1 mL 1x PBS + 1% albúmina sérica bovina (BSA). Esto hace suficiente para 10 pozos (100 l/bien).
NOTA: Uno puede utilizar 1pbS simple, pero 1x PBS + BSA se prefiere para evitar que el conjugado de faloidina se pegue al tubo. No almacene esta solución después del ensayo. Se puede añadir una solución de trabajo a la mancha de núcleos de 1 l de colorante fluorescente azul (véase la solución de trabajo Tabla de materiales). La solución de trabajo se puede hacer mezclando 1 l de 20 mM de colorfluorescenta azul con 11,3 l 1 x PBS. - Aspirar medios de pozos (paso 6.1). Enjuague los pozos con 1x PBS.
- Añadir 10% NBF. Incubar pozos con 10% NBF durante 20 min a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante. Lave 3 veces con PBS durante 5 min cada vez.
- Añadir 0.1% t-Octylphenoxyethoxyethanolethanol en PBS durante 5 min. Aspirar y lavar 3 veces con PBS durante 5 min cada vez.
- Agregue 100 sal de solución de trabajo del paso 10.2 a cada pocto. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Aspirar y lavar 3 veces con PBS durante 5 min cada vez. Dejar en PBS a 4oC.
- Aspirar y quitar los pozos de la junta en la corredera de la cámara. Utilice pinzas de punta de aguja para retirar la junta de la corredera. Monte y cubra las muestras utilizando un medio de montaje acuoso. Dejar curar (5 min).
- Observar las células bajo un microscopio de fluorescencia a excitación/emisión de 590/618 nm.
11. Ensayo de viabilidad
- Enjuague las células con PBS (DPBS) de Dulbecco. Añadir 100 s de DPBS que contengan 1 m de calceína AM y 2 m de etidio homodímero a cada pocillo. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
- Imagen de la corredera de 16 pozos mediante microscopía de fluorescencia. La calceína acetoxymethyl (calceína AM) se puede observar en excitación/emisión a 494/517 nm. El homodimer etidio se puede observar a la excitación/emisión de 528/645 nm.
- Lea la placa de 96 pocillos en un lector de placas utilizando las mismas longitudes de onda en el paso 11.2.
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Representative Results
Las mFP se descelularizaron tras la irradiación mediante el procedimiento que se muestra en la Figura 1A. Se muestran las mFP de predescelularización (figura1B)y postdescelularización (figura 1C). La descelularización se confirmó utilizando la tinción de hematoxilina y eosina (H & E), y se utilizó la tinción 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol para evaluar el contenido de lípidos (Figura 2). También se evaluaron las propiedades reológicas de los hidrogeles ECM a 37 oC (figura3). El módulo de almacenamiento fue mayor que el módulo de pérdida para todas las condiciones, demostrando la formación estable de hidrogel.
Las células de carcinoma mamario 4T1 con etiqueta GFP y luciferasse se encapsularon en los hidrogeles. La proliferación celular se examinó mediante microscopía de fluorescencia, mediciones de bioluminiscencia y manchabilidad 48 h después de la encapsulación (Figura4). Los hidrogeles irradiados mostraron una tendencia creciente en la proliferación de células tumorales. El conjugado de phalloidin se utilizó para visualizarF-actina en las células encapsuladas (Figura 5). Esta técnica se puede utilizar para examinar la morfología celular y las propiedades citoesqueléticas.
Figura 1: Flujo de trabajo experimental. (A) Esquema de la formación de hidrogel. Se tomaron imágenes de cámaradigital de equipos multifunción pre- (B) y post-descelularización (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Confirmación de descelularización y deslipidación en equipos multifunción. Se comparó la tinción de hematoxilina y eosina (H & E) de equiposmultifunción no irradiados incrustados en parafina y seccionados a 5 m (A) con equipos multifunción congelados en medio de incrustación de criostato (secciones de 5 m) antes (B) y después de la descelularización (C), incubado con sacarosa antes de congelarse en un medio de incrustación de criostato y seccionado a 30 m (D). 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol se realizó la tinción para visualizar la retención de lípidos en mFP congelados en medio de incrustación de criostato (5 secciones) antes (E) y después de la descelularización (F) y se incuba con sacarosa antes de congelarse en criostato de incrustación medio y seccionado a 30 m secciones (G). Las barras de escala representan 50 m. Descelularción: descelularización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Confirmación de la formación de hidrogel. La reología se utilizó para determinar el módulo de almacenamiento y pérdida de control (A) y la solución pregel irradiada (B) hecha de equipos multifunción a 37 oC y 0,5% de tensión. Las barras de error muestran la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Proliferación de células tumorales en hidrogeles ECM irradiados. La proliferación de células 4T1 48 h después de la inoculación se muestra con pregel derivado del control (A) e irradiado (B) MFP. (C) Señal de bioluminiscencia de células 4T1 incrustadas dentro de hidrogeles de control e irradiados. Las células vivas teñidas de Calcein AM y las células muertas manchadas de etidio homodímero se evaluaron en hidrogeles de control (D) e irradiados (E), y se cuantificó la relación vivo/muerto (F). Las barras de escala representan 200 m. Las barras de error muestran un error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Propiedades citoesqueléticas en hidrogeles ECM. Las células dentro del control (A) y (B) los hidrogeles ECM irradiados se tiñen con conjugado de faloidina para visualizar el tinte fluorescente F-actin (rojo) y azul para visualizar los núcleos (azul) en los equipos multifunción irradiados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Peso del tejido (g) | Control (0 Gy) |
Irradiado (20 Gy) |
| Peso inicial de la impresora multifunción | 0.461 | 0.457 |
| Peso de la impresora multifunción después de la eliminación de muestras histológicas | 0.423 | 0.416 |
| Peso de la pma después de la descelularización | 0.025 | 0.025 |
| Peso descelularizado de la impresora multifunción después de la eliminación de muestras de histología | 0.015 | 0.016 |
Tabla 1: Pesos tisulares antes y después de la descelularización. Los pesos tisulares representativos para cada condición se midieron antes y después de la descelularización de la PMA.
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Discussion
Este método de formación de hidrogel depende en gran medida de la cantidad de tejido inicial. Las mFP de murine son pequeñas, y el proceso de descelularización da lugar a una reducción significativa del material (Tabla 1). El proceso se puede repetir con más equipos multifunción para aumentar el rendimiento final. El fresado es otro paso importante que puede conducir a la pérdida de material. Otros han demostrado éxito con un molino criogénico, pero este protocolo se basa enel fresado a través de un mortero de mano y taladro eléctrico con un accesorio de plagas 8,17. Esto tiene la ventaja de reducir los costos de capital y minimizar la pérdida de material, pero puede introducir variabilidad en el producto final.
Un desafío para la confirmación de la descelularización y la deslipidación es congelar el tejido adiposo en el medio de incrustación de criostato. La Figura 2A muestra la tinción H & E de una impresora multifunción no irradiada incrustada y seccionada en parafina. Los núcleos distintos son visibles en los bordes de las células adiposas cerca de las uniones con otras células, y la morfología de los adipocitos está bien mantenida. Figura 2B Los equipos multifunción de exhibición de ,C,E,F se preparan incrustando y congelando equipos multifunción en el medio de incrustación de criostatos y seccionando rebanadas de 5 m. Este proceso no pudo retener la morfología y la forma de los adipocitos. Sin embargo, la descelularización se confirmó mediante la pérdida de núcleos y otros rastros de ADN (Figura2C),y la deslipidación se visualizó con la pérdida de tinción de contenido lipídico neutro (Figura2F). La morfología de los adipocitos se mantuvo mediante la incubación de equipos multifunción en sacarosa, incrustación y congelación en el medio de incrustación de criostatos, y seccionando rodajas de 30 m (Figura2D, G). Mientras que la visualización de la tinción H & E fue difícil con este método (Figura 2D), 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol manchado confirmó la retención de la morfología de los adipocitos (Figura 2G).
Hemos desarrollado un modelo de hidrogel in vitro que puede imitar el microambiente de tejido normal in vivo y su respuesta al daño por radiación. Los hidrogeles ECM se han fabricado en estudios similares, pero no seha evaluado el impacto del daño por radiación en el comportamiento de las células tumorales 9,12,16,17,18. Esperamos que la irradiación de los equipos multifunción altere la remodelación y la composición de ECM, y estos cambios en la composición se caracterizarán en estudios futuros. Observamos una tendencia creciente en la proliferación de células 4T1 dentro de hidrogeles ECM irradiados utilizando imágenes de bioluminiscencia y tinción de viabilidad (Figura4). Además, utilizamos conjugado de faloidina para manchar filamentos de F-actina en células tumorales encapsuladas y encontramos un aumento cualitativo en la alineación de la actina y el alargamiento de las células tumorales en hidrogeles ECM irradiados, lo que sugiere un aumento en la resistencia a la adhesión y capacidad invasiva (Figura 5)19,20. Los experimentos futuros explorarán los cambios en la dinámica de adhesión focal y la remodelación mediada por proteasa para la evaluación de la migración e invasión celular.
Este método fue desarrollado usando una línea celular Tautin, pero este método puede ser utilizado como una plataforma para evaluar la proliferación e invasividad de otros tipos de células. Los estudios futuros pueden incorporar células inmunitarias para determinar su papel en respuesta a la radiación, así como otras formas de daño tisular (por ejemplo, cirugía). Aunque este estudio evaluó los hidrogeles ECM a partir de equipos multifunción irradiados ex vivo, estudios adicionales explorarán la radiación in vivo de los equipos multifunción para evaluar el efecto de la respuesta a la radiación fisiológica y la infiltración de células inmunitarias en las características de la ECM. Hemos establecido un método para fabricar hidrogeles ECM a partir de equipos multifunción de ratón para estudiar el efecto de la radiación tisular normal en el comportamiento de las células tumorales, y esta técnica puede extenderse al tejido humano para un modelo de hidrogel más relevante. En general, el examen del daño tisular normal a través de hidrogeles eCM puede conducir a información sobre el papel de los cambios de ECM después de la radioterapia en la recurrencia local.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a la Dra. Laura L. Bronsart por proporcionar las células GFP- y luciferase-4T1, el Dr. Edward L. LaGory por consejos sobre 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol manchación, Dr. Craig L. Duvall para IVIS y uso de liofilizador, y Dr. Scott A. Guelcher para el rheómetro Uso. Esta investigación fue apoyada financieramente por la subvención de los NIH #R00CA201304.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | - |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | - |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | - |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | - |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | - |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | - |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | - |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | - |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | - |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | - |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | - |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | - |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | - |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | - |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | - |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | - |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | - |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
References
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