Summary
इस प्रोटोकॉल ex vivo विकिरण के बाद murine स्तन वसा पैड के decellularization और बाद में hydrogel गठन के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।
Abstract
विकिरण ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर के साथ रोगियों के लिए एक चिकित्सा है. स्वस्थ स्तन ऊतक के extracellular मैट्रिक्स (ECM) और प्राथमिक ट्यूमर साइट पर स्थानीय पुनरावृत्ति में अपनी भूमिका पर विकिरण का प्रभाव अज्ञात हैं. यहाँ हम decellularization के लिए एक विधि प्रस्तुत, lyophilization, और ECM hydrogels के निर्माण murine स्तन वसा पैड से व्युत्पन्न. परिणाम decellularization प्रक्रिया की प्रभावशीलता पर प्रस्तुत कर रहे हैं, और rheological मानकों का मूल्यांकन किया गया. GFP- और luciferase लेबल स्तन कैंसर कोशिकाओं hydrogels में समझाया विकिरणित hydrogels में प्रसार में वृद्धि का प्रदर्शन किया. अंत में, phaloidin संयुग्मी धुंधला encapsulated ट्यूमर कोशिकाओं के cytoskeleton संगठन कल्पना करने के लिए नियोजित किया गया था. हमारा लक्ष्य इन विट्रो अध्ययन के लिए hydrogels fabricating के लिए एक विधि पेश है कि vivo स्तन ऊतक वातावरण में नकल और विकिरण के लिए अपनी प्रतिक्रिया के क्रम में ट्यूमर सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए है.
Introduction
कैंसर कोशिकाओं के अधिक प्रसार की विशेषता है जो एपोप्टोसिस से बच सकते हैं और दूर के स्थलों1तक मेटास्टेसाइज भी कर सकते हैं . स्तन कैंसर अमेरिका में महिलाओं के बीच सबसे आम रूपों में से एक है, एक अनुमान के अनुसार 266,000 नए मामलों और 40,000 मौतों के साथ 20182. एक विशेष रूप से आक्रामक और उपप्रकार का इलाज करने के लिए मुश्किल ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर (TNBC), जो एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर), प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर (पीआर), और मानव epidermal विकास कारक (HER2) का अभाव है. विकिरण चिकित्सा आमतौर पर स्तन कैंसर में प्रयोग किया जाता है lumpectomy के बाद अवशिष्ट ट्यूमर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए, लेकिन TNBC रोगियों के 13% से अधिक अभी भी प्राथमिक ट्यूमर साइट पर पुनरावृत्ति का अनुभव3.
यह ज्ञात है कि विकिरण चिकित्सा मेटास्टेसिस और पुनरावृत्ति को कम करने में प्रभावी है क्योंकि गांठ-उच्छेदन और विकिरण के संयोजन के परिणामस्वरूप स्तनाच्छेदन4के रूप में एक ही दीर्घकालिक अस्तित्व में होता है। तथापि, यह हाल ही में दिखाया गया है कि विकिरण उपचार प्रतिरक्षा समझौता सेटिंग्स5,6में प्राथमिक ट्यूमर साइट के लिए स्थानीय पुनरावृत्ति के साथ जुड़ा हुआ है. इसके अलावा, यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि विकिरण फाइब्रोसिस7को प्रेरित करके सामान्य ऊतक के extracellular मैट्रिक्स (ECM) में परिवर्तन करता है। इसलिए, यह ट्यूमर सेल व्यवहार dictating में विकिरण प्रेरित ECM परिवर्तन की भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
रोग8,9का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडलों में विकोलेकृत ऊतकों का प्रयोग किया गया है . ये विकोशिकीय ऊतक ईसीएम संरचना को संरक्षित करते हैं और विवो ईसीएम में परिसर को पुन: स्वरूपित करते हैं। इस विकोशिकित ऊतक ईसीएम को पुनर्गठित ईसीएम हाइड्रोजेल बनाने के लिए आगे संसाधित और पचा जा सकता है जिसका उपयोग कोशिका वृद्धि का अध्ययन करने और10,11कार्य करने के लिए किया जा सकता है . उदाहरण के लिए, इंजेक्शन hydrogels decellularized मानव lipoaspirate से और मायोकार्डियल ऊतक से प्राप्त ऊतक इंजीनियरिंग के गैर इनवेसिव तरीकों के रूप में सेवा की, और porcin फेफड़ों के ऊतकों से व्युत्पन्न एक hydrogel परीक्षण के एक इन विट्रो विधि के रूप में उपयोग किया गया था मध्यस्किले स्टेम सेल लगाव और व्यवहार्यता12,13,14. ईसीएम गुणों पर सामान्य ऊतक विकिरण क्षति के प्रभाव, तथापि, जांच नहीं की गई है.
ईसीएम से व्युत्पन्न हाइड्रोगेल्स में विवो परिघटनाओं के इन विट्रो अध्ययन के लिए सबसे अधिक क्षमता है। कोलेजन, फाइब्रिन, और मेट्रिगेल सहित कई अन्य सामग्रियों का अध्ययन किया गया है, लेकिन ईसीएम13की संरचना को कृत्रिम रूप से पुन: दोहराना मुश्किल है। ईसीएम व्युत्पन्न हाइड्रोगेल्स का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि ईसीएम में एक विशेष ऊतक14,15के लिए आवश्यक प्रोटीन और विकास कारक होते हैं । lumpectomy के दौरान सामान्य ऊतक के विकिरण ECM करने के लिए महत्वपूर्ण परिवर्तन का कारण बनता है, और ECM व्युत्पन्न hydrogels इन विट्रो में इस प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विधि रोग के इन विट्रो मॉडल में और अधिक जटिल और अधिक सटीक करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
इस अध्ययन में, हम विकिरण पूर्व vivo करने के लिए murine स्तन वसा पैड (MFPs) के अधीन. एमएफपी को विकोशिकीकृत किया गया और पूर्व-जेल समाधान में बनाया गया। hydrogels एम्बेडेड 4T1 कोशिकाओं, एक murine TNBC सेल लाइन के साथ गठन किया गया. hydrogel सामग्री के rheological गुणों की जांच की गई, और ट्यूमर सेल गतिशीलता hydrogels के भीतर मूल्यांकन किया गया. विकिरणित MFPs से निर्मित hydrogels ट्यूमर सेल प्रसार बढ़ाया. भविष्य के अध्ययन अन्य सेल प्रकार को शामिल करने के लिए कैंसर पुनरावृत्ति के संदर्भ में सेल सेल बातचीत चिकित्सा के बाद अध्ययन करेंगे.
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Protocol
पशु अध्ययन संस्थागत दिशा निर्देशों और Vanderbilt विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया.
1. एमएफपी की तैयारी और पूर्व विवो विकिरण
- बलिदान athymic Nu/Nu चूहों (8-10 सप्ताह) सीओ2 asphyxiation गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद का उपयोग कर.
- 70% इथेनॉल का उपयोग कर त्वचा को साफ करें।
- एक 15 एमएल शंकु ट्यूब युक्त पूर्ण RPMI मीडिया (RPMI 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसी और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक) में पूर्व बाँझ कैंची और बलप्स का उपयोग कर बलिदान चूहों से स्तन वसा पैड (सामग्री की तालिका देखें) (सामग्री की तालिका देखें) ).
- एक सीजियम स्रोत का उपयोग कर 20 Gy करने के लिए नमूने विकिरण।
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में विकिरणित MFPs और पूरा RPMI मीडिया लाओ. मीडिया अंतिम हाइड्रोजेल में उगाए जाने वाले सेल लाइन पर निर्भर होगा। MFPs जलमग्न करने के लिए पर्याप्त मीडिया के साथ 6 सेमी या 10 सेमी व्यंजन भरें। 6 सेमी व्यंजन के लिए, मीडिया के 8 एमएल का उपयोग करें, और 10 सेमी व्यंजन के लिए, मीडिया के 20 एमएल का उपयोग करें।
- दो दिनों के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट। इनक्यूबेटर में समय की लंबाई को समायोजित किया जा सकता है।
- फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) में ऊतकों को कुल्ला, अतिरिक्त नमी को दाग, और decellularization तक -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए 15 एमएल शंकु ट्यूबों में MFPs जगह है। यह ठंड कदम decellularization कदम एड्स और नमूना जमे हुए किया जाना चाहिए भले ही अगले कदम अन्यथा तैयार हैं.
2. विकोशिकीकरण (संदर्भ12,16,17) से अनुकूलित )
नोट: यह प्रक्रिया पहले से प्रकाशित वसा decellularization पर ध्यान केंद्रित तरीकों से अनुकूलित किया गया था, जो सोडियम deoxycholate आयनिक डिटर्जेंट के बजाय सोडियम dodecyl सल्फेट शामिल डीएनए कुशलतासे हटाने के लिए12,16 , 17.
- 1 दिन, कमरे के तापमान पर -80 डिग्री सेल्सियस और thaw से जमे हुए MFPs हटा दें।
- एक बार thawed, सूखी MFPs एक नाजुक कार्य पोंछे पर संक्षेप में. एक विश्लेषणात्मक पैमाने का उपयोग कर MFPs वजन.
- कैंची या एक स्केलपेल के साथ संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, ऊतक विभाजित में 3 मिमी x 3 मिमी x 3 मिमी नमूने बरकरार ECM के अध्ययन के लिए और hydrogel उत्पादन के लिए शेष ऊतक.
नोट: नमूनों की संख्या परीक्षण विधियों की संख्या पर निर्भर है, उदाहरण के लिए दो नमूनों के संग्रह के नीचे वर्णित है: एक पैराफिन embedding के लिए (चरण 2.5) और cryostat embedding माध्यम में ठंड के लिए एक, यदि वांछित (सामग्री की तालिका देखें और चरण 2.6). - ऊतकों का वजन करें। यदि अनुभागकेश के लिए पैराफिन में एम्बेड किया गया है, तो चरण 2.5 जारी रखें. यदि cryostat में ठंड अनुभाग के लिए माध्यम embedding, 2.6 कदम जारी रखें.
- एक रासायनिक हुड में, ऊतक को 10% तटस्थ बफर्ड फॉर्मेलिन (एनबीएफ) में डूब नाश करते हैं (सामग्री की सारणीदेखें ) 24 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में 3 बार धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 एच के लिए 30% सुक्रोज में ऊतक जलमग्न।
- अब ऊतक वजन है कि इस टुकड़े को हटा दिया गया है. चरण 2.6 करने के लिए जारी रखें।
- एक रासायनिक हुड में, एक लेबल कैसेट cryostat embedding माध्यम के साथ prepped में MFP टुकड़े जगह है. ऊतक को कवर करने के लिए अधिक क्रायोस्टैट एम्बेडिंग माध्यम जोड़ें।
- कैसेट को 2-मेथिलब्यून के बीकर में रखें (सामग्री की तालिकादेखें) जो तरल नाइट्रोजन के साथ पूर्व ठंडा होता है। बीकर के पास नीचे को कवर करने के लिए पर्याप्त 2-मेथिलब्यूटन होना चाहिए, लेकिन कैसेट को जलमग्न करने के लिए पर्याप्त नहीं होना चाहिए क्योंकि क्रायओस्टैट एम्बेडिंग माध्यम को 2-मेथिलब्यूटन को स्पर्श नहीं करना चाहिए। कैसेट को 2-मेथिलब्यून में तब तक बैठने दें जब तक कि क्रायओस्टैट एम्बेडिंग माध्यम जमा न हो जाता और अपारदर्शी न हो जाता है।
- पन्नी, लेबल में कैसेट लपेटें, और अनुभाग के लिए इस्तेमाल किया जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
नोट: क्रायओस्टैट एम्बेडिंग माध्यम में तुरंत रखे गए ऊतकों को 5 डिग्री मीटर पर काट दिया गया था, जबकि सुक्रोज में इनक्यूबेट किए गए ऊतकों को एडिपोसाइट आकारिकी को बनाए रखने के लिए 30 डिग्री मीटर पर काट दिया गया था।
- शेष ऊतक ों की मैन्युअल मालिश करने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
नोट: ऊतक के टुकड़े भी 24-48 एच के लिए 10% एनबीएफ में रखा जा सकता है, PBS में कुल्ला, और 70% इथेनॉल में छोड़ दिया जब तक पैराफिन में embedding. एम्बेडिंग के बाद, 5 डिग्री मीटर वर्गों hematoxylin और eosin (एच और ई) धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (नीचे अनुभाग 7 देखें). - 5 एमएल 0.02% trypsin/0.05% EDTA समाधान के साथ 6 सेमी व्यंजन में MFPs प्लेस. 1 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और इनक्यूबेटर में रखने से पहले 70% इथेनॉल के साथ व्यंजन पोंछें।
- तीन बार ऊतक पर पानी डालने से deionized (DI) पानी के साथ MFPs धोने के लिए 0.7 मिमी उपभेदों का प्रयोग करें. वॉश के बीच में ऊतक की मैन्युअल रूप से मालिश करने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
- एक नाजुक कार्य पोंछ और वजन पर संक्षेप में सूखी ऊतक. एक पूर्व ऑटोक्लेव्ड बीकर में ऊतकों को रखें जिसमें एक उचित आकार हलचल बार होता है। 3% t-octylphenoxypolyethoxyethanol के 60 एमएल के साथ कवर ऊतकों (सामग्री की तालिकादेखें) ऊतक के 1 ग्राम प्रति और कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए हलचल। कम से कम 20 एमएल का उपयोग करें.
- ऊतक और सामग्री को छलनी में डंप करें। बीकर को डीआई पानी से धो लें और ऊतकों पर डालें। दो बार दोहराएँ. मैन्युअल रूप से rinses के बीच में ऊतक की मालिश करने के लिए संदंश का प्रयोग करें.
- एक नाजुक कार्य पोंछ और वजन पर संक्षेप में सूखी ऊतक. ऊतकों रखें और एक ही बीकर में वापस सलाखों हलचल, और ऊतक के 1 ग्राम प्रति 4% deoxycholic एसिड के 60 एमएल के साथ कवर. कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए हिलाओ. कम से कम 20 एमएल का उपयोग करें.
- ऊतक और सामग्री को जाल छलनी में डंप करें। बीकर को डीआई पानी से धो लें और ऊतकों पर डालें। दो बार दोहराएँ. मैन्युअल रूप से rinses के बीच में ऊतक की मालिश करने के लिए संदंश का प्रयोग करें.
- एक नाजुक कार्य पोंछ और वजन पर संक्षेप में सूखी ऊतक.
- ताजा डीआई पानी के साथ एक ही बीकर में ऊतकों को 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक रखें। पैराफिन फिल्म के साथ कसकर कवर. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दें।
- अगले दिन उपयोग के लिए छन्रों और बीकर को धोएं।
- दूसरे दिनबीकर सामग्री को छलनी में छान लें। एक नाजुक कार्य पोंछ और वजन पर संक्षेप में सूखी ऊतक.
- एक उचित आकार हलचल पट्टी के साथ एक ही बीकर में MFPs प्लेस. ऊतक के प्रति 1 ग्राम 60 एमएल 4% इथेनॉल/0.1% peracetic एसिड समाधान के साथ कवर करें। कम से कम 20 एमएल का उपयोग करें. कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए हिलाओ।
- एक 0.7 मिमी छलनी में ऊतक और सामग्री डंप. मैन्युअल रूप से ऊतक की मालिश करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। सामग्री को वापस बीकर में रखें। इसे 1x पीबीएस प्रति 1 ग्राम के 60 एमएल के साथ कवर करके ऊतक को धोएं। कम से कम 20 एमएल का उपयोग करें. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए हिलाओ। एक बार दोहराएँ.
- एक 0.7 मिमी छलनी में ऊतक और सामग्री डंप. मैन्युअल रूप से ऊतक की मालिश करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। सामग्री को वापस बीकर में रखें। इसे 1 ग्राम ऊतक के प्रति 60 एमएल डीआई पानी के साथ कवर करके ऊतक को धोएं। कम से कम 20 एमएल का उपयोग करें. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए हिलाओ। एक बार दोहराएँ.
- एक नाजुक कार्य पोंछ और वजन पर संक्षेप में सूखी ऊतक. ऊतक और सामग्री को छलनी में डंप करें। मैन्युअल रूप से ऊतक की मालिश करने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
- सामग्री को वापस बीकर में रखें। ऊतक के प्रति 100% n-propanol के 60 एमएल के साथ कवर ऊतकों। कम से कम 20 एमएल का उपयोग करें. कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए हिलाओ.
- एक नाजुक कार्य पोंछ और वजन पर संक्षेप में सूखी ऊतक. एक 0.7 मिमी छलनी में ऊतक और सामग्री डंप. मैन्युअल रूप से ऊतक की मालिश करने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
- सामग्री को वापस बीकर में रखें। इसे 1 ग्राम ऊतक के प्रति डीआई पानी के 60 एमएल के साथ कवर करके ऊतक को धोएं। कम से कम 20 एमएल का उपयोग करें. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए हिलाओ। तीन बार दोहराएँ.
- ऊतक और सामग्री को छलनी में डंप करें। 2-3-2-6 चरणों को दोहराएँ, जो सुक्रोज ऊष्मायन के लिए ऊतक के टुकड़ों को एकत्रित करते हैं तथा क्रायओस्टैट एम्बेडिंग माध्यम में हिमन करते हैं।
- एक नाजुक कार्य पोंछ और वजन पर संक्षेप में सूखी ऊतक. लेबल किए गए 15 एमएल ट्यूब में रखें। -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फ्रीज करें।
3. लाइफिलाइजेशन
- -80 डिग्री सेल्सियस से 15 एमएल ट्यूब निकालें और सूखी बर्फ पर रखें। lyophilizer पर जब तक सूखी बर्फ पर जमे हुए नमूने रखें।
- कैप निकालें. उद्घाटन को कवर करने के लिए शीर्ष करने के लिए एक नाजुक कार्य पोंछ देते हैं करने के लिए एक रबर बैंड का उपयोग करें। कम से कम 2 दिनों के लिए lyophilizer पर नमूने रखो.
- lyophilizer से नमूने निकालें और सूखी बर्फ पर ट्यूब जगह है. नाजुक कार्य पोंछे निकालें एक विश्लेषणात्मक पैमाने पर प्रत्येक नमूना वजन। टोपी और जगह -80 डिग्री सेल्सियस रात में संलग्न करें।
4. मिलिंग
- तरल नाइट्रोजन के साथ एक उथले कंटेनर भरें. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से नमूने निकालें। वजन प्रत्येक lyophilized MFP.
- मोर्टार में एक नमूना रखें. तरल नाइट्रोजन में मोर्टार पकड़ करने के लिए एक क्रायोजेनिक दस्ताने का प्रयोग करें।
- नमूना मिल करने के लिए एक handheld ड्रिल से जुड़ी एक मूसल का प्रयोग करें. 1 मिनट के अंतराल में मिल प्रगति की जांच और तरल नाइट्रोजन से दस्ताने हाथ को दूर करने के लिए। 5 मिनट की एक न्यूनतम के लिए मिल.
- सभी नमूनों के लिए दोहराएँ. स्प्रे और प्रत्येक नमूने के बीच इथेनॉल के साथ मोर्टार और मूसल पोंछ.
- उपयोग के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर 15 एमएल ट्यूबों में पाउडर के नमूने स्टोर करें।
नोट: नमूने तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या रात भर संग्रहीत.
5. हाइड्रोजेल गठन
- यदि रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, हटाने और कमरे के तापमान पर thaw. जबकि thawing, pepsin के आवश्यक वजन की गणना (सामग्री की तालिकादेखें ) और हाइड्रोक्लोरिक एसिड की मात्रा (HCl) प्रत्येक नमूना है कि 1% w/v नमूना पाउडर और 0.1% w/v Pepsin के साथ एक समाधान में परिणाम के लिए आवश्यक 0.01 MHCl. बनाने के लिए एचसीएल के लिए pepsin जोड़ें एक pepsin-HCl समाधान.
- एक 15 एमएल ट्यूब के लिए नमूना पाउडर और pepsin-HCl समाधान जोड़ें. एक छोटे से हलचल बार जोड़ें, और 48 एच के लिए हलचल.
- 5 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब रखें. प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक 10x PBS की आवश्यक मात्रा की गणना करें जिसके परिणामस्वरूप 1x PBS एकाग्रता के साथ समाधान होता है। प्रत्येक ट्यूब के लिए 10x PBS की उपयुक्त मात्रा जोड़ें।
- pH 7.4 तक पहुँचने के लिए प्रत्येक समाधान के लिए 10% v/v 0.1 M NaOH जोड़ें। व्यक्तिगत रूप से परीक्षण करने के लिए एक पीएच पेपर का उपयोग करें।
नोट: जेल समाधान एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
6. hydrogels में कोशिकाओं encapsulating
- GFP- और luciferase-लेबल कक्षों का उपयोग करना
- पीएच 7.4 जेल समाधान का उपयोग करना, छर्रों का उपयोग कर GFP- और luciferase-लेबल 4T1 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए 500,000 या 1,000,000 कोशिकाओं / एक 16 अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जेल सेल समाधान के 16 $L जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पूर्ण RPMI मीडिया के 100 $L जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 एच के लिए ऊष्मायन जारी रखें। GFP- और luciferase-लेबल कोशिकाओं 0 घंटे में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर visualized किया जा सकता है, 24 घंटे, और जेलेशन के बाद 48 घंटे.
नोट: सेल प्रसार GFP के लिए मापा जा सकता है- और luciferase लेबल 4T1 कोशिकाओं को जोड़ने के द्वारा यहाँ इस्तेमाल किया (एस)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarblicoxy एसिड पोटेशियम नमक (सामग्री की तालिकादेखें) 10 मिनट के लिए कुओं के लिए और एक bioluminescence इमेजिंग का उपयोग कर bioluminescence इमेजिंग प्रदर्शन (सामग्री की मेजदेखें). bioluminscence इमेजिंग के बाद, साइटोस्केलेटन कल्पना किया जा सकता है (अनुभाग 10 देखें).
- लेबल न किए गए कक्षों का उपयोग करना
- पीएच 7.4 जेल समाधान का उपयोग करना, 500,000 या 1,000,000 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए गोलीuned unlabeled 4T1 कोशिकाओं / एक 16 अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड और एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जेल सेल समाधान के 16 $L जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया के 100 $L जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 एच के लिए ऊष्मायन जारी रखें।
नोट: सेल व्यवहार्यता मापा जा सकता है (अनुभाग 11 देखें). 16-वेल चैम्बर स्लाइड इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और 96 अच्छी तरह से प्लेट परिमाणीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
7. एच एंड ई धुंधला
- फॉर्मलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक के लिए, डी-पैराफिनाइजेशन के लिए 100% xylene (5-10 मिनट) में दो बार 5 डिग्री सेल्सियस वाले स्लाइड्स को जलमग्न कर ते जाते हैं। 100%, 95%, 85%, और 70% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए प्रत्येक 5 मिनट के लिए DI पानी के बाद में submerging द्वारा rehydrate 7.6 कदम जारी रखें.
- जमे हुए ऊतक वर्गों के लिए, फ्रीजर से तुरंत वर्गों लेने के लिए और उन्हें 10 मिनट के लिए 10% NBF में डूब. 1x पीबीएस में तीन बार 5 मिनट प्रत्येक के लिए धो लो. 5 मिनट के लिए पानी में कुल्ला.
- 3 मिनट के लिए हेमेटॉक्सिलिन के साथ दाग नाभिक नल के पानी में कुल्ला।
- 0.3% एसिड अल्कोहल में 1-2 बार डुबकी द्वारा अंतर (0.3% एचसीएल 70% इथेनॉल में). 5 मिनट के लिए नल का पानी चल रहा है में कुल्ला.
- 30 s. Rinse के लिए ब्लिंग एजेंट 5 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में जोड़ें. 30 s के लिए 95% इथेनॉल में डूब.
- कमरे के तापमान पर 90 s के लिए eosin के साथ इनक्यूबेट। 5 मिनट प्रत्येक के लिए 100% इथेनॉल के 3 परिवर्तन में निर्जलीकरण.
- 5 मिनट प्रत्येक के लिए 100% xylene में दो बार डूब. डिस्टायरीन-प्लास्टिकिसर-xylene जोड़ें (DPX0 बढ़ते मीडिया स्लाइड करने के लिए और एक कवरपर्ची जोड़ें। यह इमेजिंग से पहले रात भर इलाज करते हैं.
8-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol धुंधला
- 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol समाधान तैयार करें।
- 1-([4-Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol पाउडर 100 एमएल प्रोपलीन ग्लाइकोल के साथ एक बीकर में जोड़ें। कम से कम 30 मिनट तक हिलाते हुए 95-100 डिग्री सेल्सियस तक ऊष्मा मरो। तापमान को 100 डिग्री सेल्सियस से अधिक होने से रोकें।
- गर्मी से बीकर निकालें और थोड़ा ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं. किसी भी अवशिष्ट कण को दूर करने के लिए ग्रेड 4 गुणात्मक फिल्टर पेपर के माध्यम से समाधान डालो।
नोट: समाधान कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है और धुंधला करने से पहले तुरंत एक 0.45 डिग्री सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया जाना चाहिए।
- दाग जमे हुए ऊतक वर्गों.
- -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और हवा से स्लाइड निकालें 30 मिनट के लिए सूखी पूर्व ठंडा 10% NBF पर -20 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 मिनट के लिए एक Coplin जार में. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड्स को ठीक करें। DI पानी में 3 बार 5 मिनट प्रत्येक के लिए धोएं।
- प्रोपलीन ग्लाइकोल में डुबोने से पहले एक नाजुक कार्य पोंछे का उपयोग कर अतिरिक्त पानी निकालें 2 बार 5 मिनट प्रत्येक के लिए। प्रोपलीन ग्लाइकोल से स्लाइड्स निकालें. कुल्ला मत करो.
- कमरे के तापमान पर 3 एच के लिए सिरिंज फ़िल्टर्ड तेल लाल ओ धुंधला समाधान में स्लाइड रखें।
- 5 मिनट के लिए 85% प्रोपलीन ग्लाइकोल में स्लाइड रखकर अलग करें। पीबीएस में दो बार 5 मिनट के लिए नमूने कुल्ला करें।
- 30 s. 5 मिनट के लिए नल के पानी में चल रहा है और फिर DI पानी में स्लाइड जगह में धो के लिए hematoxylin के साथ दाग के नमूने.
- जलीय आधारित बढ़ते माध्यम का उपयोग कर माउंट नमूने और इमेजिंग से पहले रात भर सुखाने के लिए मीडिया की अनुमति.
9. Rheology
- बर्फ पर rheometer के लिए चरण 5.4 से पूर्व जेल समाधान लाओ.
- एक 25 मिमी हाथ और प्लेट को rheometer के लिए संलग्न करें। rheometer से जुड़े कंप्यूटर पर rheology सॉफ्टवेयर खोलें.
- घूर्णी मानचित्रण प्रदर्शन और शून्य अंतर निर्धारित करते हैं। पूरा होने पर हाथ उठाएँ.
- प्लेट पर प्री-जेल के पिपेट 500 डिग्री सेल्सियस। पूर्व जेल समाधान पूरी तरह से थाली और हाथ के बीच के अंतर पर कब्जा कर लेता है जब तक हाथ कम. रूढ़िवादी रहो क्योंकि हाथ पिछले इस बिंदु को कम पूर्व जेल समाधान पक्ष से बाहर spilling में परिणाम होगा.
- यह 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बनी हुई है के बाद से पूर्व जेल समाधान पर एक आवृत्ति स्वीप प्रदर्शन 0.1-100 हर्ट्ज.
- पूरा होने पर rheometer हाथ उठाएँ. एक नाजुक कार्य पोंछे के साथ तरल साफ करें। DI पानी के साथ कुल्ला और एक नाजुक कार्य पोंछ के साथ पोंछें। अतिरिक्त नमूनों के साथ 9-4-9.6 चरणों को दोहराएँ.
10. एफ़-एक्टिन का फल्लॉयडिन संयुग्मी धुंधला
- कमरे के तापमान के लिए phaloidin संयुग्मी समाधान लाओ. खोलने से पहले एक कम गति पर संक्षिप्त अपकेंद्रित्र. Alicot परख के लिए पर्याप्त समाधान है, और -20 डिग्री सेल्सियस पर बाकी की दुकान.
- 1 एमएल 1x पीबीएस + 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) के लिए 1 $L स्टॉक समाधान जोड़कर एक 1x कार्य समाधान के लिए 1000x phaloidin संयुग्मी स्टॉक समाधान को पतला करें। यह 10 कुओं के लिए पर्याप्त बनाता है (100 $L/
नोट: एक सादे 1x पीबीएस का उपयोग कर सकते हैं, लेकिन 1x पीबीएस + बीएसए ट्यूब से चिपके से phaloidin संयुग्मी को रोकने के लिए पसंद किया जाता है। परख के बाद इस समाधान को संग्रहीत न करें. 1 $L नीले फ्लोरोसेंट डाई (सामग्री की तालिकादेखें ) कार्य समाधान नाभिक के लिए दाग में जोड़ा जा सकता है. कार्य समाधान 11.3 डिग्री एल 1x पीबीएस के साथ 20 लाख नीले फ्लोरोसेंट डाई के 1 डिग्री सेल्सियस मिश्रण द्वारा किया जा सकता है। - कुओं से Aspirate मीडिया (कदम 6.1). 1x पीबीएस के साथ कुओं कुल्ला.
- 10% एनबीएफ जोड़ें. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 10% एनबीएफ के साथ इनक्यूबेट कुओं। अतिनिशांत को हटा दें। हर बार 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3 बार धोएं।
- पीबीएस में 0.1% टी-Octylphenoxypolyethoxyethanol 5 मिनट के लिए जोड़ें और पीबीएस के साथ 3 बार धोने के लिए 5 मिनट हर बार.
- प्रत्येक अच्छी तरह से चरण 10.2 से कार्य समाधान के 100 $L जोड़ें। कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट। Aspirate और 5 मिनट हर बार के लिए पीबीएस के साथ 3 बार धो लें. पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
- Aspirate और कक्ष स्लाइड पर गैसकेट से कुओं को हटा दें. स्लाइड से गैसकेट को हटाने के लिए सुई नाक चिमटी का प्रयोग करें। जलीय आधारित बढ़ते माध्यम का उपयोग कर माउंट और कवरस्लिप नमूने। (5 मिनट) का इलाज करने की अनुमति दें।
- 590/618 दउ के उत् तेजन/उत्सर्जन पर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के अंतर्गत कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
11. व्यवहार्यता परख
- Dulbecco के पीबीएस (DPBS) के साथ कोशिकाओं कुल्ला. प्रत्येक कुएं में 1 डिग्री सेल्सियस कैल्सिन एएम और 2 डिग्री एम एथिडियम होमोडाइमर युक्त 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा 16-वेल चैम्बर स्लाइड छवि। कैल्सीन एसीटोक्सीमेथिल (कैल्सीन ए एम) उत्तेजना/उत्सर्जन पर देखा जा सकता है - 494/517 एनएम। एथिडियम होमोडीमर को उत्तेजना/उत्सर्जन पर देखा जा सकता है - 528/645 द.उ.
- चरण 11-2 में एक ही तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके प्लेट रीडर पर 96-वेल प्लेट पढ़ें।
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Representative Results
चित्र 1कमें दर्शाए गए प्रक्रिया का उपयोग करते हुए विकिरण के बाद एमएफपी को विकोशिकीकृत किया गया था। MFPs पूर्व-decellularization (चित्र 1B) और पोस्ट-decellularization (चित्र 1C) दिखाए गए हैं. Decellularization hematoxylin और eosin (एच और ई) धुंधला का उपयोग कर की पुष्टि की थी, और 1-([4-(Xylylazo)xylylazo)-2-naphthol धुंधला लिपिड सामग्री का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (चित्र 2). ईसीएम हाइड्रोजेल्स के रूलॉजिकल गुणों का भी 37 डिग्री सेल्सियस (चित्र3) पर मूल्यांकन किया गया था। भंडारण मापांक सभी स्थितियों के लिए हानि मापांक से अधिक था, स्थिर hydrogel गठन का प्रदर्शन.
GFP- और luciferase लेबल 4T1 स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं hydrogels में encapsulateथे. कोशिका प्रसार की जांच फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, जैव-दीप्ति माप तथा एनकैप्सुलेशन के बाद 48 एच को धुंधला करने वाली व्यवहार्यता द्वारा की गई थी (चित्र 4)। विकिरणित hydrogels ट्यूमर सेल प्रसार में एक बढ़ती प्रवृत्ति से पता चला. फल्लॉयडिन संयुग्मी का प्रयोग encapsulated कोशिकाओं में F-actin की कल्पना करने के लिए किया गया था (चित्र 5)। इस तकनीक का उपयोग कोशिका आकारिकी और साइटोस्केलेटल गुणों की जांच करने के लिए किया जा सकता है।
चित्र 1: प्रायोगिक कार्यप्रवाह. (क) हाइड्रोजेल गठन का स्नेमेटिक। डिजिटल कैमरा छवियों MFPs पूर्व (बी) और पोस्ट decellularization (सी) के लिए लिया गया था . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: एमएफपी में विकोसेल्यूलेकन और वि-लिपिडेशन की पुष्टि। हेमाटॉक्सिलिन और ईओसिन स्थायिक (एच एंड ई ) अनिर्दीएम के एमएफपी को पैराफिन में एम्बेड किया गया और 5 डिग्री मी (ए) में शामिल किया गया , की तुलना क्रायोस्टैट एम्बेडिंग मीडियम (5 डिग्री मीटर सेक्शन ) से पहले (बी ) और अपकेलाइजेशन (सी) में जमे हुए एमएफपी की तुलना की गई थी , क्रायोस्टैट एम्बेडिंग माध्यम में ठंड से पहले सुक्रोज के साथ इनक्यूबेट किया गया और 30 डिग्री (डी) पर काट दिया गया । 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol धुंधला करने से पहले cryostat embedding मध्यम (5 m वर्गों) में जमेहुए MFPs में लिपिड प्रतिधारण कल्पना करने के लिए किया गया था (ई ) और decellularization के बाद (एफ) और में ठंड से पहले sucrose के साथ incubated क्राइओस्टैट एम्बेडिंग मध्यम और 30 डिग्री मीटर खंड (जी) पर काट दिया गया है। स्केल बार 50 डिग्री मीटर का प्रतिनिधित्व करते हैं। विसेल ] विकोशिकीकरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: हाइड्रोजेल गठन की पुष्टि। नियंत्रण के भंडारण और हानि मापांक (ए) और विकिरणित (बी) पूर्व जेल समाधान 37 डिग्री सेल्सियस और 0.5% तनाव पर एमएफपी से बने निर्धारित करने के लिए Rheology का उपयोग किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन दिखाएँ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: विकिरणित ईसीएम हाइड्रोगेल्स में ट्यूमर सेल प्रसार। 4T1 सेल प्रसार 48 एच टीका के बाद पूर्व जेल नियंत्रण से व्युत्पन्न के साथ दिखाया गया है (ए) और विकिरणित (बी) MFPs. (सी) Bioluminscence संकेत से 4T1 नियंत्रण और विकिरणित hydrogels के भीतर एम्बेडेड कोशिकाओं. कैल्सिन ए एम दाग लाइव कोशिकाओं और इथिडियम होमोडाइमर दाग मृत कोशिकाओं को नियंत्रण में मूल्यांकन किया गया (डी) और विकिरणित (ई) हाइड्रोजेल्स , और जीवित / स्केल बार 200 डिग्री मीटर का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि पट्टियाँ मानक त्रुटि दिखाएँ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: ईसीएम हाइड्रोगेल्स में साइटोस्केलेटल गुण। (क) के भीतर के सेल नियंत्रण और (बी) विकिरणित ईसीएम हाइड्रोजेल्स को एफ-एक्टिन (लाल) और नीले फ्लोरोसेंट डाई को विकिरणित एमएफपी स्केल बार में कल्पना करने के लिए फलालॉयड संयुग्मी के साथ दागा जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| ऊतक वजन (छ) | नियंत्रण (0 जी) |
विकिरणित (20 Gy) |
| प्रारंभिक MFP वजन | 0.461 | 0.457 |
| ऊतक विज्ञान नमूना हटाने के बाद MFP वजन | 0.423 | 0.416 |
| विकोशिकीकरण के बाद एमएफपी भार | 0.025 | 0.025 |
| ऊतक विज्ञान नमूना हटाने के बाद decellularized MFP वजन | 0.015 | 0.016 |
तालिका 1: ऊतक वजन से पहले और decellularization के बाद. प्रत्येक स्थिति के लिए प्रतिनिधि ऊतक वजन से पहले और MFP decellularization के बाद मापा गया.
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Discussion
hydrogel गठन की यह विधि काफी हद तक शुरू ऊतक की मात्रा पर निर्भर है. Murine MFPs छोटे होते हैं, और decellularization प्रक्रिया सामग्री की एक महत्वपूर्ण कमी में परिणाम (तालिका 1) . अंतिम उपज बढ़ाने के लिए इस प्रक्रिया को अधिक एमएफपी के साथ दोहराया जा सकता है। मिलिंग एक और महत्वपूर्ण कदम है कि सामग्री की हानि के लिए नेतृत्व कर सकते है. दूसरों को एक क्रायोजेनिक मिल के साथ सफलता दिखाई है, लेकिन इस प्रोटोकॉल एक हाथ में मोर्टार और एक मूसल लगाव8,17के साथ बिजली ड्रिल के माध्यम से मिलिंग पर आधारित है. यह कम पूंजी लागत का लाभ है और सामग्री हानि को कम करने, लेकिन अंतिम उत्पाद में परिवर्तनशीलता परिचय हो सकता है.
decellularization और de-lipidation की पुष्टि करने के लिए एक चुनौती cryostat embedding माध्यम में वसा ऊतक ठंड में है. चित्र ााााे ः H व E staining of a unirradiated MFP एम्बेडेड and sectioned in paraffin. विशिष्ट नाभिक अन्य कोशिकाओं के साथ जंक्शनों के पास वसा कोशिकाओं के किनारों पर दिखाई दे रहे हैं, और एडिपोसाइट आकारिकी अच्छी तरह से बनाए रखा है। चित्र 2B ,सी, ई, एफ शो MFPs embedding और cryostat embedding मध्यम और 5 डिग्री मीटर स्लाइस अनुभाग में एमएफपी ठंड द्वारा तैयार किया। यह प्रक्रिया एडिपोसाइट आकारिकी और आकार को बनाए रखने में असमर्थ थी। तथापि, न्यूक्लिय के नाभिक ों के नुकसान और अन्य अंशों के माध्यम से विकोलेकन की पुष्टि की गई थी (चित्र 2ै च) और तटस्थ लिपिड सामग्री के दाग के नुकसान के साथ वि-लिपिडेशन की कल्पना की गई थी (चित्र 2 थ्)। एडिपोसाइट आकारिकी को सुक्रोज में एमएफपी को इनक्यूबेट करके, क्रायोस्टैट एम्बेडिंग माध्यम में एम्बेड िंग और फ्रीजिंग द्वारा बनाए रखा गया था, और 30 डिग्री मीटर स्लाइस को काट दिया गया था (चित्र 2डी, जी)। जबकि एच और ई धुंधला के दृश्य इस विधि के साथ मुश्किल था (चित्र 2 डी), 1-([4-Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol धुंधला adipocyte आकारिकी के प्रतिधारण की पुष्टि की ( चित्र ासाकीर्तक ).
हम एक इन विट्रो hydrogel मॉडल है कि vivo सामान्य ऊतक microenvironment और विकिरण क्षति के लिए अपनी प्रतिक्रिया में नकल कर सकते हैं विकसित किया है. इसी तरह के अध्ययनों में ईसीएम हाइड्रोजेल्स का निर्माण किया गया है , लेकिन ट्यूमर कोशिका व्यवहार पर विकिरण क्षति के प्रभाव का आकलन नहीं किया गया है9,12,16,17,18. हम उम्मीद करते हैं कि एमएफपी के विकिरण ईसीएम रीमॉडलिंग और संरचना को बदल देगा, और इन संरचनात्मक परिवर्तनों को भविष्य के अध्ययनों में विशेषता होगी। हमने जैव-दीप्ति इमेजिंग तथा व्यवहार्यता अभिरंजन दोनों का उपयोग करते हुए विकिरणित ईसीएम हाइड्रोगेल्स के भीतर 4T1 कोशिकाओं के प्रसार में बढ़ती प्रवृत्ति देखी (चित्र 4)। इसके अलावा, हम phaloidin संयुग्मी का इस्तेमाल किया एफ-actin फिलामेंट में encapsulated ट्यूमर कोशिकाओं दाग और विकिरणित ईसीएम hydrogels में actin संरेखण और ट्यूमर सेल बढ़ावमें में एक गुणात्मक वृद्धि पाया, जो आसंजन शक्ति में वृद्धि से पता चलता है और आक्रामक क्षमता (चित्र 5)19,20. भविष्य के प्रयोगों सेल प्रवास और आक्रमण के मूल्यांकन के लिए फोकल आसंजन गतिशीलता और protease मध्यस्थता remodeling में परिवर्तन का पता लगाने जाएगा.
इस विधि एक murine TNBC सेल लाइन का उपयोग कर विकसित किया गया था, लेकिन इस विधि के प्रसार और अन्य सेल प्रकार के आक्रामकता के मूल्यांकन के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. भविष्य के अध्ययन प्रतिरक्षा कोशिकाओं को शामिल करने के लिए विकिरण के जवाब में अपनी भूमिका के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऊतक क्षति के अन्य रूपों (जैसे, सर्जरी) निर्धारित कर सकते हैं. हालांकि इस अध्ययन MFPs विकिरणित पूर्व vivo से ईसीएम hydrogels मूल्यांकन, अतिरिक्त अध्ययन MFPs के vivo विकिरण में पता लगाने के लिए शारीरिक विकिरण प्रतिक्रिया के प्रभाव का मूल्यांकन और ईसीएम विशेषताओं पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं घुसपैठ करेंगे. हम ट्यूमर सेल व्यवहार पर सामान्य ऊतक विकिरण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए माउस MFPs से ECM hydrogels बनाने के लिए एक विधि की स्थापना की है, और इस तकनीक को एक और अधिक प्रासंगिक hydrogel मॉडल के लिए मानव ऊतक के लिए बढ़ाया जा सकता है. कुल मिलाकर, ECM hydrogels के माध्यम से सामान्य ऊतक क्षति की जांच स्थानीय पुनरावृत्ति में विकिरण चिकित्सा के बाद ECM परिवर्तन की भूमिका में अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों GFP प्रदान करने के लिए डॉ लौरा एल Bronsart धन्यवाद- और luciferase-4T1 कोशिकाओं, डॉ एडवर्ड एल LaGory पर सलाह के लिए 1-([4-Xylylazo)xylylazo)-2-naphthol धुंधला, डॉ क्रेग एल Duvall IVIS और lyophilometer उपयोग के लिए, और डॉ. उपयोग. इस शोध को #R00CA201304 NIH अनुदान द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | - |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | - |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | - |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | - |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | - |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | - |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | - |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | - |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | - |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | - |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | - |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | - |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | - |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | - |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | - |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | - |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | - |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
References
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