Summary
形態学的変化は、活性化後の免疫応答性線維芽細胞で起こり、細胞募集の変化を促進する。遺伝子組み換え線維芽細胞特異的タンパク質1(FSP1)-creと組み合わせて2光子イメージングを利用する。tdTomatoフロキセドストップフロキシング(TB/TB)マウスラインと緑色蛍光タグ付きリポ多糖-FITCは、真皮線維芽細胞におけるリポ多糖類の非常に特異的な取り込みおよび生体内の形態変化を示すことができる。
Abstract
線維芽細胞は、活性化時に形態を変化させる間葉細胞であり、最終的にそれらが位置する組織の微小環境に影響を与える。従来のイメージング技術は、固定組織におけるタンパク質相互作用や形態の同定に役立ちますが、細胞がタンパク質を結合して取り込む速度に関する洞察を与えることができ、一度その形態がどのように変化するかを活性化することはできません。生 体内。本研究では、2つの大きな疑問を提起する:1)トール様受容体-4(TLR4)とリポ多糖(LPS)相互作用による線維芽細胞活性化の時間経過とは2)これらの細胞は一度活性化されるとどのように振る舞うのか?2光子イメージングを用いて、遺伝子レポーターマウスラインの末梢線維芽細胞に発現した覚後受容体TLR4に結合するLPS-FITCの能力を評価する新しい技術を開発した。FSP1cre;生体内のtdTomatoロックストップロックス。このユニークなアプローチにより、研究者は、タンパク質が細胞の挙動をどのように変化させるかを理解する上で、生細胞と相互作用するタンパク質の詳細なタイムラプスビデオや写真を作成することができます。
Introduction
リポ多糖類(LPS)は、グラム陰性菌1の外膜に見出されるエンドトキシンである。LPSは、トール様受容体4(TLR4)/CD14/MD2受容体複合体2に対して高い結合親和性を有する。TLR4は、広範囲の免疫細胞、間葉系細胞、および感覚ニューロン3、4、5のサブセットの外膜上に一般的に見出されるパターン認識受容体である。免疫細胞に発現するTLR4の活性化は、MyD88依存性および独立した第2メッセンジャーシステムにつながり、核因子カッパベータ(NFκB)細胞の核への転移で終わる。これは、プロトティクス性免疫細胞がインターロイキン(IL)-1β、IL-6、およびTNF-α6などのプロトチピックサイトカインを産生し、放出する原因となる。しかし、他の細胞型がTLR4刺激にどのように反応するかは、それほど明確ではない。線維芽細胞は、癌および嚢胞性線維症などの病態の広い範囲に関与しており、最近、単球化学引き出しおよび炎症を促進する役割を果たすることが示されている7,8,9. 初期のエビデンスは、線維芽細胞(マトリックスメタロプロテイナゼス(MmP)、メタロプロテイラー酵素(TIMP)、および線維芽細胞の組織阻害剤によって放出される因子を示唆しているように、急性および慢性疼痛の発症における線維芽細胞の役割に興味を持っています。成長因子(FGF)は神経因性疼痛10に関与している。
細胞の活性化状態は、即時早期遺伝子の誘導、タンパク質発現の変化、細胞増殖、および形態変化11、12、13を含む様々な因子によって決定することができる。細胞の活性化が病理にどのように寄与するかについての疑問に答えるために存在する多くのテクニックがありますが、それらはすべて限界があります。原型的な免疫組織化学は、蛍光タグ付き抗体を使用して固定組織に目的とするタンパク質を標識するが、これは特異的でなく、多くの場合、実りある結果を得る前に重要なトラブルシューティングを必要とする14。ウェスタンブロッティングは、死後組織におけるタンパク質発現のレベルを比較する際に有用な技術である。しかし、組織学的成分はこの技術に欠けており、研究者は形態15の変化を特定することができない。RNA-Seqを使用すると、多くの場合、洞察に満ちたデータを得るサンプル中のメッセンジャーRNAの存在を定量化できます。しかし、転写と翻訳の間のギャップは、刺激16の後に時間的解決を持つことを困難にする。共焦点イメージングは、組織17の断面に存在するタンパク質の発現および共局在を決定するのに有用である。多くの場合、これは組織試料全体を代表するものではありません。対照的に、マルチフォトン顕微鏡は、ユーザーがサンプルに約1mmの深さに画像を撮ることを可能にし、包括的な3次元表現18を作成する。したがって、これらの実験から収集されたデータは、生体組織の高度にプラスチックと相互接続された微小環境とより直接的に関連しているので、我々は生体内、2光子イメージングの準備に焦点を当てることを選択します。
生体内でタンパク質受容体相互作用を研究する利点は、死後組織抽出19の有害で予測不可能な影響なしに、細胞が刺激にリアルタイムで反応する方法を明確に捕捉できることである。さらに、縦方向の研究は、活性化のために起こりう可能性のある細胞の可塑性およびプライミングを評価するために行われてもよい。 2光子イメージングを用いて、外部刺激を加えた場合の微小環境の完全性を維持します。このプロトコルは、生体内で数時間にわたって蛍光タグ付きLPSの末梢注入後の線維芽細胞中の分子の取り込みおよび線維芽細胞活性化におけるTLR4の役割を同定する方法を提供する。
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Protocol
動物の手順は、ダラス大学ダラス動物ケア使用委員会によって承認され、国立衛生研究所のガイドラインに従っていました。 全ての実験は、C57BL/6を背景に社内で飼育された8-12週齢の雄と雌のマウスを用いて行った。線維芽細胞特異的タンパク質-1プロモーターによって駆動されるクレ-レコンビネーゼを有するトランスジェニックマウスは、商業的に購入された(Jackson, 012641)(FSP1cre)+/およびtdTomatolox-stop-loxマウスと交差し、また商業的に購入された(ジャクソン、 007914) と (FSP1cre)+/- ;tdTomatoロックストップロックスと FSP1cre-/-;tdTomatolox-stop-loxマウスは、C57BL/6の背景で社内で飼育された(図1A,B,C)。線維芽細胞特異的タンパク質1は、線維芽細胞の約72%に発現する内因性タンパク質であり、真皮組織20における有効なcreドライバを表す。マウスを集団収容し、食物と水へのアドリビタムアクセスを与えた。室温を21±2°Cに維持した。我々は8-12週にC57BL/6交差雄マウスと雌マウスを使用しましたが、我々は年齢、性別、または遺伝的背景が多光子実験を実行するために必要な要件であるとは考えていません。マウスは実験直後に深く麻酔し、安楽死させた。
1. 薬剤の調製
- 無菌1x PBS(pH 7.4)でリポ多糖-FITC(材料の表を参照)の5 μg/20 μL溶液を調製します。ピペッティング前に溶液全体に等しい濃度を保障するために、中程度の強度でストック溶液を最小限の30秒間渦下します(LPSはもちもち分子です)。
注:可能であれば、ガラス容器にLPSを入れないでください、シリコン化マイクロ遠心管を使用してください。使用するまで氷の上に保管してください。
2. イメージングセットアップ
- 2 色イメージング用のマルチフォトンシステム(材料の表を参照)を設定します。これには、2つの別々の励起レーザー(材料表を参照)、GFP/RFPフィルタキューブセット(材料テーブルを参照)、および25x(1.05 NA)の浸水目的(材料の表を参照)を使用する必要があります。
注:ユーザーは、より良い代替セットアップやマルチフォトン顕微鏡機能に合わせてこれらの設定を変更することができます。これらは実験プロトコルで使用されるパラメータです。具体的な詳細については、資料表を参照してください。 - 多光子顕微鏡のステージに立体装置(材料の表を参照)を配置します。これを麻酔デリバリーマシン(材料の表を参照)に接続して、実験中に動物が麻酔されていることを確認します。マウスの足の接続点として、装置の表面にマットな黒い紙を置きます。
- 512 μm x 512 μm の固定スキャン領域を持つ共振スキャナを選択します。
注: ガルバノメータースキャナを使用して、このプロトコルで実験を行わなくてはなりません。サンプルレートが遅いため、やむを得ない動物の呼吸によるZスタックタイムラプスビデオに歪みがあります。 - 2つの励起レーザーをGFPとRFP、930 nmおよび1100 nmの励起波長にそれぞれ調整し、930 nmチューニング励起レーザーを可能にする690-1,050 nmのダイクロイックミラーを使用して、両方の励起レーザーの光経路を単一の目的に向けます。メインスキャナと1,100nmチューニングされたレーザーに反射して、メインスキャナに直接渡します(図2)。
注:ユーザーの設定に応じて、これらの励起波長を変更することができます。 - FITCのレーザーパワーを5%、GFPを20%に設定します。
注: この設定は、これらの実験で最適な信号対雑音比(SNR)を提供します。マルチアルカリ光乗数チューブ(PMT)を介して信号を検出します。ただし、GaAsP検出器は、代わりに非常に高感度の実験で使用できます。 - 迷光のない暗い条件下でイメージングのための部屋を準備します。
3. インビボイメージング
- マウスを麻酔送達システムの誘導室に入れ、5%のイソファラン(材料の表を参照)を2L/minの酸素の流量で使用し、マウスを深い麻酔下に置きます。
注:実験中にすべての適切なPPEを着用することを強くお勧めします。- 実験を通して麻酔を維持するために鼻コーンへのアクセスを持つ立体装置にマウスを移す。イソファランを1.5%-2%に減らし、流量を一定に保ちます。
-
後ろ足を黒い紙にしっかりと貼り付け、近位と遠位の両方の領域に黒いテープを貼り付けます(これは、マウスの呼吸が画質に与える影響を軽減します)、足の足底表面が妨げられずに向かっていることを確認します。目標に向かって上向きに。マウスの頭部が装置に取り付けられたノーズコーン内で安定していることを確認します。
注:実験中に苦痛や脱水の兆候がないかマウスを監視し、それに応じてイソルランを調整します。
- 足の足底表面に無菌水系潤滑剤(ゲル、材料の表を参照)を寛大な量を配置し、足と目的の間に液体の列を作成するために、それに目的に触れます。
- FITC励起光を使用して、足の真皮層に焦点を合わせます。続行する前に、tdTomato タグ付き線維芽細胞が視覚化されていることを確認します (この手順は、イメージへの正しい焦点面を決定する際に重要です)。
注:足の真皮層は、足に約100〜150 μmです。 - 930 nmと1100 nmチューニングされたレーザーの両方で後ろ足の足底表面のすぐ下に位置する細胞の領域を画像化し、1スライスあたり約1μmで約5〜10 zスライスの15分のタイムラプスを取得し、前に環境の表現を確立します。LPS-FITCとの注入。
- 25 μLガラスハミルトンシリンジ(材料の表を参照)と30G針(材料の表を参照)を使用して、マウスの後ろ足に5 μg/20 μL LPS-FITCのプランター内注入を行い、足の位置を乱しないように注意してください。
- 930 nmと1100nmの両方のレーザーで後足の足底表面のすぐ下に位置する細胞の領域を画像化し、細胞によってLPS-FITCの取り込み量を同定するために、スライスあたり約1μmで約5〜120分の時間経過を約60〜120分の時間経過を得る。
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Representative Results
当初、野生型マウスの後足にLPS-FITCを注入し、足の真皮層に存在するすべての細胞型におけるLPS-FITCの取り込みを可視化した。野生型マウスで後足取り取りLPSの真皮層に無数の細胞を観察した(ビデオ図1,2)。LPS-FITCを注入した動物の足をイメージングする前に、真皮層に細胞の固有の蛍光がないことを明確にしたいと考えていました。これは、注射後に撮影する画像が、蛍光タグ付きLPSと細胞の真の相互作用であり、イメージングアーティファクトではないことを保証するためです(ビデオ図3,4)。LPS-FITC注射後、TLR4を発現するFSP1+線維芽細胞のみが、注入されたタンパク質を結合して取り込み、これらの細胞によって発現されるtdTomatoタグとの高レベルの共局在を有する(ビデオ図5)。対照的に、TLR4を持つマウスは全身からノックアウト(TLR4KO)は、注射後にLPSを結合および取り込まない。ビデオで明らかなように、細胞のシルエットは、薬物が細胞の周りの間質液中に分散しているが、実際には受容体に結合されていないことを示すLPS-FITC注射後に見える(ビデオ図6)。
我々の結果を要約すると、我々は、LPS-FITCの注入後、FSP1creで、生体内で示す。tdTomatolox-stop-lox細胞特異的再活性化動物のみ線維芽細胞がLPSと相互作用し、取り込む。対照的に、TLR4の全身ノックアウトは、注射後にLPS-FITCを結合し、取り込まない。
図 1.tdTomato は、FSP1+線維芽細胞でのみ、Cre 依存的な方法で表現されます。A)C57BL/6の背景で飼育されたFSP1creトランスジェニックマウスは、C57BL/6の背景で飼育されたtdTomatoマウスと交配し、FSP1+線維芽細胞で発現したマウスを生成する。B)tdTomatoを発現する陽性および陰性のFSP1creマウスの両方を描写した代表的なPCR結果。C)マウス足に位置する細胞外空間における真皮線維芽細胞の代表的な絵文字。FSP1+マウスは線維芽細胞のみで赤色蛍光タンパク質を発現するが、FSP1-マウスは発現しない。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.2色2光子顕微鏡の光経路。2色2光子実験に設定された光路の描写。レーザー1はFITC結合LPSを励起するために930 nmに調整され、レーザー2は線維芽細胞に見られるtdTomatoを励起するために1100 nmにチューニングされる。レーザー1からの励起光は、レーザー2からの励起光がメインスキャナに通過しながら、ダイクロイックミラー(690〜1050nm)によって反射されます。両方のレーザーからの励起光は、第2のダイクロイックミラー(650 nm)にミラーのセットによって反射され、励起光が目的を通過し、組織に蛍光体を励起することを可能にする。励起された蛍光体から光が放出され、25倍の目的によって捕捉され、多アルカリ光増数管にダイクロイックミラー(650)によって反射されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.2-フォトン顕微鏡の実験フローチャート。マウスは、低流量麻酔システムおよび立体装置を用いて麻酔および固定化される。足の足底表面は目的に直面し、15分間画像化されます。5 μg/20 μL LPS-FITCのプランタル内注射は麻酔マウス上で行われ、足は実験の目標に必要な時間の間画像化されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ図 1.野生型C57BL/6マウスにおける細胞におけるLPS-FITC取り込みのZスタックビデオLPS-FITC注入前のC57BL/6マウスの後肢の真皮層のZスタックビデオ。野生型マウス足の足底の側面を、LPS-FITCで注射する前に15分間画像化し、GFPチャネルで生成された自己蛍光を制御した。GFPチャネルには、自己蛍光を示すシグナルはほとんどありません。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
ビデオ図 2.LPS-FITC注射後のC57BL/6マウスの後肢の真皮層のZスタックビデオ。野生型マウス足の足底の側面を1.5時間撮影し、TLR4を発現するすべての細胞によるLPS-FITCの取り込みを可視化した。ビデオで明らかなように、多数の細胞が結合し、実験の過程でLPS-FITCを取り込みます。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
ビデオ図 3.FSP1creの後ろ足の真皮層のZスタックビデオ;LPS-FITC注射前のtdTomatoマウス。FSP1creの足底の側面;tdTomatoマウスの足をLPS-FITCで注射する前に15分間画像化し、GFPチャネルで生成される自己蛍光を制御した。GFPチャネルには、自己蛍光を示すシグナルはほとんどありません。tdトマト陽性線維芽細胞が可視化される。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
ビデオ図 4.LPS-FITC注射前のTLR4KOマウスの後足の真皮層のZスタックビデオ。TLR4KOマウス足の足底の側面を、GFPチャネルで生成された自己蛍光を制御するためにLPS-FITCで注射する前に15分間画像化した。GFPチャネルには、自己蛍光を示すシグナルはほとんどありません。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
ビデオ図 5.FSP1creの後ろ足の真皮層のZスタックビデオ;LPS-FITC注射後のtdTomatoマウス。 FSP1creの足底の側面;tdTomatoマウスの足を1.5時間撮影し、TLR4を発現するtdTomato陽性線維芽細胞によるLPS-FITCの取り込みを可視化した。ビデオで明らかなように、tdTomato陽性線維芽細胞で発現されるTLR4を介したLPS-FITCの非常に特異的な取り込みが見られる。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
ビデオ図 6.LPS-FITC注射後のTLR4KOマウスの後足の真皮層のZスタックビデオ。 TLR4KOマウス足の足底の側面を1.5時間撮影し、TLR4の全身ノックアウト中の細胞によるLPS-FITCの取り込みが可能かどうかを可視化した。ビデオで明らかなように、LPS-FITCの取り込みは後足の真皮層の細胞によって見られない。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
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Discussion
間違いなく生体内2光子イメージングの最も重要なステップは:1)マルチフォトンのセットアップと実験的なニーズ21、22のための右の遺伝的レポーターマウスと蛍光タグ付きタンパク質を選択します。2)組織23内の細胞集団の正確な表現を持つために正しい焦点面をイメージング;3)不適切に固定された動物24による動きを最小限に抑える;4)定量的にデータを分析するタイミングを選択する 25,26,27.実験を開始する前にこれらの点に対処することを保証することは、再現性と科学的に厳格なデータを収集するための知識を提供します。
プロトコルにおける重要な考慮事項は、画像化する領域を適切に固定することです。動物からの呼吸は、イメージング中に焦点面の微小なシフトを引き起こし、Zスタックとタイムラプスビデオを実行すると、ビデオに大きな歪みが生じ、生成されるデータの品質に悪影響を及ぼす可能性があります。足が適切に固定されていることを確認すると、呼吸の中断なしに足のイメージングを成功させかねなくなります。さらに、実験で細胞の局在化を知ることは、視覚化する正しい焦点面を特定する上で重要なステップです。真皮線維芽細胞に焦点を当てることを選択したので、細胞の目的のタイプ(〜100-150 μm)を視覚化できるように、足に比較的短い距離を画像化するだけで済みます。他の実験では、組織の奥深くに細胞を画像化する実験を行うことは、ユーザーが設定すると不可能に難しいかもしれないので、顕微鏡と目的の能力を考慮することが重要です。 最後に、データ分析に取り組む方法を選択することは、実験の最後の手順で重要な考慮事項です。ここでは、TLR4を発現する線維芽細胞が、緑色(LPS)と赤色(線維芽細胞によって発現されるtdTomato)の堅牢な共局在によって明らかな蛍光タグ付きLPSを取り込み、結合できることを示している。このプロトコルでは定量的なイメージ分析は行いませんが、ユーザーがこのプロトコルから収集したデータを解釈する方法はさま々あります。1 つ目は、オープン ソース ソフトウェアを使用して、特定のピクセル28の 2 つの異なる色の強度を測定する単純な共ローカリゼーション分析です。これにより、ユーザーは、取得した画像またはビデオ内の特定のピクセルで 2 つの励起蛍煙素が検出されたかどうか、および特定の空間にどれだけの重なりがあるかを識別できます。これは、目的の細胞が注入された分子と何らかの容量に相互作用しているかどうかを識別するのに役立ちます。定量分析の別の方法は、蛍光強度29である。ユーザーは、対象のセル内の特定の信号の強度に関する情報を収集できます。これらの分析から収集されたデータは、細胞が他の分子と比較して様々な量の分子を取り込む方法を示している可能性があります。これらのデータ分析方法は、ユーザーがこのプロトコルで実行されたものと同様の実験から収集したデータを分析しようとする方法の例です。
私たちの遺伝子モデルは、Cre/loxP依存的な方法で選択的に蛍光タグ(tdTomato)FSP1+線維芽細胞を可能にし、皮膚の真皮の細胞を迅速かつ容易に視覚化することができます。これは、その固有の蛍光のために細胞を視覚化することが容易になりますが、ユーザーが表皮から真皮へのシフトを決定する経験があれば、遺伝的にタグ付けされた細胞なしで2光子イメージングを行うことが可能です。皮膚上の毛髪からの自己蛍光の堅牢なレベルを使用すると、ユーザーが焦点を合わせており、希望する焦点面を得るために移動する必要がある方向を見るのに役立ちます。これは明らかに皮膚に近い関心のある焦点面が機能し、目的の細胞が組織内の深い場合にのみ機能します。
実験全体を通して焦点面を追跡することは理想的です。しかし、生きた動物の呼吸により、Zスタックをタイムラプス実験に組み込むと、時間の経過とともにフレームシフトを防ぐことが困難になります。この問題をトラブルシューティングするために、共振スキャナを使用する場合はライン平均を下げ、サンプルレートを上げることで、イメージングの品質を低下させることを検討できます。前述のように、スキャナのサンプルレートが遅いためにZスタックとタイムラプスが組み込まれる実験では、従来のガルバノメータースキャナを使用することはほとんど不可能です。
画像取得の期間を変更すると、ユーザーは実験のニーズに合わせてより適切にすることができます。長期間動物をイメージングすると、ユーザーは分子エンドサイトーシスと代謝のすべてのステップを通じてデータを収集することができますが、プロセスの特定の部分のみを画像化する時間を短縮すると、効率が向上します。分子の付着を特定するために、より短い期間(〜1〜15分)、受容体リガンド子宮内サイトシス30を視覚化するためのより長い期間(〜15〜30分)、および細胞を視覚化するための全期間(〜30〜60分)を画像化することが可能です。分子の活性化と潜在的な代謝。しかし、これは注入された分子に大きく依存し、細胞を可視化した(図3)。
この原稿に記載されている実験プロトコルの重要な注意点は、現在、我々は、同一のサンプル領域を前および注射後に画像化することができないということです。これは、セットアップの性質と薬物送達の方法によるものです。しかし、我々は数時間の早期注射後の時間から細胞を追跡することができる。実験の過程を通じて個々の細胞を追跡することは重要ですが、細胞活性化の局所的なシフトも同様に重要であり、この方法を使用して捕捉することができます。マルチフォトン顕微鏡で2つ以上の蛍光素を同時に可視化することは、セットアップを考えると不可能であるため、この方法の限界は、ユーザーが他の画像装置とは対照的に2つの蛍光素しか画像化できないということです。またはそれ以上の蛍煙管は、同時に可視化することができる31.全体として、説明されたプロトコルは、私たちの研究室の目標に固有であり、実験的な可能性がプロトコルの制限を上回る細胞活性化を識別するのに有用なツールを提供します。
この原稿に記載されている方法は、細胞の活性化を可視化する既存の方法に対して多くの利点を提供する。ここで行われる実験は生体内にあり、細胞結合のリアルタイム可視化と、侮辱に関して特に活性化を直接示す分子の取り込みが可能です。これは、細胞の環境を維持できるため、過剰興奮性や異所性による結果の交絡の可能性を大幅に減少させるため、従来のライブセルイメージング技術などの他の方法よりも優れています。解離の外傷に関連する細胞の活動32.さらに、この実験設定でマルチフォトン顕微鏡を使用すると、蛍光漂白剤の光漂白剤の速度が低下し、ユーザーがこの方法を研究に適用する場合に重要な連続的かつ有意に長いイメージングセッションを可能にします。代謝または長期活性化の速度を調査する33.最後に、細胞型の細胞が組織内の深部に存在する場合(>100mm)、マルチフォトン顕微鏡を用いて最適なシグナルを得る必要がある34。全体的に、ユーザーの実験の目的が侮辱に応じて細胞のリアルタイムの取り込みと活性化を研究することである場合、トランスジェニックレポーターラインと組み合わせた2光子顕微鏡を使用することは、他の従来の想像技術よりも適しています。
この技術により、ユーザーは、活性化、運動性、および細胞間相互作用に関して、多種多様な細胞タイプに関する縦方向の研究を行うことができる。この技術の利点は、ユーザーが自分の遺伝的にタグ付けされた報告された動物を使用し、彼らの研究の利益に合わせて蛍光タグ付き分子を置き換えることを可能にすることです(例えば、上皮細胞のTie2cre)。このプロトコルは、我々の実験で示されている特定のセットアップに限定されず、彼らの研究で遺伝的レポーターラインと2光子真皮イメージングを利用する任意のラボのニーズに合わせて高度に変更することができます。このアプローチを使用して、末梢外傷後の傷害部位への免疫細胞の活性化と募集を特定し、活性化と募集の具体的な時間経過を決定し、最良のアプローチが何であるかをより深く理解できるようにする予定です。予防治療のための痛みの様々な形態に関して。
結論として、2光子顕微鏡を用いてTLR4を発現するtdTomatoタグ付き真皮線維芽細胞により、蛍光タグ付きLPSの画像取り込みを可能にする新しい技術を開発した。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
この作業は、許可 NS096030 (MDB) によってサポートされます。また、イメージングコアマネージャーVed Prakashに感謝したいと思います。また、UTダラスのオリンパス・ディスカバリー・センター/イメージング・コア施設の設備とサポートに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
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