Summary
As alterações morfológicas ocorrem em células de fibroblastos imunes responsivos após a ativação e promovem alterações no recrutamento celular. Utilizando a imagem latente do Photon 2 conjuntamente com uma proteína fibroblástica-específica geneticamente projetada 1 (FSP1)-CRE; tdtomato floxed-parar-floxed (TB/TB) linha do mouse e verde cDNAs Tagged lipopolissacarídeo-FITC, podemos ilustrar a captação altamente específica de lipopolissacaríno em fibroblastos dérmicos e alterações morfológicas in vivo.
Abstract
Os fibroblastos são células mesenquimais que alteram sua morfologia após a ativação, influenciando, em última análise, o microambiente do tecido em que estão localizados. Embora as técnicas tradicionais da imagem latente sejam úteis em identificar interações e morfologia da proteína no tecido fixo, não podem dar a introspecção a respeito de como rapidamente as pilhas podem ligar e proteínas da tomada, e uma vez que ativadas como sua morfologia muda no vivo. No presente estudo, pedimos 2 perguntas principais: 1) qual é o tempo-curso da ativação do fibroblasto através da interação Toll-like do receptor-4 (TLR4) e do lipopolissacarídeo (LPs) e 2) como essas células se comportam uma vez ativadas? Usando a imagem latente do 2-Photon, nós desenvolvemos uma técnica nova para avaliar a habilidade de LPs-FITC de ligar a seu receptor cognato, TLR4, expressado em fibroblastos periféricos na linha genética do rato do repórter; FSP1cre; TdtomateLOX-Stop-LOX in vivo. Esta abordagem única permite que os pesquisadores criem em profundidade, vídeos de lapso de tempo e/ou imagens de proteínas que interagem com células ao vivo que permite ter um nível aumentado de granularidade na compreensão de como as proteínas podem alterar o comportamento celular.
Introduction
Lipopolissacarídeo (LPS) é uma endotoxina encontrada na membrana externa de bactérias Gram-negativas1. LPS tem uma afinidade de ligação elevada para o complexo do receptor do Toll-like 4 (TLR4)/CD14/MD2. TLR4 é um receptor de reconhecimento de padrão comumente encontrado na membrana externa de uma ampla gama de células imunes, células mesenquimais, e um subconjunto de neurônios sensoriais3,4,5. A ativação de TLR4 expressa em pilhas imunes conduz aos sistemas do mensageiro do segundo do MyD88-dependente e o independente, terminando com o translocação do beta do Kappa do nuclear-fator (NFκB) ao núcleo da pilha. Isso faz com que a célula imune protootípica produza e libere citocinas pró-inflamatórias, como interleucina (IL)-1 β, IL-6 e TNF-α6. No entanto, como outros tipos de células respondem à estimulação TLR4 não é tão claro. Os fibroblastos têm sido implicados em uma ampla gama de patologias, como cânceres e fibrose cística, e têm sido mostrados recentemente para desempenhar um papel de quimio-atração de monócitos e promovendo a inflamação7,8,9. Nosso laboratório está interessado no papel dos fibroblastos no desenvolvimento da dor aguda e crônica, como evidências precoces sugerem que os fatores liberados pelos fibroblastos (metaloproteinases de matriz (MMPs), inibidor tecidual de metaloproteinases (TIMPs) e fibroblastos fatores de crescimento (FGFs)) estão envolvidos na dor neuropática10.
Os Estados de ativação das células podem ser determinados por uma variedade de fatores que incluem: indução de genes imediatos precoces, expressão protéica alterada, proliferação celular e alterações morfológicas11,12,13. Existem muitas técnicas que existem para responder a perguntas que podemos ter sobre como a ativação das células contribui para patologias, mas todos eles têm suas limitações. A imunohistoquímica prototípica usa anticorpos marcados cDNAs para rotular proteínas de interesse em tecido fixo, o que pode ser inespecífico e muitas vezes requer solução de problemas significativa antes de produzir resultados frutíferos14. A mancha ocidental é uma técnica útil ao comparar níveis de expressão da proteína no tecido post-mortem; Entretanto, o componente histológico está faltando nessa técnica e os pesquisadores não conseguem identificar alterações na morfologia15. O RNA-Seq nos permite quantificar a presença de RNA mensageiro em uma amostra que, em muitos casos, produz dados perspicazes; Entretanto, a lacuna entre transcrição e tradução dificulta a resolução temporal após um estímulo16. A imagem latente confocal é útil em determinar a expressão e a colocalização das proteínas que existem em uma seção transversal dos tecidos17. Muitas vezes, isso não é representativo da totalidade da amostra de tecido. Em contraste, microscópios multifótons permitem aos usuários imagem de aproximadamente 1 mm de profundidade em uma amostra, criando uma representação tridimensional abrangente18. Conseqüentemente, nós escolhemos centrar-se sobre in vivo, 2 Preps da imagem latente do fotão, porque os dados recolhidos destes experimentos são mais diretamente relacionable ao microambiente altamente plástico e interligado do tecido vivo.
Uma vantagem de estudar interações proteína-receptor in vivo é que podemos capturar claramente como as células respondem a um estímulo, em tempo real, em seu ambiente nativo sem a influência prejudicial e imprevisível da extração do tecido pós-morte19. Além disso, estudos longitudinais podem ser realizados para avaliar a plasticidade celular e a escorva que pode ocorrer por causa da ativação. Usando a imagem latente do 2-Photon, nós preservamos a integridade do microambiente atual quando um estímulo externo é aplicado. Este protocolo fornece uma maneira de identificar a captação das moléculas nos fibroblasto que seguem a injeção periférica de LPs cDNAs etiquetados sobre o curso de diversas horas in vivo e o papel de TLR4 na ativação do fibroblasto.
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Protocol
Os procedimentos animais foram aprovados pela Universidade do Texas no Comitê institucional de cuidados e uso de animais de Dallas e estavam de acordo com as diretrizes dos institutos nacionais de saúde. Todos os experimentos foram realizados com ratos machos e fêmeas 8-12-week-old criados em casa em um fundo C57BL/6. Camundongos transgênicos com CRE-recombinase impulsionados pelo promotor proteico-1 específico para fibroblastos foram adquiridos comercialmente (Jackson, 012641) (FSP1cre)+/- e cruzados com camundongos tdtomatoLOX-Stop-LOX , também adquiridos comercialmente ( Jackson, 007914) e (FSP1cre)+/- ; tdTomatoLOX-parar-LOX e FSP1cre-/-; camundongos tdTomatoLOX-Stop-LOX foram criados em casa em um fundo C57Bl/6 (Figura 1a, B, C). A proteína 1 específica de fibroblastos é uma proteína endógena expressa em aproximadamente 72% do fibroblasto e representa um excitador eficaz do CRE no tecido cutâneo20. Camundongos foram alojados em grupo e receberam acesso ad libitum a alimentos e água. A temperatura ambiente foi mantida a 21 ± 2 ° c. Quando nós usamos C57Bl/6 cruzou ratos masculinos e fêmeas em 8-12 semanas, nós não acreditamos que a idade, o sexo, ou o fundo genético são exigências necessárias executar experimentos do multifotônica. Os camundongos foram profundamente anestesiados imediatamente após o experimento e eutanasiado.
1. preparação de medicamentos
- Prepare uma solução de 5 μg/20 μL de lipopolissacarde-FITC (ver tabela de materiais) em 1X PBS estéril (pH 7,4). Vortex a solução de estoque em intensidade média por minimamente 30 segundos para garantir a mistura homogênea para uma concentração igual ao longo da solução antes de pipetagem (LPS é uma molécula glutinosa).
Nota: não coloque LPS em um recipiente de vidro, se possível, use tubos de microcentrífuga siliconizadas. Mantenha no gelo até o uso.
2. criação de imagens
- Configure o sistema multifóton (ver tabela de materiais) para imagens de duas cores. Isso requer o uso de dois lasers de excitação separados (ver tabela de materiais), um conjunto de cubos de filtro GFP/RFP (ver tabela de materiais) e um objetivo de imersão em água de 25x (1, 5 na) (ver tabela de materiais).
Nota: os usuários podem alterar essas configurações para melhor atender às configurações alternativas e capacidades de microscópio multifóton. Estes são os parâmetros utilizados no protocolo experimental. Consulte tabela de materiais para obter detalhes específicos. - Coloque um aparelho estereotódico (ver tabela de materiais) no estágio do microscópio multifóton. Conecte-o a uma máquina de entrega de anestesia (ver tabela de materiais) para garantir que os animais sejam anestesiados durante o experimento. Coloque um pedaço de papel preto fosco na superfície do aparelho como um ponto de conexão para a pata do mouse.
- Selecione o scanner ressonante com uma área de varredura fixa de 512 μm x 512 μm.
Nota: não realize os experimentos neste protocolo usando um scanner de galvanômetro. Devido à taxa de amostragem mais lenta, haverá distorção nos vídeos de lapso de tempo z-Stack devido à respiração do animal que é inevitável. - Sintonize os dois lasers da excitação aos comprimentos de onda da excitação de GFP e de RFP, de 930 nanômetro e de 1100 nanômetro respectivamente, e dirija o trajeto claro de ambos os lasers da excitação ao único objetivo usando um espelho dichroic de 690-1050 nanômetro permitindo o laser da excitação 930 nm-tuned para ser refletido ao varredor principal e ao laser 1.100 nm-ajustado para passar diretamente no varredor principal (Figura 2).
Nota: é possível alterar esses comprimentos de onda de excitação dependendo da configuração do usuário. - Ajuste o poder do laser de FITC a 5% e a GFP a 20%.
Nota: esta configuração fornece uma relação sinal-ruído (SNR) óptima nestes experimentos. Detecte o sinal através dos tubos do foto-multiplicador do multi-alcalóide (PMTs); Entretanto, os detectores de GaAsP podem ser usados preferivelmente em experiências muito High-Sensitivity. - Prepare o quarto para a imagem latente circunstâncias escuras sem luz disperso.
3. imagem latente in vivo
- Coloque o mouse na câmara de indução do sistema de entrega de anestesia e use 5% de isoflurano (ver tabela de materiais) a uma taxa de fluxo de oxigênio de 2 L/min para colocar o mouse anestesia profunda.
Nota: é altamente recomendável usar todos os EPI apropriados durante o experimento.- Transfira o mouse para o aparelho estereotódico com acesso a um cone de nariz para manter a anestesia durante todo o experimento. Reduza o isoflurano a 1.5%-2% e mantenha a constante da taxa de fluxo.
-
Fixe firmemente a pata traseira a uma parte de papel preto com fita preta em áreas proximal e longe do ponto de origem à área de interesse (isto reduz os efeitos da respiração do rato na qualidade de imagem), certificando-se que a superfície plantar da pata está desobstruída e enfrentando para o objetivo. Assegure-se de que a cabeça do rato esteja estável dentro do cone do nariz anexado ao aparelho.
Nota: monitore o mouse para quaisquer sinais de angústia ou desidratação durante todo o experimento e ajustar o isoflurano em conformidade.
- Coloque uma quantidade generosa de lubrificante à base de água estéril (gel, ver tabela de materiais) na superfície plantar da pata e toque o objetivo para ele, a fim de criar uma coluna de líquido entre a pata e o objetivo.
- Use a luz de excitação FITC para se concentrar na camada dérmica da pata. Assegure-se de que os fibroblastos tdTomato-etiquetados estejam visualizados antes de continuar (esta etapa é importante em determinar o plano focal correto à imagem).
Nota: a camada dérmica da pata é de cerca de 100-150 μm na pata. - Imagem a área das células localizadas logo abaixo da superfície plantar da pata traseira com os lasers 930 nm e 1100 nm-tuned e adquirir um lapso de tempo de 15 minutos de cerca de 5-10 z-fatias em aproximadamente 1 μm por fatia para estabelecer uma representação do ambiente antes de injeção com LPS-FITC.
- Realize uma injecção intraplantar de 5 μg/20 μL de LPS-FITC na pata traseira do rato utilizando uma seringa de vidro Hamilton de 25 μL (ver tabela de materiais) e agulha de 30g (ver tabela de materiais), tendo o cuidado de não perturbar a posição da pata.
- Imagem uma área de células localizada logo abaixo da superfície plantar da pata traseira com os lasers 930 nm e 1100 nm-tuned e adquirir um lapso de tempo de 60-120 minutos de cerca de 5-10 z-fatias em aproximadamente 1 μm por fatia para identificar a captação de LPS-FITC por células.
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Representative Results
Inicialmente, injetamos LPS-FITC na pata traseira de camundongos do tipo selvagem, a fim de visualizar a captação de LPS-FITC em todos os tipos de células presentes na camada dérmica da pata. Tendo observado uma infinidade de células na camada dérmica da captação da pata traseira fluorescently-Tagged LPS em um rato tipo selvagem (vídeo Figura 1, 2), tentamos especificamente direcionar os fibroblastos como eles são um foco primário em nossa pesquisa. Antes da imagem as patas dos animais injetados com LPS-FITC nós quisemos ser desobstruídos que não há nenhuma fluorescência inerente das pilhas na camada cutânea. Isso é para garantir que, após a injeção, as imagens que tomamos são verdadeiras interações de células com os LPS marcados com fluorescently e não quaisquer artefatos de imagem (vídeo Figura 3, 4). Após a injeção de LPS-FITC, somente FSP1+ fibroblastos expressando TLR4 ligam e captação da proteína injetada, com um alto nível de colocalização com a tag tdTomato expressa por essas células (vídeo Figura 5). Em contraste, camundongos que têm TLR4 nocauteado de todo o corpo (TLR4ko) não ligam e absorção LPs após a injeção. Como evidente no vídeo, silhuetas de células são visíveis após a injeção de LPS-FITC que indica que a droga está se dispersando no fluido intersticial ao redor das células, mas não está realmente sendo vinculado por um receptor (vídeo Figura 6).
Para resumir nossos resultados, mostramos, in vivo, que após a injeção de LPs-FITC, em um FSP1cre; tdTomatoLOX-parar-LOX Cell-specific animal reativado apenas fibroblastos interagem com e absorção LPs. Ao contrário, os nocautes do inteiro-corpo de TLR4 não ligam e a tomada LPs-FITC após a injeção.
Figura 1 . tdtomato é expressado somente em FSP1+ fibroblastos em uma maneira CRE-dependente. A) FSP1cre camundongos transgênicos criados em um fundo C57Bl/6 são cruzados com camundongos tdTomato criados em um fundo C57Bl/6 para gerar camundongos expressaram TDTOMATO em FSP1+ fibroblastos de forma CRE-dependente. B) resultados representativos da PCR representando camundongos FSP1cre positivos e negativos expressando tdTomato. C) pictograma representativo de fibroblastos dérmicos no espaço extracelular localizado na pata do rato. FSP1+ camundongos expressar uma proteína vermelha fluorescente apenas em fibroblastos enquanto FSP1- camundongos não. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Trajeto claro do microscópio da dois-cor 2-Photon. A representação do caminho de luz configurada para a experiência de 2 fótons 2-color configurada. Laser 1 é ajustado para 930 nm para excitar FITC-conjugated LPS e laser 2 é ajustado para 1100 nm para excitar tdTomato encontrado em fibroblastos. A luz da excitação do laser 1 é refletida pelo espelho dichroic (690-1050 nanômetro) quando a luz da excitação do laser 2 passar completamente ao varredor principal. A luz da excitação de ambos os lasers é refletida por um jogo dos espelhos a um segundo espelho dichroic (650 nanômetro) permitindo que a luz da excitação passe através do objetivo e no tecido para excitar os Fluorophores. A luz é emitida dos fluoróforos excitados e é capturada pelo objetivo 25x e refletida pelo espelho dichroic (650) aos tubos photomultiplicador do multi-alcalóide. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Fluxograma experimental de microscopia de 2 fótons. Os camundongos são anestesiados e imobilizado por meio de um sistema de anestesia de baixo fluxo e aparelho estereotaxico. A superfície plantar da pata enfrenta o objetivo e é imaged por 15 minutos. A injeção intraplantar de 5 μg/20 μL LPS-FITC é executada no rato anestesiado e a pata é imaged então por uma duração do tempo necessário para a meta do experimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo Figura 1. Z-Stack vídeos da captação de LPS-FITC nas pilhas no tipo selvagem C57BL/6 ratos. Z-pilha de vídeo da camada dérmica da pata Hind de um C57Bl/6 mouse antes de LPs-FITC injeção. O aspecto plantar de uma pata de rato selvagem do tipo foi imaged por 15 minutos antes da injeção com LPS-FITC para controlar para o autofluorescence produzido no canal de GFP. Há pouco a nenhum sinal no canal GFP indicando não autofluorescência. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Vídeo Figura 2. Z-pilha de vídeo da camada dérmica da pata Hind de um C57BL/6 mouse após a injeção LPS-FITC. O aspecto plantar de um tipo selvagem pata do rato foi imaged para 1,5 horas borne-LPs-FITC a injeção para visualizar a tomada de LPs-FITC por todas as pilhas que expressam TLR4. Como evidente no vídeo, uma multidão de células ligam e captação LPS-FITC durante todo o curso do experimento. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Vídeo Figura 3. Z-pilha de vídeo da camada dérmica da pata Hind de um FSP1cre; tdTomato mouse antes da injeção LPS-FITC. O aspecto plantar de um FSP1cre; a pata do rato de tdTomato foi imaged por 15 minutos antes da injeção com LPS-FITC para controlar para o autofluorescence produzido no canal de GFP. Há pouco a nenhum sinal no canal GFP indicando não autofluorescência. os fibroblastos tdTomato-positivos são visualizados. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Vídeo Figura 4. Z-pilha de vídeo da camada dérmica da pata traseira de um TLR4ko mouse antes LPs-FITC injeção. O aspecto plantar da pata do rato de TLR4ko foi imaged por 15 minutos antes da injeção com LPS-FITC para controlar para o autofluorescence produzido no canal de GFP. Há pouco a nenhum sinal no canal GFP indicando não autofluorescência. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Vídeo Figura 5. Z-pilha de vídeo da camada dérmica da pata Hind de um FSP1cre; tdTomato mouse após a injeção LPS-FITC. O aspecto plantar de um FSP1cre; a pata do rato de tdTomato foi imaged para a injeção do borne-LPS-FITC de 1,5 horas para visualizar a captação de LPS-FITC por fibroblastos tdTomato-positivos que expressam TLR4. Como evidente no vídeo, a captação altamente específica de LPS-FITC através de TLR4 expressado em fibroblastos tdTomato-positivos é vista. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Vídeo Figura 6. Z-pilha de vídeo da camada dérmica da pata Hind de um TLR4ko mouse após a injeção LPs-FITC. O aspecto plantar de uma pata do rato de TLR4ko foi imaged para 1,5 horas borne-LPs-FITC a injeção para visualizar se a tomada de LPs-FITC por pilhas em um knockout do todo-corpo de TLR4 é possível. Como evidente no vídeo, nenhuma captação de LPS-FITC é vista pela célula na camada dérmica da pata traseira. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
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Discussion
Indiscutivelmente os passos mais importantes da in vivo 2-Photon Imaging são: 1) escolhendo o rato genético direito do repórter e a proteína fluorescently-etiquetada para a instalação e as necessidades experimentais do multi-Photon21,22; 2) imagem do plano focal correto para ter uma representação exata da população de células no tecido23; 3) minimizando o movimento devido a um animal imobilizado indevidamente24; e 4) escolhendo quando analisar dados qualitativamente vs. quantitativamente25,26,27. Garantir a abordar esses pontos antes de iniciar um experimento fornecerá o conhecimento para coletar dados que sejam reprodutíveis e cientificamente rigorosos.
Uma consideração importante no protocolo é imobilizar corretamente a região a ser imaged. A respiração do animal provoca turnos de minutos no plano focal durante a imagem e ao executar o vídeo z-Stack e Time-Lapse, isso provoca uma distorção significativa no vídeo e pode impactar negativamente a qualidade dos dados produzidos. Assegurar-se de que a pata esteja imobilizada corretamente permitirá a imagem latente bem sucedida da pata sem rompimento da respiração. Além disso, conhecer a localização das células no experimento é um passo crítico na identificação do plano focal correto para visualizar. Porque nós escolhemos centrar-se sobre fibroblasto dérmicos, nós precisamos somente de imagem uma distância relativamente curta na pata para poder visualizar nossos tipos da pilha de interesse (~ 100-150 μm). Em outros experimentos, é importante considerar as capacidades do microscópio e um objetivo usa porque a realização de um experimento para células de imagem profundamente dentro do tecido pode ser desafiador para impossível, dado os usuários configurados. Finalmente, a escolha de como abordar a análise dos dados é uma consideração importante nas etapas finais do experimento. Aqui, nós estamos mostrando que os fibroblastos expressando TLR4 são capazes de absorção e ligação fluorescently-Tagged LPS que é evidente pela colocalização robusta de verde (LPS) e vermelho (tdTomato expressa por fibroblastos) nos vídeos. Embora nenhuma análise quantitativa da imagem seja feita neste protocolo, há uma variedade de maneiras que um usuário poderia interpretar os dados recolhidos deste protocolo. O primeiro sendo uma análise de colocalização simples usando software de código aberto para medir a intensidade de duas cores distintas em um determinado pixel28. Isto permite que o usuário identifique se dois fluoróforos excitados são detectados em um pixel dado em uma imagem ou em um vídeo adquirido e quanto desta sobreposição lá está em um espaço dado. Isso é útil para identificar se as células de interesse estão interagindo com alguma capacidade com a molécula injetada. Um método alternativo de análise quantitativa é a intensidade de fluorescência29. O usuário é capaz de reunir informações sobre a intensidade de um determinado sinal dentro de uma célula de interesse. Os dados recolhidos a partir dessas análises podem indicar como as células podem captação de várias quantidades de uma molécula em comparação com outros. Esses métodos de análise de dados são um exemplo de como o usuário pode procurar analisar os dados coletados de um experimento semelhante ao realizado neste protocolo.
Nossos modelos genéticos nos permitem seletivamente cDNAs Tag (tdtomato) FSP1+ fibroblastos em uma forma CRE/loxp-dependente, que permite a visualização rápida e fácil de células na derme da pele. Embora isto faça a visualização de pilhas fácil por causa de sua fluorescência inerente, é possível conduzir a imagem latente de 2 fótons sem pilhas genetically etiquetadas se o usuário é experimentado em determinar o deslocamento da epiderme à derma. Usando os níveis robustos de autofluorescência do cabelo na pele pode ser um indicador útil de onde o usuário está se concentrando e a direção que um precisa para se mover para obter o plano focal desejado. Isto obviamente só funcionará se o plano focal de interesse em perto da pele e não a célula de interesse é profunda dentro do tecido.
Rastrear um plano focal durante todo o experimento é ideal; no entanto, devido à respiração de um animal vivo, torna-se difícil evitar mudanças de quadro ao longo do tempo ao incorporar z-Stacks em uma experiência de lapso de tempo. A fim pesquisar defeitos esta edição, o usuário pode considerar reduzir a qualidade da imagem latente diminuindo a linha-média ao usar um varredor ressonante e a aumentar a taxa da amostra. Como mencionado anteriormente, é quase impossível usar um scanner de galvanômetro tradicional em um experimento em que uma pilha z e um lapso de tempo são incorporados devido à taxa de amostragem mais lenta do scanner.
Alterar a duração da aquisição de imagem pode permitir que o usuário melhor se adequar às necessidades de seu experimento. Quando a imagem latente o animal por períodos de tempo prolongados permitir que o usuário Reúna dados durante todo todas as etapas da endocitose e do metabolismo da molécula, encurtando o tempo à imagem somente as partes específicas do processo aumentarão a eficiência. É possível a imagem por um período de tempo mais curto (~ 1-15 minutos) para identificar o acessório da molécula, um período de tempo mais longo (~ 15-30 minutos) para visualizar a endocitose do receptor-ligand30, e a duração cheia (~ 30-60 minutos) para visualizar o celular ativação e potencial metabolismo da molécula. Isso é altamente dependente no entanto na molécula injetada e as células foram visualizadas (Figura 3).
Uma nota importante no protocolo experimental descrito neste manuscrito é que, atualmente, não podemos fazer a imagem de áreas de amostra idênticas pré e pós-injeção. Isto é devido à natureza da instalação e do método da entrega da droga. No entanto, somos capazes de rastrear as células de um tempo pós-injeção precoce por várias horas. Embora seja importante manter o controle de células individuais durante o curso do experimento, mudanças regionais na ativação celular são igualmente importantes e podem ser capturadas usando esse método. Visualizando mais de dois fluoróforos em um microscópio multifóton simultaneamente no momento é impossível, dada a configuração, portanto, uma limitação deste método é que os usuários só são capazes de imagem dois fluoróforos em oposição a outros equipamentos de imagens onde 4 ou mais fluoróforos podem ser visualizados simultaneamente31. Globalmente, o protocolo descrito é específico para os objetivos do nosso laboratório e fornece uma ferramenta útil para identificar a ativação celular, onde as possibilidades experimentais superam as limitações do protocolo.
Os métodos descritos neste manuscrito fornecem uma série de benefícios sobre os métodos existentes para visualizar a ativação das células. O primeiro é que os experimentos realizados aqui são in vivo, permitindo a visualização em tempo real de células vinculantes e até tomar moléculas que é diretamente indicativa de ativação especificamente em relação a um insulto. Isto fornece vantagens sobre outros métodos tais como técnicas tradicionais da imagem latente da vivo-pilha porque nós podemos preservar o ambiente das pilhas que diminui significativamente a probabilidade de resultados confundidores devido ao hiperexcitabilidade e ectópica atividade das células relacionadas ao trauma da dissociação32. Além, o uso de um microscópio do multifotônica neste ajuste experimental diminui a taxa em que fluoróforos Photo-Bleach permitindo sessões contínuas e significativamente mais longas da imagem latente que é importante se o usuário aplica este método aos estudos investigando a taxa de metabolismo ou ativação de longo prazo33. Finalmente, se os tipos de células de interesse residem profundamente dentro do tecido (> 100 mm) usando um microscópio multifóton é necessário obter o sinal ideal34. Globalmente, se o objetivo do experimento de um usuário é estudar a captação em tempo real e ativação de células em resposta a um insulto, em seguida, usando microscopia de dois fótons acoplado com linhas de repórter transgênica é mais adequado sobre outras técnicas de imaginação convencionais.
Esta técnica permite que os usuários realizem estudos longitudinais em uma grande variedade de tipos da pilha no que diz respeito à ativação, à motilidade, e às interações Cell-to-Cell. A vantagem desta técnica é que permite que os usuários usem seus próprios animais relatados genetically-etiquetados e substituam a molécula fluorescently-etiquetada para serir seus interesses da pesquisa (por exemplo, Tie2cre para pilhas epithelial). Este protocolo não é restrito à configuração específica mostrada em nossos experimentos e pode ser altamente modificada para atender às necessidades de qualquer laboratório utilizando linhas de repórter genético e imagem dérmica de 2 fótons em seus estudos. Pretendemos usar esta abordagem para identificar a ativação e recrutamento de células imunes para o local de lesão após trauma periférico e determinar o que o curso de tempo específico de ativação e recrutamento é para que possamos entender melhor qual é a melhor abordagem para terapêutica preventiva é em relação a várias formas de dor.
Em conclusão, nós desenvolvemos uma técnica nova que permita usuários à captação da imagem de LPS fluorescently-etiquetados por tdTomato-etiquetou os fibroblastos dérmicos que expressam TLR4 usando a microscopia do 2-Photon.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho é suportado pela concessão NS096030 (MDB). Nós também gostaríamos de agradecer ao gerente de imagem central ved Prakash. Nós também gostaríamos de agradecer Olympus Discovery Center/Imaging Core facilidade em UT Dallas para fornecer equipamentos e suporte
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
References
- Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
- Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), New Rochelle. 356-369 (2017).
- Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
- Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
- Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).
- Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
- Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
- Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
- Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
- Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, Suppl 1 85-91 (2004).
- Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
- Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
- Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
- Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
- Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
- Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184 (2015).
- Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).
