Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

В Vivo Двухцветные 2-фотон-изображения генетически-tagged репортер ателье клетки в коже

Published: July 11, 2019 doi: 10.3791/59647
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Brain and Behavioral Science, Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas

Summary

Морфологические изменения происходят в иммунных чувствительных фибробластных клетках после активации и способствуют изменениям в клеточной вербовке. Использование 2-фотонной визуализации в сочетании с генетически модифицированным фибробластным белком 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) линия мыши и зеленый флуоресцентно помеченный липополисахарид-FITC, мы можем проиллюстрировать весьма специфическое поглощение липополисахарида в дермальных фибробластах и морфологических изменениях in vivo.

Abstract

Фибробласты являются мезенхимальными клетками, которые меняют свою морфологию после активации, в конечном счете, влияя на микросреду тканей, в которых они находятся. Хотя традиционные методы визуализации полезны для определения белковых взаимодействий и морфологии в фиксированной ткани, они не в состоянии дать представление о том, как быстро клетки способны связывать и усваивают белки, и как только активируется, как их морфология меняется в Vivo. В настоящем исследовании мы задаем 2 основных вопроса: 1) каков временной курс активации фибробластов через платные рецепторы-4 (TLR4) и липополисахарид (LPS) взаимодействие и 2) как эти клетки ведут себя после активации? Используя 2-фотонные изображения, мы разработали новую технику для оценки способности LPS-FITC связываться с его cognate рецептором, TLR4, выраженным на периферических фибробластах в генетической линии мыши репортера; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox in vivo. Этот уникальный подход позволяет исследователям создавать углубленные, замедленного видео и / или фотографии белков, взаимодействующих с живыми клетками, что позволяет иметь повышенный уровень детализации в понимании того, как белки могут изменить клеточное поведение.

Introduction

Липополисахарид (LPS) является эндотоксин, найденный во внешней мембране грамотрицательных бактерий1. LPS имеет высокое связывающее сродство к платному рецептору 4 (TLR4)/CD14/MD2 рецепторного комплекса2. TLR4 является рецептором распознавания образов обычно встречаются на внешней мембране широкого спектра иммунных клеток, мезенхимальных клеток, и подмножество сенсорных нейронов3,4,5. Активация TLR4, выраженная на иммунных клетках, приводит к тому, что MyD88-зависимые и независимые системы второго мессенджера заканчиваются транслокацией в ядро клетки с ядерным фактором каппа (НФЗБ). Это приводит к тому, что у проститутки иммунной клетки производят и высвобождают провоспалительные цитокины, такие как Интерлейкин (IL)-1, IL-6 и TNF-No6. Однако, как другие типы клеток реагируют на стимуляцию TLR4 не так ясно. Фибробласты были вовлечены в широкий спектр патологий, таких как рак и муковисцидоз и недавно было показано, что играют роль моноцита химио-притяжения и содействия воспаление7,8,9.  Наша лаборатория заинтересована в роли фибробластов в развитии острой и хронической боли, так как ранние данные свидетельствуют о том, что факторы, выделяемые фибробластами (матричные металлопротеиназы (ММП), ингибитор тканей металлопротеиназа (ТИМП) и фибробласт факторы роста (FGFs)) участвуют в невропатической боли10.

Состояния активации клеток могут быть определены по целому ряду факторов, которые включают: индукцию немедленно ранних генов, измененное выражение белка, пролиферацию клеток и морфологические изменения11,12,13. Есть много методов, которые существуют, чтобы ответить на вопросы, которые мы можем иметь о том, как активация клеток способствует патологии, но все они имеют свои ограничения. Прототипная иммуногистохимия использует флуоресцентно помеченные антитела для обозначения белков, представляющих интерес в фиксированной ткани, которые могут быть неспецифическими и часто требуют значительных устранения неполадок, прежде чем дать плодотворные результаты14. Западная промотирование является полезным методом при сравнении уровней экспрессии белка в посмертной ткани; однако, гистологический компонент не хватает в этой технике и исследователи не в состоянии определить какие-либо изменения в морфологии15. RNA-Seq позволяет нам количественно определить наличие РНК-мессенджера в выборке, которая во многих случаях дает проницательные данные; однако, разрыв между транскрипцией и переводом делает его трудным иметь временное разрешение после стимула16. Конфокальная визуализация полезна для определения экспрессии и совместной локализации белков, которые существуют в поперечном сечении тканей17. Часто это не является репрезентативным для всей ткани образца. В отличие от этого, мультифотонные микроскопы позволяют пользователям изображения примерно 1 мм вглубь образца, создавая всеобъемлющее трехмерное представление18. Таким образом, мы решили сосредоточиться на in vivo, 2-фотонных визуализации preps, так как данные, собранные из этих экспериментов, более непосредственно relatable к высоко пластичной и взаимосвязанной микросреде живой ткани.

Преимущество изучения белково-рецепторных взаимодействий in vivo заключается в том, что мы можем четко запечатлеть, как клетки реагируют на стимул в реальном времени, в их родной среде без вредного и непредсказуемого влияния вскрытия тканей19. Кроме того, продольные исследования могут быть выполнены для оценки клеточной пластичности и грунтовки, которые могут возникнуть из-за активации.  Используя 2-фотон-изображение, мы сохраняем целостность микроокружения, присутствующего при применении внешнего стимула. Этот протокол обеспечивает способ определить поглощение молекул в фибробластах после периферической инъекции флуоресцентно помеченных LPS в течение нескольких часов in vivo и роль TLR4 в активации фибробластов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Процедуры для животных были одобрены Техасским университетом в Далласе Институциональный комитет по уходу за животными и использования и были в соответствии с Национальными институтами здравоохранения руководящих принципов.  Все эксперименты проводились с использованием 8-12-недельных мышей мужского и женского пола, выведенных в доме на фоне C57BL/6. Трансгенные мыши с крем-рекомбиназой,управляемый фибробластом-специфическим протеином-1, были приобретены на коммерческой основе (Jackson, 012641) (FSP1cre) и скрещены с tdTomato lox-stop-lox мышей, также приобретенных на коммерческой основе ( Джексон, 007914) и (FSP1cre) tdTomatolox-stop-lox и FSP1cre-/-; tdTomatolox-stop-lox мышей были выведены в доме на c57BL/6 фон(Рисунок 1A,B, C). Фибробласт-специфический белок 1 является эндогенным белком, выраженным примерно на 72% фибробласта и представляет собой эффективный драйвер кре в дермальной ткани20. Мышей групповывали и давали ад-либитум доступ к пище и воде. Температура в помещении была сохранена на уровне 21 и 2 градусов по Цельсию. В то время как мы использовали C57BL/6 скрещенных мышей мужского и женского пола на 8-12 недель, мы не считаем, что возраст, пол или генетический фон являются необходимыми требованиями для запуска многофотоновых экспериментов. Мышей глубоко обезболели сразу после эксперимента и усыпили.

1. Подготовка препаратов

  1. Подготовьте раствор липополисахарида-FITC (см. таблицуматериалов) в стерильных 1x PBS (pH 7.4) см. Vortex запас решение со средней интенсивностью в течение минимально 30 секунд, чтобы обеспечить однородное смешивание для равной концентрации во всем растворе до пипеттинг (LPS является клейкой молекулы).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не помещайте LPS в стеклянный контейнер, если это возможно, используйте силиконовые микроцентрифуги трубки. Держите на льду до использования.

2. Настройка изображений

  1. Настройка многофотонной системы (см. Таблицаматериалов) для двухцветной визуализации. Это требует использования двух отдельных возбуждательных лазеров (см. ТаблицаМатериалов), набора кубиков фильтра GFP/RFP (см. таблицу материалов) и 25x (1,05 NA) цели погружения воды (см. ТаблицаМатериалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи могут изменить эти настройки, чтобы лучше соответствовать альтернативным установкам и возможностям мультифотонного микроскопа. Таковы параметры, используемые в экспериментальном протоколе. Для получения более подробной информации можно ознакомиться с таблицей материалов.
  2. Поместите стереотаксический аппарат (см. ТаблицуМатериалов) на сцене мультифотонического микроскопа. Подключите это к аппарату доставки анестезии (см. Таблицаматериалов), чтобы обеспечить животных под наркозом в течение всего эксперимента. Поместите кусок матовой черной бумаги на поверхность аппарата в качестве точки соединения для мышиной лапы.
  3. Выберите резонансный сканер с фиксированной областью сканирования 512 мкм х 512 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не выполняйте эксперименты в этом протоколе с помощью сканера гальванометра. Из-за более медленной частоты выборки, будет искажение в z-стек замедленного видео из-за дыхания животного, что является неизбежным.
  4. Настройте два возбуждающих лазера на волне возбуждения GFP и RFP, 930 нм и 1100 нм соответственно, и направьте световой путь обоих возбуждающих лазеров к одной цели с помощью дихромного зеркала 690-1,050 нм, позволяющего 930 нм-настроенный excitation лазер для отражения в основной сканер и 1100 нм настроенных лазеров, чтобы пройти непосредственно в основной сканер (Рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно изменить эти длины волн возбуждения в зависимости от установки пользователя.
  5. Установите лазерную мощность FITC до 5% и GFP до 20%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта установка обеспечивает оптимальное соотношение сигнала к шуму (SNR) в этих экспериментах. Обнаружение сигнала с помощью многощелочных фотомультипликаторных трубок (ПМТ); однако детекторы GaAsP могут использоваться в экспериментах с высокой чувствительностью.
  6. Подготовьте помещение для визуализации в темных условиях без рассеянного света.

3. In vivo изображений

  1. Поместите мышь в индукционную камеру системы доставки анестезии и используйте 5% изофлуран (см. Таблица Материалов) при скорости потока 2 л/мин кислорода, чтобы поместить мышь под глубокую анестезию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется носить все соответствующие СИЗ во время эксперимента.
    1. Передача мыши в стереотаксический аппарат с доступом к носовому конусу для поддержания анестезии на протяжении всего эксперимента. Уменьшите изофлуран до 1,5%-2% и сохраните скорость потока постоянной.
    2. Твердо прикрепите заднюю лапу к листу черной бумаги с черной лентой на участках, как проксимальных, так и дистальных в области интереса (это уменьшает влияние дыхания мыши на качество изображения), убедившись, что подошвенная поверхность лапы беспрепятственно и облицовка к цели. Убедитесь, что головка мыши стабильна в носовой конус, прикрепленный к аппарату.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг мыши для любых признаков бедствия или обезвоживания на протяжении всего эксперимента и настроить изолюран соответственно.
  2. Поместите щедрое количество стерильной смазки на водной основе (гель, см. Таблицаматериалов) на подошвенной поверхности лапы и прикоснитесь к цели к ней, чтобы создать столб жидкости между лапой и целью.
  3. Используйте свет возбуждения FITC, чтобы сосредоточиться на кожном слое лапы. Убедитесь, что tdTomato-tagged фибробласты визуализировать перед продолжением (этот шаг имеет важное значение в определении правильной фокусной плоскости для изображения).
    ПРИМЕЧАНИЕ: кожный слой лапы составляет около 100-150 мкм в лапу.
  4. Изображение области клеток, расположенных чуть ниже подошвенной поверхности задней лапы с 930 нм и 1100 нм настроенных лазеров и приобрести 15-минутный промежуток времени около 5-10 z-ломтиков примерно 1 мкм на ломтик, чтобы установить представление окружающей среды до инъекция с LPS-FITC.
  5. Выполните внутриплантарную инъекцию 5 мкг/20 ЛПС-ФИТК на заднюю лапу мыши, используя 25 л стекающих шприцев Гамильтона (см. Таблицу Материалов) и 30G иглу (см. ТаблицаМатериалов), заботясь, чтобы не нарушать положение лапы.
  6. Изображение области клеток, расположенных чуть ниже подошвенной поверхности задней лапы с 930 нм и 1100 нм настроенных лазеров и приобрести 60-120 минут промежуток времени около 5-10 z-ломтиков примерно 1 мкм на ломтик, чтобы определить поглощение LPS-FITC клетками.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Первоначально мы вводили LPS-FITC в заднюю лапу мышей дикого типа, чтобы визуализировать поглощение LPS-FITC во всех типах клеток, присутствующих в дермальном слое лапы. После наблюдения множество клеток в кожном слое задней лапы поглощения флуоресцентно помечены LPS в дикий тип мыши (Видео Рисунок 1, 2), мы попытались конкретно целевой фибробластов, поскольку они являются основным направлением в наших исследованиях. Перед визуализацией лапживотных животных, вводимых LPS-FITC, мы хотели пояснить, что в кожном слое нет присущей флуоресценции клеток. Это необходимо для того, чтобы после инъекции, изображения, которые мы принимаем истинные взаимодействия клеток с флуоресцентно помечены LPS, а не любые артефакты изображения (Видео Рисунок 3, 4). После инъекции LPS-FITC, только FSP1и фибробласты, выражающие TLR4 связывать и поглощения вводили белок, с высоким уровнем совместной локализации с тегом tdTomato, выраженным этими клетками (ВидеоРисунок 5). В отличие от мыши, которые TLR4 выбил из всего тела (TLR4KO) не связывают и поглощения LPS после инъекции. Как видно на видео, силуэты клеток видны после инъекции LPS-FITC, которая указывает на то, что препарат рассеивается в интерстициальной жидкости вокруг клеток, но на самом деле не связан рецептором (Видео Рисунок 6).

Подводя итоги, мы покажем, in vivo, что после инъекции LPS-FITC, в FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox клеток конкретных активированных животных только фибробласты взаимодействуют с и поглощения LPS. В отличие от этого, нокауты всего тела TLR4 не связывают и поглощения LPS-FITC после инъекции.

Figure 1
Рисунок 1 . tdTomato выражается только в FSP1и Фибробласты в Cre-зависимых Маннер. A) FSP1cre трансгенных мышей, выведенных на фоне C57BL/6 пересекаются с tdTomato мышей, выведенных на C57BL/6 фон для создания мышей, выраженных tdTomato в FSP1и фибробласт в cre-зависимых моды. B) Представитель PCR результаты, изображающие как положительные, так и отрицательные мыши FSP1cre, выражающие tdTomato. C) Представительная пиктограмма кожных фибробластов во внеклеточном пространстве, расположенном в мышиной лапе. FSP1- мыши выражают красный флуоресцентный белок только в фибробластах, в то время как FSP1- мыши нет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 . Световой путь двухцветного 2-фотон-микроскопа. Изображение световой дорожки, созданной для 2-цветного 2-фотона эксперимента. Лазер 1 настроен до 930 нм, чтобы возбудить FITC-конъюгированный LPS и Лазер 2 настроен до 1100 нм, чтобы возбудить tdTomato, найденный в фибробластах. Возбуждаемый свет от лазера 1 отражается дихроарным зеркалом (690-1050 нм), в то время как возбуждательный свет от лазера 2 проходит через главный сканер. Возбуждение света от обоих лазеров отражается набором зеркал на второе дихроическое зеркало (650 нм), позволяя возбуждая свет проходить через цель и в ткани, чтобы возбудить флюорофоры. Свет излучается из возбужденных флюорофоров и захватывается 25-кратной целью и отражается дихроарным зеркалом (650) в многощелочные фотомультипликаторные трубки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 . Экспериментальная диаграмма потока 2-фотонной микроскопии. Мыши обезвражаются и обездвижены с помощью низкоточной анестезии системы и стереотаксического аппарата. Подошвеет поверхности лапы сталкивается с целью и изображением в течение 15 минут. Интраплантарная инъекция в размере 5 мкг/20 ЛЛ LPS-FITC выполняется на обезглавленной мыши, и лапа затем скачывается в течение периода времени, необходимого для цели эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Video Figure 1
Видео Рисунок 1. Стек Видео LPS-FITC поглощения в клетках в диком типе C57BL/6 мышей. Видео дермального слоя задней лапы мыши C57BL/6 перед инъекцией LPS-FITC. Подошвенный аспект мышиной лапы дикого типа был изображен в течение 15 минут до инъекции с LPS-FITC для контроля для автофлюоресценции, производимой в канале GFP. Существует практически нет сигнала в канале GFP, указывающих нет автофлюоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Video Figure 2
Видео Рисунок 2. Видео дермального слоя задней лапы мыши C57BL/6 после инъекции LPS-FITC. Подошвенный аспект мышиной лапы дикого типа был изображен в течение 1,5 часов после lpS-FITC инъекции для визуализации поглощения LPS-FITC всеми клетками, выражающими TLR4. Как видно из видео, множество клеток связывают и поглощение LPS-FITC на протяжении всего эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Video Figure 3
Видео Рисунок 3. Видео дермального слоя задней лапы FSP1cre; tdTomato мышь перед инъекцией LPS-FITC. Подошвенный аспект FSP1cre; tdTomato мышь лапа была изображена в течение 15 минут до инъекции с LPS-FITC для контроля для автофлюоресценции производится в канале GFP. Существует практически нет сигнала в канале GFP, указывающих нет автофлюоресценции. tdТо-положительные фибробласты визуализированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Video Figure 4
Видео Рисунок 4. Видео дермального слоя задней лапы мыши TLR4KO перед инъекцией LPS-FITC. Подошвенный аспект мышиной лапы TLR4KO был изображен в течение 15 минут до инъекции с LPS-FITC для контроля для автофлюоресценции, производимой в канале GFP. Существует практически нет сигнала в канале GFP, указывающих нет автофлюоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Video Figure 5
Видео Рисунок 5. Видео дермального слоя задней лапы FSP1cre; tdTomato мышь после инъекции LPS-FITC.  Подошвенный аспект FSP1cre; tdTomato мышь лапа была изображена в течение 1,5 часов после LPS-FITC инъекции визуализировать поглощение LPS-FITC tdTomato-положительных фибробластов, выражающих TLR4. Как видно из видео, весьма специфическое поглощение LPS-FITC через TLR4, выраженное на tdTomato-положительных фибробластах, видно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Video Figure 6
Видео Рисунок 6. Видео дермального слоя задней лапы мыши TLR4KO после инъекции LPS-FITC.  Подошвенный аспект мышиной лапы TLR4KO был изображен в течение 1,5 часов после LPS-FITC инъекции, чтобы визуализировать, если поглощение LPS-FITC клетками в нокаут еле всего тела TLR4 возможно. Как видно на видео, не поглощение LPS-FITC не видно клетки в кожном слое задней лапы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Возможно, наиболее важные шаги in vivo 2-фотонной визуализации являются: 1) Выбор правильного генетического репортера мыши и флуоресцентно помечены белка для мульти-фотонной установки и экспериментальных потребностей21,22; 2) визуализация правильной фокусной плоскости, чтобы иметь точное представление населения клеток в ткани23; 3) минимизация движения из-за неправильно обездвиженого животного24; и 4) выбор, когда качественно анализировать данные против количественно25,26,27. Обеспечение решения этих вопросов до начала эксперимента даст знания для сбора данных, которые являются одновременно воспроизводимыми и научно строгими.

Важным соображением в протоколе является правильное обездвиживание региона для изображения. Дыхание от животного вызывает мельчайшие сдвиги в фокусной плоскости во время визуализации и при выполнении z-стек и замедленного видео, это вызывает значительные искажения в видео и может негативно повлиять на качество данных. Обеспечение правильной обездвиженной лапы позволит успешно сделать изображение лапы без нарушения дыхания. Кроме того, знание локализации клеток в эксперименте является важным шагом в определении правильной фокусной плоскости для визуализации. Поскольку мы решили сосредоточиться на кожных фибробластах, нам нужно только изображение относительно короткого расстояния в лапу, чтобы иметь возможность визуализировать наши типы клеток интереса (100-150 мкм). В других экспериментах, важно рассмотреть возможности микроскопа и объективного один использует, потому что выполнение эксперимента для изображения клеток глубоко в ткани может быть сложной задачей невозможно, учитывая пользователей созданы.  Наконец, выбор подхода к анализу данных является важным фактором на заключительных этапах эксперимента. Здесь мы показываем, что фибробласты, выражающие TLR4, способны поглощение и связывать флуоресцентно помеченный LPS, что очевидно надежной совместной локализацией зеленого (LPS) и красного (tdTomato, выраженных фибробластами) в видео. Хотя количественный анализ изображений в этом протоколе не проводится, пользователь может интерпретировать данные, собранные в этом протоколе, различными способами. Первый из них - простой анализ совместной локализации с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом для измерения интенсивности двух различных цветов в данном пикселе28. Это позволяет пользователю определить, если два возбужденных флюорофоров обнаружены на данном пикселе в приобретенном изображении или видео, и сколько этого перекрытия есть в данном пространстве. Это полезно в определении, если клетки, представляющие интерес взаимодействуют с некоторой емкостью с впрыснутой молекулы. Альтернативным методом количественного анализа является интенсивность флуоресценции29. Пользователь может собирать информацию об интенсивности заданного сигнала в ячейке интереса. Данные, собранные в результате этих анализов, могут свидетельствовать о том, как клетки могут унижать различные количества молекулы по сравнению с другими. Эти методы анализа данных являются примером того, как пользователь может попытаться проанализировать данные, собранные в ходе эксперимента, аналогичные тем, которые выполняются в этом протоколе.

Наши генетические модели позволяют нам выборочно флуоресцентно тег (tdTomato) FSP1и фибробластов в cre /loxP-зависимым образом, что позволяет быстро и легко визуализации клеток в дерме кожи. Хотя это делает визуализацию клеток легко из-за их присущей флуоресценции, можно проводить 2-фотонной визуализации без генетически помеченных клеток, если пользователь имеет опыт в определении перехода от эпидермиса к дерме. Использование надежных уровней автофлюоресценции от волос на коже может быть полезным показателем того, где пользователь фокусируется и направление нужно двигаться, чтобы получить желаемый фокусный план. Это, очевидно, будет работать только в том случае, если координационный план интереса в непосредственной близости от кожи и не будет клетки интереса глубоко в ткани.

Отслеживание фокусной плоскости на протяжении всего эксперимента является идеальным; однако, из-за дыхания живого животного, это затрудняет предотвращение сдвига кадров с течением времени при включении z-стеков в эксперимент замедленного правления. Для устранения неполадок пользователь может рассмотреть вопрос о снижении качества изображения за счет уменьшения усреднения линии при использовании резонансного сканера и увеличения частоты выборки. Как упоминалось ранее, практически невозможно использовать традиционный сканер гальванометра в эксперименте, где z-стек и промежуток времени включены из-за более медленной скорости выборки сканера.

Изменение продолжительности приобретения изображения может позволить пользователю лучше соответствовать потребностям своего эксперимента. В то время как визуализация животного в течение длительных периодов времени позволяет пользователю собирать данные на протяжении всех этапов молекулного эндоцитоза и метаболизма, сокращение времени на изображение только конкретных частей процесса повысит эффективность. Можно изображение в течение более короткого периода времени (1-15 минут), чтобы определить вложение молекулы, более длительный период времени (15-30 минут) для визуализации рецептор-лиганд эндоцитоз30, и полная продолжительность (30-60 минут) для визуализации клеточного активации и потенциального метаболизма молекулы. Это высоки зависит однако на молекуле впрыснутой и клетки были визуализированы(Рисунок3).

Важное замечание в экспериментальном протоколе, описанном в этой рукописи, состоит в том, что в настоящее время мы не можем отобразить идентичные области выборки до и после инъекции. Это связано с характером установки и методом доставки лекарств. Тем не менее, мы можем отслеживать клетки от времени ранней после инъекции в течение нескольких часов. Хотя важно отслеживать отдельные клетки на протяжении всего эксперимента, региональные сдвиги в клеточной активации не менее важны и могут быть захвачены с помощью этого метода. Визуализация более двух флюорофоров на мультифотонный микроскоп одновременно на данный момент невозможна с учетом установки, поэтому ограничение этого метода заключается в том, что пользователи могут изображение двух флюорофоров, в отличие от других изображений оборудования, где 4 или более фторофоров могут быть визуализированы одновременно31. В целом, описанный протокол специфичен для целей нашей лаборатории и является полезным инструментом в выявлении клеточной активации, где экспериментальные возможности перевешивают ограничения протокола.

Методы, описанные в данной рукописи, дают ряд преимуществ по сравнению с существующими методами визуализации активации клеток. Во-первых, эксперименты, проведенные здесь in vivo, что позволяет в режиме реального времени визуализации клеток связывания и до принятия молекул, что непосредственно свидетельствует об активации конкретно в связи с оскорблением. Это дает преимущества по сравнению с другими методами, такими как традиционные методы визуализации живых клеток, потому что мы в состоянии сохранить окружающую среду клеток, что значительно снижает вероятность запутанных результатов из-за гипервозбудимости и эктопического активность клеток, связанных с травмой диссоциации32. Кроме того, использование мультифотонного микроскопа в этой экспериментальной обстановке уменьшает скорость, с которой флюорофоры фото-отбеливатель позволяет непрерывной и значительно больше сеансов изображения, что важно, если пользователь применяет этот метод для исследований исследуя скорость метаболизма или долгосрочную активацию33. Наконец, если типы клеток интерес находятся глубоко в ткани (100 мм) с помощью мультифотона микроскоп необходимо получить оптимальный сигнал34. В целом, если цель эксперимента пользователя состоит в том, чтобы изучить поглощение и активацию клеток в режиме реального времени в ответ на оскорбление, то использование двухфотонной микроскопии в сочетании с трансгенными линиями репортера больше подходит по сравнению с другими обычными методами воображения.

Этот метод позволяет пользователям выполнять продольные исследования на широкий спектр типов клеток в отношении активации, подвижности и взаимодействия между клетками и клетками. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет пользователям использовать свои собственные генетически помеченные зарегистрированные животные и заменить флуоресцентно помеченную молекулу в соответствии с их исследовательскими интересами (например, Tie2cre для эпителиальных клеток). Этот протокол не ограничивается конкретной установкой, показанной в наших экспериментах, и может быть сильно изменен в соответствии с потребностями любой лаборатории, используя генетические линии репортера и 2-фотонные кожные изображения в своих исследованиях. Мы планируем использовать этот подход для выявления активации и набора иммунных клеток к месту травмы после периферической травмы и определить, что конкретный курс времени активации и набора, чтобы мы могли лучше понять, что лучший подход для профилактических терапии в отношении различных форм боли.

В заключение, мы разработали новую технику, которая позволяет пользователям изображение поглощения флуоресцентно помечены LPS tdTomato помечены кожные фибробласты, выражающие TLR4 с помощью 2-фотона микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа поддерживается грантом NS096030 (MDB). Мы также хотели бы поблагодарить основного менеджера по визуализации Ведпракаш. Мы также хотели бы поблагодарить Olympus Discovery Center /Imaging Core объекта в UT Даллас для предоставления оборудования и поддержки

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS, 4 L Fisherbrand BP3994
700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe Hamilton 80501
BD Precision Glide Needle 30G VWR 305106
Blue Pad Fisherbrand 1420665
Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) Olympus FV30-FGR
Isoflurane, USP 250 mL Vedco 50989-150-15
Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate Sigma-Aldrich F3665-1MG
Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane Spectra Physics
Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL VWR 20170-333
Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN Olympus MPE-RS TWIN
Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD Olympus XLPLN25XWMP2
Personal Lubricant Jelly (Gel) equate ZH727 2E F1
SGM-4 Stereotaxic Apparatus Narishige 16030
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System Kent Scientific Corporation SS-01
Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane Spectra Physics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
  2. Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
  3. Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), New Rochelle. 356-369 (2017).
  4. Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
  5. Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
  6. Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).
  7. Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
  8. Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
  9. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  10. Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
  11. Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
  12. Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  13. Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
  14. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  17. Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
  18. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  19. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  20. Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
  21. Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, Suppl 1 85-91 (2004).
  22. Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
  23. Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
  24. Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
  25. Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
  26. Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
  27. Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
  28. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
  29. Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
  30. Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
  31. Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
  32. Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
  33. Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184 (2015).
  34. Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).

Tags

Биоинженерия Выпуск 149 Мультифотон Imaging платный рецептор 4 генетический репортер липополисахарид in vivo
В Vivo Двухцветные 2-фотон-изображения генетически-tagged репортер ателье клетки в коже
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szabo-Pardi, T. A., Agalave, N. M.,… More

Szabo-Pardi, T. A., Agalave, N. M., Andrew, A. T., Burton, M. D. In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin. J. Vis. Exp. (149), e59647, doi:10.3791/59647 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter