Summary
Morphologische Veränderungen treten in immunreagierenden Fibroblastenzellen nach aktivierung auf und fördern Veränderungen bei der Zellrekrutierung. Verwendung von 2-Photonen-Bildgebung in Verbindung mit einem gentechnisch veränderten Fibroblasten-spezifischen Protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) Mauslinie und grün fluoreszierend markiert Lipopolysaccharid-FITC, können wir hochspezifische Aufnahme von Lipopolysaccharid in dermalen Fibroblasten und morphologischen Veränderungen in vivo veranschaulichen.
Abstract
Fibroblasten sind mesenchymale Zellen, die ihre Morphologie nach Aktivierung verändern und letztlich die Mikroumgebung des Gewebes beeinflussen, in dem sie sich befinden. Obwohl herkömmliche bildgebende Verfahren nützlich sind, um Proteininteraktionen und Morphologie in festem Gewebe zu identifizieren, sind sie nicht in der Lage, Einen Einblick zu geben, wie schnell Zellen in der Lage sind, Proteine zu binden und aufzunehmen, und sobald sie aktiviert sind, wie sich ihre Morphologie in Vivo. In der vorliegenden Studie stellen wir 2 hauptgestellte Fragen: 1) Wie ist der Zeitverlauf der Fibroblastenaktivierung über mautähnliche Rezeptor-4 (TLR4) und Lipopolysaccharid (LPS) Interaktion und 2) wie verhalten sich diese Zellen, sobald sie aktiviert wurden? Mit 2-Photon-Bildgebung haben wir eine neuartige Technik entwickelt, um die Fähigkeit von LPS-FITC zu bewerten, sich an seinen Kognanrezeptor TLR4 zu binden, der auf peripheren Fibroblasten in der genetischen Reporter-Mauslinie ausgedrückt wird; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox in vivo. Dieser einzigartige Ansatz ermöglicht es Forschern, tiefgehende, zeitraffende Videos und/oder Bilder von Proteinen zu erstellen, die mit lebenden Zellen interagieren, was es einem ermöglicht, eine erhöhte Granularität zu haben, um zu verstehen, wie Proteine das zelluläre Verhalten verändern können.
Introduction
Lipopolysaccharid (LPS) ist ein Endotoxin, das in der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien gefunden wird1. LPS hat eine hohe Bindungsaffinität für den gebührenähnlichen Rezeptor 4 (TLR4)/CD14/MD2-Rezeptorkomplex2. TLR4 ist ein Mustererkennungsrezeptor, der häufig auf der äußeren Membran einer vielzahl von Immunzellen, mesenchymalen Zellen und einer Teilmenge sensorischer Neuronen3,4,5gefunden wird. Die Aktivierung von TLR4, ausgedrückt auf Immunzellen, führt zu MyD88-abhängigen und unabhängigen zweiten Botensystemen, die mit der Translokation des Kernfaktors kappa beta (NF-B) in den Zellkern enden. Dies bewirkt, dass die prototypische Immunzelle pro-inflammatorische Zytokine wie Interleukin (IL)-1, IL-6 und TNF-6 produziert und freisetzt. Wie andere Zelltypen auf die TLR4-Stimulation reagieren, ist jedoch nicht so klar. Fibroblasten wurden in eine Breite von Pathologien wie Krebs und Mukoviszidose verwickelt und haben vor kurzem gezeigt, dass eine Rolle Monozyten-Chemo-Attraktion und Förderung der Entzündung7,8,9. Unser Labor interessiert sich für die Rolle von Fibroblasten bei der Entwicklung akuter und chronischer Schmerzen, da erste Hinweise darauf hindeuten, dass Faktoren, die durch Fibroblasten freigesetzt werden (Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), Gewebeinhibitor von Metalloproteinasen (TIMPs) und Fibroblasten, Wachstumsfaktoren (FGFs)) sind an neuropathische Schmerzen beteiligt10.
Aktivierungszustände von Zellen können durch eine Vielzahl von Faktoren bestimmt werden, die folgendes umfassen: Induktion von sofort-frühen Genen, veränderte Proteinexpression, Zellproliferation und morphologische Veränderungen11,12,13. Es gibt viele Techniken, die existieren, um Fragen zu beantworten, die wir haben können, wie die Aktivierung von Zellen zu Pathologien beiträgt, aber sie alle haben ihre Grenzen. Die prototypische Immunhistochemie verwendet fluoreszierend markierte Antikörper, um Proteine von Interesse in festem Gewebe zu kennzeichnen, die unspezifisch sein können und oft eine signifikante Fehlerbehebung erfordern, bevor sie fruchtbare Ergebnisse liefert14. Western Blotting ist eine nützliche Technik beim Vergleich der Proteinexpression im post-mortem Gewebe; jedoch fehlt die histologische Komponente in dieser Technik und Forscher sind nicht in der Lage, Veränderungen in der Morphologie zu identifizieren15. RNA-Seq ermöglicht es uns, das Vorhandensein von Messenger-RNA in einer Probe zu quantifizieren, die in vielen Fällen aufschlussreiche Daten liefert; die Lücke zwischen Transkription und Übersetzung macht es jedoch schwierig, eine zeitliche Auflösung nach einem Stimulus16zu haben. Konfokale Bildgebung ist nützlich bei der Bestimmung der Expression und Kolokalisierung von Proteinen, die in einem Querschnitt von Geweben existieren17. Oft ist dies nicht repräsentativ für die Gesamtheit der Gewebeprobe. Im Gegensatz dazu ermöglichen Multiphotonenmikroskope dem Anwender, etwa 1 mm tief in eine Probe einzutauchen, wodurch eine umfassende dreidimensionale Darstellung18entsteht. Daher konzentrieren wir uns auf in vivo, 2-Photon Imaging Preps, da die aus diesen Experimenten gesammelten Daten direkter mit der hochplastischen und vernetzten Mikroumgebung von lebendem Gewebe in Verbindung stehen.
Ein Vorteil der Untersuchung von Protein-Rezeptor-Wechselwirkungen in vivo ist, dass wir klar erfassen können, wie Zellen in Echtzeit auf einen Stimulus in ihrer heimischen Umgebung reagieren, ohne den schädlichen und unvorhersehbaren Einfluss der postmortalen Gewebeextraktion19. Darüber hinaus können Längsschnittstudien durchgeführt werden, um die zelluläre Plastizität und Grundierung zu bewerten, die aufgrund der Aktivierung auftreten können. Mit 2-Photon-Bildgebung bewahren wir die Integrität der Mikroumgebung, die bei der Anwendung eines externen Stimulus vorhanden ist. Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, die Aufnahme von Molekülen in Fibroblasten nach der peripheren Injektion von fluoreszierend markiertem LPS im Laufe von mehreren Stunden in vivo und die Rolle von TLR4 bei der Fibroblastenaktivierung zu identifizieren.
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Protocol
Tierverfahren wurden von der University of Texas am Dallas Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und entsprachen den Richtlinien der National Institutes of Health. Alle Experimente wurden mit 8-12 Wochen alten männlichen und weiblichen Mäusen durchgeführt, die im eigenen Haus auf einem C57BL/6-Hintergrund gezüchtet wurden. Transgene Mäuse mit Kre-Rekombiinase, angetrieben durch den fibroblastenspezifischen Protein-1-Promoter, wurden kommerziell gekauft (Jackson, 012641) (FSP1cre)+/- und gekreuzt mit tdTomatolox-stop-lox Mäusen, auch kommerziell erworben ( Jackson, 007914) und (FSP1cre)+/- ; tdTomatolox-stop-lox und FSP1cre-/-; tdTomatolox-stop-lox Mäuse wurden im eigenen Haus auf einem C57BL/6 Hintergrund gezüchtet (Abbildung 1A,B,C). Fibroblasten-spezifisches Protein 1 ist ein endogenes Protein, das auf etwa 72% des Fibroblasten exprimiert wird und einen effektiven Krepptreiber im dermalen Gewebe20darstellt. Mäuse wurden in Gruppen untergebracht und ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser erhalten. Die Raumtemperatur wurde bei 21 °C bei 2 °C gehalten. Während wir C57BL/6 gekreuzte männliche und weibliche Mäuse mit 8-12 Wochen verwendet haben, glauben wir nicht, dass alter, geschlechtoder genetischer Hintergrund notwendige Voraussetzungen für Multiphotonenexperimente sind. Mäuse wurden unmittelbar nach dem Experiment tief beästhetisiert und eingeschläfert.
1. Zubereitung von Drogen
- Bereiten Sie eine 5-g/20-L-Lösung aus Lipopolysaccharid-FITC (siehe Materialtabelle) in sterilen 1x PBS (pH 7.4) vor. Wirbeln Sie die Stammlösung mit mittlerer Intensität für minimale 30 Sekunden, um eine homogene Mischung für eine gleichmäßige Konzentration in der gesamten Lösung vor dem Pipetieren zu gewährleisten (LPS ist ein glutinöses Molekül).
HINWEIS: Legen Sie LPS nicht in einen Glasbehälter, wenn möglich, verwenden Sie silikonisierte Mikrozentrifugenrohre. Auf Eis halten, bis es verwendet wird.
2. Imaging-Setup
- Richten Sie das Multiphotonensystem (siehe Materialtabelle) für die zweifarbige Bildgebung ein. Dies erfordert die Verwendung von zwei separaten Anregungslasern (siehe Materialtabelle),einem GFP/RFP-Filterwürfelsatz (siehe Materialtabelle) und einem 25-fachen (1,05 NA) Wasser-Immersion-Objektiv (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Benutzer können diese Einstellungen ändern, um alternative Setups und Multiphotonenmikroskop-Fähigkeiten besser anzupassen. Dies sind die Parameter, die im experimentellen Protokoll verwendet werden. Siehe Tabelle der Materialien für spezifische Details. - Stellen Sie ein stereotaxic-Gerät (siehe Materialtabelle) auf die Bühne des Multiphotonenmikroskops. Verbinden Sie diese mit einer Anästhesie-Liefermaschine (siehe Materialtabelle), um sicherzustellen, dass die Tiere für die Dauer des Experiments beästheisiert werden. Legen Sie ein Stück mattes schwarzes Papier auf die Oberfläche des Geräts als Verbindungspunkt für die Mauspfote.
- Wählen Sie den Resonanzscanner mit einer festen Scanfläche von 512 x 512 m aus.
HINWEIS: Führen Sie die Experimente in diesem Protokoll nicht mit einem Galvanometer-Scanner durch. Aufgrund der langsameren Abtastrate kommt es in Z-Stack-Zeitraffervideos zu Verzerrungen aufgrund der unvermeidbaren Atmung des Tieres. - Richten Sie die beiden Anregungslaser auf die Anregungswellenlängen von GFP und RFP, 930 nm bzw. 1100 nm, und richten Sie den Lichtweg beider Anregungslaser mit einem dichroitischen Spiegel von 690-1.050 nm auf das einzelne Objektiv, so dass der 930 nm-tuned Anregungslaser auf den Hauptscanner und den 1.100 nm-abgestimmten Laser reflektiert werden, um direkt in den Hauptscanner zu gelangen (Abbildung 2).
HINWEIS: Es ist möglich, diese Anregungswellenlängen abhängig von der Einrichtung des Benutzers zu ändern. - Stellen Sie die Laserleistung von FITC auf 5% und GFP auf 20% ein.
HINWEIS: Dieses Setup bietet ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) in diesen Experimenten. Erkennen von Signalen über Multialkali-Photomultiplikatorröhren (PMTs); GaAsP-Detektoren können jedoch stattdessen in sehr hochempfindlichen Experimenten eingesetzt werden. - Bereiten Sie den Raum für die Bildgebung unter dunklen Bedingungen ohne Streulicht vor.
3. In-vivo-Bildgebung
- Legen Sie die Maus in die Induktionskammer des Anästhesie-Liefersystems und verwenden Sie 5% Isofluran (siehe Materialtabelle) bei einem Sauerstoffdurchfluss von 2 l/min, um die Maus unter tiefe Anästhesie zu stellen.
HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, während des Experiments alle geeigneten PSA zu tragen.- Übertragen Sie die Maus auf das stereotaxic Gerät mit Zugang zu einem Nasenkegel, um anästhesie während des Experiments zu erhalten. Reduzieren Sie das Isofluran auf 1,5%-2% und halten Sie die Durchflussrate konstant.
-
Befestigen Sie die Hinterpfote fest auf einem Stück schwarzem Papier mit schwarzem Klebeband auf Bereichen, die sowohl proximal als auch distal für den Interessenbereich sind (dies reduziert die Auswirkungen der Mausatmung auf die Bildqualität), um sicherzustellen, dass die Pflanzoberfläche der Pfote ungehindert und nach oben gerichtet ist auf das Ziel hin. Stellen Sie sicher, dass der Mauskopf im Nasenkegel, der am Gerät befestigt ist, stabil ist.
HINWEIS: Überwachen Sie die Maus auf Anzeichen von Not oder Dehydrierung während des gesamten Experiments und passen Sie Isofluranentsprechend entsprechend an.
- Legen Sie eine großzügige Menge an sterilem Gleitmittel auf Wasserbasis (Gel, siehe Materialtabelle)auf die Plantaroberfläche der Pfote und berühren Sie das Ziel, um eine Flüssigkeitssäule zwischen der Pfote und dem Objektiv zu erzeugen.
- Verwenden Sie das FITC-Erregungslicht, um sich in die dermale Schicht der Pfote zu fokussieren. Stellen Sie sicher, dass tdTomato-markierte Fibroblasten visualisiert werden, bevor Sie fortfahren (dieser Schritt ist wichtig, um die richtige Fokusebene zum Bild zu bestimmen).
HINWEIS: Die dermale Schicht der Pfote beträgt ca. 100-150 m in der Pfote. - Stellen Sie die Fläche der Zellen, die sich direkt unter der Pflanzfläche der Hinterpfote befindet, mit den 930 nm- und 1100 nm-gestimmten Lasern ab und erfassen Sie einen 15-minütigen Zeitraffer von ca. 5-10 Z-Scheiben bei ca. 1 m pro Scheibe, um eine Darstellung der Umgebung vor Injektion mit LPS-FITC.
- Führen Sie eine intraplantare Injektion von 5 g/20 LPS-FITC auf die Hinterpfote der Maus mit einer 25-L-Glas-Hamilton-Spritze (siehe Materialtabelle)und einer 30G-Nadel (siehe Materialtabelle)durch, wobei darauf geachtet wird, die Position der Pfote nicht zu stören.
- Stellen Sie eine Zellfläche direkt unterhalb der Pflanzfläche der Hinterpfote mit den 930 nm und 1100 nm-gestimmten Lasern auf und erfassen Sie einen 60-120 Minuten dauernden Zeitraffer von etwa 5-10 Z-Scheiben bei ca. 1 m pro Scheibe, um die Aufnahme von LPS-FITC durch Zellen zu identifizieren.
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Representative Results
Zunächst injizierten wir LPS-FITC in die Hinterpfote von Wild-Typ-Mäusen, um die Aufnahme von LPS-FITC in allen Zelltypen zu visualisieren, die in der dermalen Schicht der Pfote vorhanden sind. Nachdem wir eine Vielzahl von Zellen in der dermalen Schicht der Hinterpfotenaufnahme fluoreszierend LPS in einer Wild-Typ-Maus beobachtet hatten (Videoabbildung 1, 2), versuchten wir, speziell Auf Fibroblasten zu zielen, da sie ein Primärfokus in unserer Forschung sind. Bevor wir die Pfoten von Tieren, die mit LPS-FITC injiziert wurden, gebildt wurden, wollten wir klarstellen, dass es keine inhärente Fluoreszenz von Zellen in der dermalen Schicht gibt. Dadurch soll sichergestellt werden, dass die Bilder, die wir aufnehmen, nach der Injektion echte Wechselwirkungen von Zellen mit dem fluoreszierend markierten LPS und nicht irgendwelche bildgebenden Artefakten sind (Video Abbildung 3, 4). Nach der LPS-FITC-Injektion binden und nehmen nur FSP1+ Fibroblasten, die TLR4 exprimieren, das injizierte Protein mit einem hohen Maß an Kolokalisierung mit dem tdTomato-Tag, ausgedrückt durch diese Zellen (VideoAbbildung 5). Im Gegensatz dazu binden und nehmen Mäuse, die TLR4 aus dem ganzen Körper geschlagen haben (TLR4KO), LPS nach der Injektion nicht und nehmen es auf. Wie im Video deutlich wird, sind Silhouetten von Zellen nach der LPS-FITC-Injektion sichtbar, was darauf hinweist, dass sich das Medikament in der interstitiellen Flüssigkeit um Zellen dispergiert, aber nicht tatsächlich durch einen Rezeptor gebunden ist (Videoabbildung 6).
Um unsere Ergebnisse zusammenzufassen, zeigen wir, in vivo, dass nach der Injektion von LPS-FITC, in einem FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox zellspezifische reaktivierte Tiere nur Fibroblasten interagieren mit und nehmen LPS auf. Im Gegensatz dazu binden und nehmen Ganzkörperknockouts von TLR4 LPS-FITC nach der Injektion nicht auf.
Abbildung 1 . tdTomato wird nur in FSP1+ Fibroblasten in einem Cre-Dependent Manner ausgedrückt. A) FSP1cre transgene Mäuse, die auf einem C57BL/6-Hintergrund gezüchtet werden, werden mit tdTomato-Mäusen gekreuzt, die auf einem C57BL/6-Hintergrund gezüchtet werden, um Mäuse zu erzeugen, die tdTomato in FSP1+ Fibroblast en cre-dependent art. B) Repräsentative PCR-Ergebnisse, die sowohl positive als auch negative FSP1cre-Mäuse darstellen, die tdTomato exzessizieren. C) Repräsentativer Piktograph von dermalen Fibroblasten im extrazellulären Raum in der Mauspfote. FSP1+ Mäuse drücken ein rotes fluoreszierendes Protein nur in Fibroblasten aus, während FSP1- Mäuse nicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 . Lichtpfad des zweifarbigen 2-Photonenmikroskops. Die Darstellung des Lichtwegs, der für das 2-farbige 2-Photon-Experiment eingerichtet wurde. Laser 1 ist auf 930 nm abgestimmt, um FITC-konjugiertes LPS zu erregen, und Laser 2 ist auf 1100 nm abgestimmt, um tdTomato in Fibroblasten zu erregen. Das Anregungslicht von Laser 1 wird vom dichroitischen Spiegel (690-1050 nm) reflektiert, während das Anregungslicht von Laser 2 zum Hauptscanner durchläuft. Das Anregungslicht beider Laser wird durch einen Satz Von Spiegeln zu einem zweiten dichroitischen Spiegel (650 nm) reflektiert, der es ermöglicht, dass Anregungslicht durch das Objektiv und in das Gewebe gelangt, um die Fluorophore zu erregen. Licht wird von den angeregten Fluorophoren emittiert und vom 25-fachen Objektiv erfasst und vom dichroitischen Spiegel (650) zu den Multialkali-Photomultiplierröhren reflektiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 . Experimentelles Flussdiagramm der 2-Photonenmikroskopie. Mäuse werden mit einem Low-Flow-Anästhesiesystem und stereotaxic-Geräten befruchtet und immobilisiert. Die Plantaroberfläche der Pfote zeigt sich dem Ziel und wird für 15 Minuten abgebildet. Die Intraplantar-Injektion von 5 g/20 l LPS-FITC wird an der anästhesierten Maus durchgeführt und die Pfote wird dann für eine Für das Ziel des Experiments notwendige Zeit abbilden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video Abbildung 1. Z-Stack Videos der LPS-FITC-Aufnahme in Zellen in Wild Typ C57BL/6 Mäusen. Z-Stack-Video der dermalen Schicht der Hinterpfote einer C57BL/6 Maus vor LPS-FITC-Injektion. Der plantare Aspekt einer wildartigen Mauspfote wurde 15 Minuten vor der Injektion mit LPS-FITC zur Steuerung der im GFP-Kanal hergestellten Autofluoreszenz abgebildet. Es gibt wenig bis kein Signal im GFP-Kanal, das keine Autofluoreszenz anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video Abbildung 2. Z-Stack-Video der dermalen Schicht der Hinterpfote einer C57BL/6 Maus nach LPS-FITC-Injektion. Der plantare Aspekt einer wilden Mauspfote wurde für 1,5 Stunden nach der LPS-FITC-Injektion abgebildet, um die Aufnahme von LPS-FITC durch alle Zellen zu visualisieren, die TLR4 exezieren. Wie im Video deutlich wird, bindet und nimmt eine Vielzahl von Zellen LPS-FITC während des gesamten Experiments auf. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video Abbildung 3. Z-Stack-Video der dermalen Schicht der Hinterpfote eines FSP1cre; tdTomatenmaus vor LPS-FITC-Injektion. Der Plantar-Aspekt eines FSP1cre; tdTomato Mauspfote wurde 15 Minuten vor der Injektion mit LPS-FITC zur Steuerung der im GFP-Kanal hergestellten Autofluoreszenz abgebildet. Es gibt wenig bis kein Signal im GFP-Kanal, das keine Autofluoreszenz anzeigt. tdTomaten-positive Fibroblasten werden visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video Abbildung 4. Z-Stack-Video der dermalen Schicht der Hinterpfote einer TLR4 KO-Maus vor DER LPS-FITC-Injektion. Der plantare Aspekt der TLR4KO Mauspfote wurde 15 Minuten vor der Injektion mit LPS-FITC zur Steuerung der im GFP-Kanal hergestellten Autofluoreszenz abgebildet. Es gibt wenig bis kein Signal im GFP-Kanal, das keine Autofluoreszenz anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video Abbildung 5. Z-Stack-Video der dermalen Schicht der Hinterpfote eines FSP1cre; tdTomatenmaus nach LPS-FITC-Injektion. Der Plantar-Aspekt eines FSP1cre; tdTomato Mauspfote wurde für 1,5 Stunden post-LPS-FITC Injektion abgebildet, um die Aufnahme von LPS-FITC durch tdTomato-positive Fibroblasten zu visualisieren, die TLR4 exezieren. Wie im Video deutlich wird, wird eine hochspezifische Aufnahme von LPS-FITC über TLR4 gesehen, ausgedrückt auf tdTomato-positiven Fibroblasten. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video Abbildung 6. Z-Stack-Video der dermalen Schicht der Hinterpfote einer TLR4 KO-Maus nach LPS-FITC-Injektion. Der Plantar-Aspekt einer TLR4 KO-Mauspfote wurde 1,5 Stunden nach der LPS-FITC-Injektion abgebildet, um zu visualisieren, ob die Aufnahme von LPS-FITC durch Zellen in einem Ganzkörper-Knockout von TLR4 möglich ist. Wie im Video deutlich wird, wird von der Zelle in der dermalen Schicht der Hinterpfote keine Aufnahme von LPS-FITC gesehen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
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Discussion
Die wohl wichtigsten Schritte der in vivo 2-Photonen-Bildgebung sind: 1) Die Wahl der richtigen genetischen Reportermaus und fluoreszierend getaggtes Protein für den Multi-Photon-Setup und experimentelle Bedürfnisse21,22; 2) Abbildung der richtigen Fokalebene, um eine genaue Darstellung der Population der Zellen im Gewebe23zu haben; 3) Minimierung der Bewegung durch ein unsachgemäß immobilisiertes Tier24; und 4) Auswahl, wann Daten qualitativ vs. quantitativ25,26,27analysiert werden sollen. Wenn Sie sicherstellen, dass diese Punkte vor Beginn eines Experiments angegangen werden, wird das Wissen zur Verfügung gestellt, um Daten zu sammeln, die sowohl reproduzierbar als auch wissenschaftlich streng sind.
Eine wichtige Überlegung im Protokoll ist die ordnungsgemäße Immobilisierung der zu bebildernden Region. Die Atmung des Tieres verursacht winzige Verschiebungen in der Brennebene während der Bildgebung und bei der Durchführung von Z-Stack- und Zeitraffervideos, dies verursacht erhebliche Verzerrungen im Video und kann sich negativ auf die Qualität der erzeugten Daten auswirken. Wenn sichergestellt wird, dass die Pfote richtig immobilisiert ist, wird eine erfolgreiche Bildgebung der Pfote ohne Unterbrechung der Atmung ermöglicht. Darüber hinaus ist das Wissen um die Lokalisierung von Zellen im Experiment ein wichtiger Schritt bei der Identifizierung der richtigen Fokusebene, um sie zu visualisieren. Da wir uns entschieden haben, uns auf dermale Fibroblasten zu konzentrieren, müssen wir nur einen relativ kurzen Abstand in die Pfote abbilden, um unsere Zellarten des Interesses (100-150 m) visualisieren zu können. In anderen Experimenten ist es wichtig, die Fähigkeiten des Mikroskops und objektive verwendet zu berücksichtigen, da die Durchführung eines Experiments, um Zellen tief im Gewebe abzubilden, angesichts der Einrichtung der Benutzer schwierig bis unmöglich sein kann. Schließlich ist die Entscheidung, wie die Datenanalyse anzunähern ist, ein wichtiger Aspekt in den letzten Schritten des Experiments. Hier zeigen wir, dass Fibroblasten, die TLR4 exprimieren, in der Lage sind, fluoreszierend markierteS LPS aufzunehmen und zu binden, was durch die robuste Kolokalisierung von Grün (LPS) und Rot (tdTomato, ausgedrückt durch Fibroblasten) in den Videos deutlich wird. Obwohl in diesem Protokoll keine quantitative Bildanalyse durchgeführt wird, gibt es eine Vielzahl von Möglichkeiten, wie ein Benutzer daten aus diesem Protokoll interpretieren kann. Die erste ist eine einfache Co-Lokalisierungsanalyse mit Open-Source-Software, um die Intensität von zwei unterschiedlichen Farben in einem bestimmten Pixel28zu messen. Dadurch kann der Benutzer erkennen, ob zwei angeregte Fluorophore auf einem bestimmten Pixel in einem aufgenommenen Bild oder Video erkannt werden und wie viel davon sich in einem bestimmten Raum befindet. Dies ist nützlich, um zu identifizieren, ob die Zellen von Interesse zu einer gewissen Kapazität mit dem injizierten Molekül interagieren. Eine alternative Methode der quantitativen Analyse ist die Fluoreszenzintensität29. Der Benutzer ist in der Lage, Informationen über die Intensität eines bestimmten Signals innerhalb einer Zelle von Interesse zu sammeln. Die aus diesen Analysen gewonnenen Daten können darauf hindeuten, wie Zellen im Vergleich zu anderen verschiedene Mengen eines Moleküls aufnehmen können. Diese Methoden der Datenanalyse sind ein Beispiel dafür, wie der Benutzer versuchen könnte, Daten zu analysieren, die aus einem Experiment gesammelt wurden, ähnlich dem in diesem Protokoll durchgeführten.
Unsere genetischen Modelle ermöglichen es uns, selektiv fluoreszierend FSP1+ Fibroblasten in einer cre/loxP-abhängigen Weise zu markieren, was eine schnelle und einfache Visualisierung von Zellen in der Hautdermisermöglicht. Obwohl dies die Visualisierung von Zellen aufgrund ihrer inhärenten Fluoreszenz erleichtert, ist es möglich, 2-Photonen-Bildgebung ohne genetisch markierte Zellen durchzuführen, wenn der Benutzer erfahrungsgemäß die Verschiebung von der Epidermis zur Dermis bestimmt. Die Verwendung der robusten Mengen der Autofluoreszenz aus dem Haar auf der Haut kann ein nützlicher Indikator dafür sein, wo der Benutzer konzentriert und die Richtung, in die man sich bewegen muss, um die gewünschte Brennebene zu erhalten. Dies wird natürlich nur funktionieren, wenn die Fokale Ebene des Interesses in der Nähe der Haut und wird nicht die Zelle von Interesse tief im Gewebe ist.
Das Verfolgen einer Fokusebene während des gesamten Experiments ist ideal; Aufgrund der Atmung eines lebenden Tieres ist es jedoch schwierig, Rahmenverschiebungen im Laufe der Zeit zu verhindern, wenn z-stacks in ein Zeitrafferexperiment integriert werden. Um dieses Problem zu beheben, kann der Benutzer erwägen, die Bildqualität zu reduzieren, indem er die Zeilenmittelung verringert, wenn ein Resonanzscanner verwendet wird, und die Abtastrate erhöht. Wie bereits erwähnt, ist es fast unmöglich, einen herkömmlichen Galvanometer-Scanner in einem Experiment zu verwenden, bei dem ein Z-Stack und Zeitraffer aufgrund der langsameren Abtastrate des Scanners eingebaut werden.
Wenn Sie die Dauer der Bildaufnahme ändern, kann der Benutzer die Anforderungen seines Experiments besser erfüllen. Während die Bildgebung des Tieres für längere Zeit ermöglicht es dem Benutzer, Daten über alle Schritte der Molekülendozytose und des Stoffwechsels zu sammeln, die Verkürzung der Zeit, nur bestimmte Teile des Prozesses zu bilden, wird die Effizienz erhöhen. Es ist möglich, für einen kürzeren Zeitraum (ca. 1-15 Minuten) abbilden, um Molekülanhaftung zu identifizieren, einen längeren Zeitraum (ca. 15-30 Minuten), um Rezeptor-Ligand-Endozytose30zu visualisieren, und die volle Dauer (ca. 30-60 Minuten) zur Visualisierung der zellulären Aktivierung und potentiellen Stoffwechsel des Moleküls. Dies ist jedoch stark vom injizierten Molekül abhängig und die Zellen wurden visualisiert (Abbildung 3).
Ein wichtiger Hinweis in dem in diesem Manuskript beschriebenen experimentellen Protokoll ist, dass wir derzeit nicht in der Lage sind, identische Probenbereiche vor und nach der Injektion abzubilden. Dies ist aufgrund der Art der Einrichtung und der Methode der Medikamentenabgabe. Wir sind jedoch in der Lage, Zellen von einer Zeit frühen Post-Injektion für mehrere Stunden zu verfolgen. Während es wichtig ist, einzelne Zellen im Laufe des Experiments zu verfolgen, sind regionale Verschiebungen in der zellulären Aktivierung ebenso wichtig und können mit dieser Methode erfasst werden. Die Visualisierung von mehr als zwei Fluorophoren auf einem Multiphotonenmikroskop gleichzeitig ist im Moment nicht möglich, da die Einrichtung eine Einschränkung dieser Methode ist, dass Benutzer nur in der Lage sind, zwei Fluorophore im Gegensatz zu anderen bildgebenden Geräten abzubilden, wobei 4 oder mehr Fluorophore sind in der Lage, gleichzeitig visualisiert werden31. Insgesamt ist das beschriebene Protokoll spezifisch für die Ziele unseres Labors und stellt ein nützliches Werkzeug zur Identifizierung der zellulären Aktivierung dar, bei der die experimentellen Möglichkeiten die Grenzen des Protokolls überwiegen.
Die in diesem Manuskript beschriebenen Methoden bieten eine Reihe von Vorteilen gegenüber bestehenden Methoden zur Visualisierung der Aktivierung von Zellen. Die erste ist, dass die hier durchgeführten Experimente in vivo durchgeführt werden, was eine Echtzeit-Visualisierung von Zellen ermöglicht, die Moleküle binden und aufnehmen, was direkt auf eine Aktivierung direkt in Bezug auf eine Beleidigung hindeutet. Dies bietet Vorteile gegenüber anderen Methoden wie herkömmlichen Live-Zell-Bildgebungsverfahren, da wir in der Lage sind, die Umgebung der Zellen zu erhalten, was die Wahrscheinlichkeit von verwirrenden Ergebnissen aufgrund von Hypererpressbarkeit und ektopischen Ergebnissen signifikant verringert. Aktivität von Zellen im Zusammenhang mit dem Trauma der Dissoziation32. Darüber hinaus verringert der Einsatz eines Multiphotonenmikroskops in dieser experimentellen Umgebung die Rate, mit der Fluorophore Photobleichmittel ermöglichen kontinuierliche und deutlich längere Bildgebungssitzungen, was wichtig ist, wenn der Benutzer diese Methode auf Studien anwendet. Untersuchung der Stoffwechselrate oder Langzeitaktivierung33. Schließlich, wenn die Zellarten des Interesses tief im Gewebe (>100 mm) mit einem Multiphotonenmikroskop befindet, ist notwendig, um ein optimales Signal zu erhalten34. Insgesamt, wenn das Ziel eines Benutzerexperiments ist es, Echtzeit-Aufnahme und Aktivierung von Zellen als Reaktion auf eine Beleidigung zu studieren, dann mit Zwei-Photon-Mikroskopie gekoppelt mit transgenen Reporterlinien ist besser geeignet als andere konventionelle Vorstellungstechniken.
Diese Technik ermöglicht es Benutzern, Längsuntersuchungen an einer Vielzahl von Zelltypen in Bezug auf Aktivierung, Beweglichkeit und Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen durchzuführen. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es benutzern ermöglicht, ihre eigenen genetisch markierten gemeldeten Tiere zu verwenden und das fluoreszierend markierte Molekül entsprechend ihren Forschungsinteressen (z. B. Tie2cre für Epithelzellen) zu ersetzen. Dieses Protokoll ist nicht auf die spezifische Einrichtung beschränkt, die in unseren Experimenten gezeigt wird, und kann stark modifiziert werden, um den Bedürfnissen jedes Labors gerecht zu werden, das genetische Reporterlinien und 2-Photonen-Dermal-Bildgebung in ihren Studien verwendet. Wir planen, diesen Ansatz zu verwenden, um die Aktivierung und Rekrutierung von Immunzellen an den Ort der Verletzung nach einem peripheren Trauma zu identifizieren und zu bestimmen, was der spezifische Zeitverlauf der Aktivierung und Rekrutierung ist, damit wir besser verstehen, was der beste Ansatz ist für präventive Therapeutika ist in Bezug auf verschiedene Formen von Schmerzen.
Abschließend haben wir eine neuartige Technik entwickelt, die es Benutzern ermöglicht, die Aufnahme von fluoreszierend markiertem LPS durch tdTomato-markierte dermale Fibroblasten, die TLR4 mit 2-Photonen-Mikroskopie exezieren, abzubilden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch den Zuschuss NS096030 (MDB) unterstützt. Wir möchten uns auch beim Imaging-Core-Manager Ved Prakash bedanken. Wir danken auch olympus Discovery Center/Imaging Core Facility an der UT Dallas für die Bereitstellung von Ausrüstung und Support
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
References
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