यहाँ, हम रोगी जैविक तरल पदार्थ (बायोफ्लूइड्स) में मौजूद डीएनए में ट्यूमर दैहिक उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हमारी छोटी बूंद डिजिटल polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (dPCR) आधारित विधि ट्यूमर उत्परिवर्तन allelic आवृत्ति (MAF) के परिमाणीकरण सक्षम बनाता है, निदान और ट्यूमर प्रतिक्रिया के अस्थायी निगरानी के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव पूरक की सुविधा.
अग्रिम और दोहराने शल्य ऊतक नमूने के साथ जुड़े जटिलताओं आणविक उप वर्गीकरण और चिकित्सा के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया के अस्थायी निगरानी में सक्षम न्यूनतम इनवेसिव प्लेटफार्मों के लिए की जरूरत मौजूद है। यहाँ, हम सेल मुक्त डीएनए (cfDNA) में ट्यूमर दैहिक उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए हमारे dPCR आधारित विधि का वर्णन, रोगी biofluids में आसानी से उपलब्ध है. हालांकि उत्परिवर्तनों कि प्रत्येक परख में के लिए परीक्षण किया जा सकता है की संख्या में सीमित, इस विधि संवेदनशीलता और विशिष्टता के एक उच्च स्तर प्रदान करता है. उत्परिवर्तन बहुतायत की निगरानी, के रूप में एमएएफ द्वारा गणना, चिकित्सा के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, जिससे रेडियोग्राफिक इमेजिंग के लिए एक बहुत जरूरी पूरक प्रदान.
आणविक विश्लेषण के लिए ट्यूमर ऊतक की उपलब्धता में सीमाओं के कारण, प्लाज्मा, सीरम और मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) सहित रोगी biofluids में ट्यूमर दैहिक उत्परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम अत्यधिक संवेदनशील तरीकों के विकास के लिए एक की जरूरत है . उदाहरण के लिए, बाल चिकित्सा फैलाना midline gliomas (DMGs) उनके neuroanatomical स्थान के कारण एक चुनौती मौजूद है. पिछले एक दशक में, DMG ऊतक नमूनों की आणविक रूपरेखा इस ट्यूमर प्रकार1 में ड्राइवर उत्परिवर्तनों का पर्दाफाश किया है और उत्परिवर्तनों के स्थानिक और लौकिक विषमता से पता चला है, बायोप्सी एक रोग के भीतर एक रोगी की विशेषता के लिए आवश्यक बनाने उपसमूह और आणविक-लक्षित चिकित्सा2को बढ़ावा देने | इस प्रकार, नैदानिक परीक्षण अग्रिम निदान3,4,5,6पर ट्यूमर आणविक रूपरेखा के लिए सर्जिकल बायोप्सी को एकीकृत करने के लिए वकालत करते हैं । उपचार के दौरान, DMGs में चिकित्सीय प्रतिक्रिया की निगरानी एमआरआई करने के लिए सीमित है, जो छोटे परिवर्तन या ट्यूमर जीनोमिक विकास का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता का अभाव है. एमआरआई भी ट्यूमर की साइट पर छद्म प्रगति, क्षणिक सूजन है कि इमेजिंग पर सही प्रगति mimics और ट्यूमर प्रतिक्रिया7की गलत व्याख्या misinform हो सकता है का पता लगाने के लिए प्रवण है. इस प्रकार, DMGs ट्यूमर उत्परिवर्तनों का पता लगाने और नैदानिक प्रतिक्रिया की निगरानी के एक विकल्प, न्यूनतम इनवेसिव साधन के लिए एक उच्च आवश्यकता के साथ एक ट्यूमर प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन जरूरतों को पूरा करने के लिए, हमने पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित किया है, और मिडलाइन ग्लिओमास8के साथ बच्चों के प्लाज्मा, सीरम और सीएसएफ से cfDNA में ट्यूमर उत्परिवर्तनों की एलाइजा आवृत्ति, मात्रा निर्धारित की है। यह देखते हुए कि बचपन DMGs अक्सर (gt; 80%) एक दैहिक lysine-to-methionine उत्परिवर्तन की स्थिति पर 27 histone संस्करण H3.1 (H3.1K27M, 20% मामलों के) या H3.3 (H3.3K27M, मामलों के 60%)1,इन और अन्य उत्परिवर्तनों DMGs की विशेषता (यानी, ACVR1, PIK3R1)के लिए लक्षित किया गया उत्परिवर्ती allele परिमाणीकरण cfDNA8का उपयोग कर . इस परख अनुक्रम विशिष्ट प्राइमर और जांच का उपयोग कर अन्य ट्यूमर प्रकार में हॉटस्पॉट उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए सिलवाया जा सकता है। इस दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा यह कैंसर की एक किस्म है जो cfDNA आधारित नैदानिक उपकरण और चिकित्सीय निगरानी के एकीकरण से लाभ होगा के लिए लागू बनाता है.
संवेदनशील cfDNA में कम allelic आवृत्ति उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए, हम एक छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर (dPCR) आधारित दृष्टिकोण को रोजगार. इस विधि में, पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण dPCR मंच (जैसे, RainDance) का उपयोग कर 10 लाख बूंदों की एक सैद्धांतिक अधिकतम में विभाजित है, पीसीआर प्रति 7-9 लाख बूंदों के साथ अच्छी तरह से आम तौर पर प्रयोगात्मक देखा. नमूना विभाजन के उच्च डिग्री के कारण, सबसे अधिक केवल एक से दो डीएनए अणुओं प्रत्येक छोटी बूंद में मौजूद हो सकता है. पीसीआर प्रवर्धन और अनुक्रम-विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच संकरीकरण प्रत्येक छोटी बूंद में हो सकता है, इस तरह है कि प्रतिक्रियाओं के लाखों जगह ले. यह संवेदनशीलता को अधिकतम और दुर्लभ उत्परिवर्ती alleles का पता लगाने में सक्षम बनाता है, जो अन्यथा wildtype डीएनए की एक पृष्ठभूमि के खिलाफ नहीं चल पाता जा सकता है. बंद न्यूक्लिक एसिड (एलएनए) जांच का उपयोग बेमेल संकरण को सीमित करके और सटीक उत्परिवर्तनकापता लगाने 9 ,10,11का समर्थन करके परख की विशिष्टता को बढ़ाता है . यहाँ, हम नमूना प्रसंस्करण, cfDNA निष्कर्षण, लक्ष्य alleles, dPCR और डेटा विश्लेषण के preamplification के हमारे तरीकों का वर्णन.
यहाँ हम का पता लगाने और रोगी तरल बायोप्सी से cfDNA में ट्यूमर उत्परिवर्तनों के एलीक आवृत्ति मात्रा निर्धारित करने के लिए हमारी विधि प्रस्तुत किया है. हम पूर्व विश्लेषणात्मक नमूना प्रसंस्करण, cfDNA निष्कर्षण, पीसीआर परख डिजाइन, और डेटा विश्लेषण सहित इस विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण कदम पर जोर। इस्तेमाल किया नमूना मात्रा को सीमित करने के लिए, cfDNA प्लाज्मा के 1 एमएल लेकिन सीएसएफ के केवल 500 डिग्री एल से निकाला जाता है। सीएसएफ से निकालने पर, 1 एमएल मूत्र से निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल (cfDNA निष्कर्षण किट पुस्तिका12का पालन करना) का उपयोग किया जाता है, निर्माता की सिफारिश के अनुसार। प्लाज्मा और सीएसएफ के बीच आवश्यक नमूना मात्रा में अंतर मस्तिष्क ट्यूमर के साथ रोगियों के सीएसएफ की तुलना में प्लाज्मा में ट्यूमर-विशिष्ट cfDNA के निचले स्तर के कारण है, उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए बड़ा नमूना मात्रा की आवश्यकता8. यदि नमूना उपलब्ध है, प्लाज्मा के अधिक से अधिक 1 एमएल उच्च डीएनए उपज का उत्पादन करने से निकाला जा सकता है. हालांकि, बाल चिकित्सा रोगियों के मामले में, यह जब भी संभव इस्तेमाल किया रक्त की मात्रा को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में भी रक्त आकर्षित के रूप में एक सरल प्रक्रिया विकिरण उपचार के दौर से गुजर कैंसर के साथ बाल चिकित्सा रोगियों के लिए fatiguing है. प्लाज्मा के 1 एमएल alicots से निकालने भी extractions को दोहराने में सक्षम बनाता है, इस तरह है कि परख दोहराया जा सकता है (जैसे, डीएनए निष्कर्षण या नमूना संदूषण में विफलता के मामलों में).
किसी भी नमूना उपयोग है कि सख्ती से आवश्यक नहीं है को कम करने के प्रयास में, cfDNA आम तौर पर मात्रा निर्धारित नहीं है. तथापि, हमने प्लाज्मा तथा सीएसएफ में क्रमश 0ण्2-2 एनजी/जेडएल तथा 0ण्6-13 एनजी/जेडएल के बीच cfDNA सांद्रता की एक श्रेणी पाई है। cfDNA की कम मात्रा को देखते हुए, और तथ्य यह है कि ट्यूमर विशेष उत्परिवर्ती alleles एक कम आवृत्ति पर मौजूद हैं, एक पूर्व amplification कदम dPCR के लिए इस्तेमाल किया प्राइमर का एक ही सेट का उपयोग कर काफी नमूना में लक्ष्य डीएनए की मात्रा में वृद्धि करने के लिए आवश्यक है, में सहायता उत्परिवर्तन का पता लगाने8| डीएनए निलंबन बफर में पूर्व amplified उत्पाद को कम करने तकनीकी प्रतिकृति के लिए पर्याप्त मात्रा प्रदान करता है, जो सच सकारात्मक भेद में एड्स. क्योंकि उत्परिवर्ती बूंदों की संख्या कम हो सकती है (उदाहरण के लिए, प्लाज्मा नमूने में 0-2 उत्परिवर्ती बूंदों के बीच), तकनीकी प्रतिकृतियां का समावेश उत्परिवर्तन स्थिति को हल करने के लिए महत्वपूर्ण है। जबकि एक पीसीआर अच्छी तरह से 0 उत्परिवर्ती बूंदों उपज सकता है, अन्य दो एक एकल प्लाज्मा नमूने के लिए 1-2 उपज हो सकता है triplicate में विश्लेषण; इस प्रकार, प्रतिकृति का समावेश अधिक सटीकता के लिए अनुमति देता है जब उत्परिवर्तन की स्थिति का निर्धारण. MAF तब प्रतिकृति मान के औसत के रूप में परिकलित की जाती है।
एकाधिकएक्सड पूर्व amplification (पूर्व प्रकार और ब्याज के दो उत्परिवर्तनों के उत्परिवर्ती alleles) एक ही नमूना की उपयोगिता बढ़ जाती है, के रूप में एक ही प्रारंभिक सामग्री दो उत्परिवर्तनों के लिए परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात यह है कि एक मल्टीप्लेक्स preamplification उत्पाद अधिक से अधिक सादगी के लिए dPCR के दौरान एकल plex में विश्लेषण किया जा सकता है, के रूप में यहाँ वर्णित. हालांकि, दोनों preamplification पीसीआर और डीपीसीआर multiplexed किया जा सकता है। जब multiplexing, शर्तों प्राइमर और जांच के दोनों सेट के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए: प्राइमर अनीलन तापमान पीसीआर प्रवर्धन में एक साथ चलाने के लिए समान होना चाहिए, और जांच अलग समूहों उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन किया जाना चाहिए ( फ्लोरोसेंट संकेत के आधार पर और तीव्रता)। प्राइमर और जांच का एक नया सेट मान्य करते समय, निर्माता द्वारा सुझाए गए रेंज के आधार पर इष्टतम अनीलन तापमान निर्धारित करने के लिए एक अनीलन तापमान ढाल चलाएं। रोगी cfDNA नमूनों पर जांच परीक्षण से पहले, उन्हें सिंथेटिक डीएनए का उपयोग कर मान्य निर्माण और / या ट्यूमर ऊतक विभिन्न आदानों के gDNA (यानी, अप करने के लिए 10 एनजी).
अधिक विशिष्टता और लक्ष्य डीएनए के लिए जांच के संकरीकरण में कम बेमेल के साथ उत्परिवर्ती alleles का पता लगाने के लिए, बंद न्यूक्लिक एसिड (LNA) जांच का उपयोग किया जाता है. LNA एक न्यूक्लिक एसिड एक मेथिलीन पुल के साथ अनुरूप है जो 2′-ऑक्सीजन और राइबोस रिंग9के 4’कार्बन को जोड़ता है। मेथिलीन पुल न्यूक्लिक एसिड को एक कठोर bicyclic conformation में बंद कर देता है जो लचीलापन को प्रतिबंधित करता है, थर्मल डुप्लेक्स स्थिरता को बढ़ाता है, और डीएनए10,18को लक्षित करने के लिए जांच संकरीकरण की विशिष्टता में सुधार करता है, 19. यदि LNA जांच और टेम्पलेट डीएनए के बीच एक एकल आधार बेमेल मौजूद है, तो जांच और लक्ष्य के बीच डुप्लेक्स गठन अस्थिर हो जाएगा. इस प्रकार, LNA जांच जांच बाध्यकारी की विशिष्टता में सुधार और एक उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात11में परिणाम. गैर-सीएनएस रोगग्रस्त बाल चिकित्सा रोगियों से प्लाज्मा और सीएसएफ का विश्लेषण LNA जांच H3F3A p.K27M को लक्षित करने के साथ हमारे परख की विशिष्टता की स्थापना की है, यह निर्धारित करने के लिए कि बराबर या उससे कम की एक allelic आवृत्ति 0.001% एक झूठी सकारात्मक माना जाता है 8. जांच और प्राइमर के डिजाइन को अनुकूलित करने के लिए अतिरिक्त विचार के लिए, जिसमें जीसी सामग्री, amplicon आकार, जांच रिपोर्टर रंगों, और शमनक शामिल हैं , डीपीसीआर निर्माता दिशानिर्देश14,17का संदर्भ लें . हालांकि हमारी विधि RainDance प्रणाली के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित है, प्रोटोकॉल अन्य dPCR प्लेटफार्मों के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
यहाँ प्रस्तुत विधि उच्च संवेदनशीलता और लक्ष्य संवर्धन dPCR द्वारा हासिल की है, जो cfDNA में दुर्लभ ट्यूमर उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए पसंद का मंच बनी हुई है से शक्ति खींचता है. हालांकि शक्तिशाली, dPCR उत्परिवर्तनों कि एक ही परख में के लिए परीक्षण किया जा सकता है की संख्या में सीमित है. dPCR के लिए एक विकल्प अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस), जो कई जीन भर में कई उत्परिवर्तनों का पता लगा सकते है, एक ही नमूने की उपयोगिता में वृद्धि. NGS सीएसएफ में उत्परिवर्तन ों का पता लगाने और brainstem gliomas के साथ रोगियों के प्लाज्मा कर सकते हैं20, तथापि, वर्तमान में cfDNA में ट्यूमर उत्परिवर्तनों का पता लगाने में dPCR से कम संवेदनशील है, का पता लगाने की सीमा के साथ 0.1-10% MAF पीसीआर आधारित दृष्टिकोण में 0.001% की तुलना में21 . dPCR भी NGS की तुलना में तेजी से बदलाव समय प्राप्त करता है, ब्याज के उत्परिवर्तनों का तेजी से पता लगाने में सक्षम. पीसीआर दृष्टिकोण कैंसर के प्रकार में लागू है और हॉटस्पॉट उत्परिवर्तनों और methylated cfDNA22का पता लगाने के लिए विस्तार किया जा सकता है.
तरल बायोप्सी वास्तव में अपनी प्रारंभिक अवस्था में है और विशिष्ट रोगों के लिए सिलाई के लिए आगे के विकास की आवश्यकता होगी. ट्यूमर विकास के संदर्भ में ट्यूमर की निगरानी अगली चुनौती होगी, जहां उच्च संवेदनशीलता के साथ उभरते उत्परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम एक मंच की आवश्यकता होगी। इसके अतिरिक्त, विभिन्न प्रकार के जैव अणुओं (पेप्टाइड्स, साइटोकिन्स, आरएनए) का पता लगाने में सक्षम प्लेटफार्म उपचार के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया का आकलन करने में अत्यधिक फायदेमंद होंगे, साथ ही व्यक्तिगत नैदानिक हस्तक्षेपों को आगे बढ़ाना।
The authors have nothing to disclose.
लेखक सभी रोगियों और उनके परिवारों की उदारता को स्वीकार करना चाहते हैं. यह काम मुंहतोड़ अखरोट फाउंडेशन (मध्यबर्ग, VA), वी फाउंडेशन (अटलांटा, GA), गैब्रिएला मिलर बच्चों के पहले डेटा संसाधन केंद्र, बच्चों के राष्ट्रीय में नैदानिक और अनुवाद विज्ञान संस्थान से धन द्वारा समर्थित किया गया था ( 5UL1TR001876-03), Musella फाउंडेशन (Hewlett, NY), मैथ्यू लार्सन फाउंडेशन (Franklin झील, एनजे), बाल चिकित्सा मस्तिष्क कैंसर अनुसंधान के लिए Lilabean फाउंडेशन (सिल्वर स्प्रिंग, एमडी), बचपन मस्तिष्क ट्यूमर फाउंडेशन (जर्मन शहर, एमडी), बच्चों के मस्तिष्क ट्यूमर ऊतक कंसोर्टियम (फिलाडेल्फिया, पीए), और बचपन कैंसर अनुसंधान के लिए रैली फाउंडेशन (अटलांटा, GA).
10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) | Teknova | T0227 | |
BD Vacutainer K2-EDTA 7.2mg Blood Collection Tubes (10mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367525 | For plasma collection |
BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367895 | For serum collection |
Bleach | General Lab Supplier | ||
Buffer ATL | Qiagen | 19076 | |
Cell-Free DNA Blood Collection Tubes | Streck | 218961 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
CentriVap Concentrator | Labconco | 7810010 | |
Forward Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
MiniAmp Thermal Cycler | Thermofisher Scientific | A37834 | |
Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) | General Lab Supplier | ||
Mutant Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
PAXgene Blood ccfDNA tubes | PreAnalytiX | 768115 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
PCR 8 well strip tube caps | VWR | 10011-786 | |
PCR 8 well strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | |
Pipette (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
Pipette filter tips (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs Inc | M0494S | |
QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook | Qiagen | cfDNA extraction kit handbook (2013 edition) | |
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) |
QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | Optional kit for DNA extraction from small (< or =200µL) sample volumes |
Qiavac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit |
Raindance Consumable Kit | Bio-Rad | 20-04411 | Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil |
Raindance Sense Instrument | Bio-Rad | Quantification instrument (used in Protocol Step 9) | |
Raindance Source Instrument | Bio-Rad | Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9) | |
RainDrop Analyst II Software | RainDance Technologies | Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10) | |
Refrigerated Vapor Trap | Savant | RVT5105-115 | |
Reverse Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
Smartblock 2mL | Eppendorf | 05 412 506 | |
TaqMan Genotyping Master Mix | Thermofisher Scientific | 4371353 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 14 285 562PM | |
WT Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design |