方法文章

患者生物流体中肿瘤相关循环DNA的检测与监测

10.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/59721

⸱

2019年6月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genetic Medicine, Children's National Health System, 2Institute for Biomedical Sciences, The George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 3Dana-Farber Cancer Institute, 4Department of Neurology, University of California San Francisco, 5DIPG Centre of Expertise Zurich, Universitats-Kinderspital Zurich

本文内容

摘要

本文介绍了一种检测患者生物流体（生物液体）中循环DNA内肿瘤体细胞突变的实验方案。我们基于微滴数字聚合酶链式反应（dPCR）的方法可定量检测肿瘤突变的等位基因频率（MAF），为肿瘤的诊断以及对肿瘤治疗反应的时序性监测提供一种微创的补充手段。

摘要

与初始和重复手术组织取样相关的并发症使得人们迫切需要能够进行分子亚型分类并实现对肿瘤治疗反应进行时间监测的微创平台。本文中，我们描述了一种基于数字PCR（dPCR）的方法，用于检测患者体液中可轻松获取的游离DNA（cfDNA）中的肿瘤体细胞突变。 尽管该方法每次检测所能分析的突变数量有限，但其具有高度的灵敏性和特异性。通过突变等位基因频率（MAF）计算得出的突变丰度监测，可用于评估肿瘤对治疗的反应，从而为影像学检查提供重要的补充手段。

引言

由于 可用性方面的局限性 用于分子分析的肿瘤组织，迫切需要开发出高灵敏度的方法，以检测患者生物液体（包括血浆、血清和脑脊液[CSF]）中的肿瘤体细胞突变。例如，由于神经解剖学位置特殊，儿童弥漫性中线胶质瘤（DMGs）的诊断面临挑战。在过去十年中，对DMG组织样本的分子谱分析已揭示了该肿瘤类型中的驱动突变。1 并揭示了突变在空间和时间上的异质性，使得活检成为在疾病亚组内对患者进行特征表征的必要手段，并推动了分子靶向治疗的发展2因此，临床试验建议在初次诊断时整合手术活检以进行肿瘤分子谱分析3,4,5,6. 在期间 治疗，监测 弥漫性中线胶质瘤的治疗反应评估目前仅依赖于磁共振成像（MRI），而该技术在检测微小变化或肿瘤基因组演化方面敏感性不足。此外，MRI容易检出假性进展，即肿瘤部位出现的短暂性炎症，其影像学表现与真实进展相似，可能导致对肿瘤治疗反应的误判。7因此，弥漫性中线胶质瘤（DMGs）代表了一类亟需通过替代性、微创手段来检测肿瘤突变并监测临床反应的肿瘤类型。为满足这一需求，我们开发并优化了一种检测和定量中线胶质瘤患儿血浆、血清及脑脊液（CSF）中游离DNA（cfDNA）肿瘤突变等位基因频率的实验方案。8. 鉴于儿童DMG常（>80%）的病例在组蛋白变体 H3.1（H3.1K27M，占20%）或 H3.3（H3.3K27M，占60%）的第27位赖氨酸上存在体细胞赖氨酸至甲硫氨酸的突变1，这些以及其他DMG特征性突变（即 ACVR1, PIK3R1) 采用cfDNA对突变等位基因进行定量分析8该检测方法可通过使用序列特异性引物和探针，针对其他肿瘤类型中的热点突变进行定制化检测。这一方法具有高度通用性，适用于多种癌症，有助于将基于循环游离DNA（cfDNA）的诊断工具与治疗监测相结合。

为了灵敏地检测cfDNA中低等位基因频率的突变，我们采用基于微滴数字PCR（dPCR）的方法。在该方法中，PCR反应体系通过dPCR平台（例如RainDance）被分割成理论上最多达1000万个微滴，实验中通常每个PCR孔可生成700万至900万个微滴。由于高度分割 样品分液后，每个液滴中最多只含有一个至两个DNA分子。每个液滴中可发生PCR扩增及序列特异性荧光探针杂交，从而实现数百万个独立反应。该方法最大限度地提高了检测灵敏度，能够检出在野生型DNA背景中原本难以发现的稀有突变等位基因。采用锁核酸（LNA）探针可增强检测特异性，抑制错配杂交，支持突变位点的准确识别。9,10,11在此，我们介绍了样本处理、cfDNA提取、目标等位基因的预扩增、数字PCR及数据分析的方法。

方案

本研究中所述所有方法均经加州大学旧金山分校机构审查委员会（加利福尼亚州旧金山；IRB #14-13895）和美国国家儿童健康系统（华盛顿特区；IRB #1339）批准。在获得患者或其监护人的知情同意后，采集并研究了标本。

1. 根据机构审查委员会（IRB）方案，对采集和储存生物样本的患者进行知情同意

  1. 在获得每位患者或其监护人签署的书面知情同意书后采集患者样本，同意书内容为参与经各机构审查委员会批准的临床试验或生物样本库项目。
    1. 本研究纳入的患者均通过影像学诊断为脑肿瘤。未设置排除标准。在获得患者或其监护人的知情同意后，采集并研究样本。

2. 血液采集与血浆或血清的分离

  1. 使用采血管采集10.0 mL血液样本。若采集血液用于血浆制备，请使用K2-或K3-EDTA管、肝素管或游离DNA（cfDNA）采血管；若采集血液用于血清制备，请使用含有凝血活化剂和凝胶分离层的凝胶分离管。
    注意：建议采集10 mL血液以支持重复实验，但最低不少于3 mL即可满足需求。
  2. 轻柔地将采血管上下翻转10次，使血液样本与采血管内的试剂充分混匀。
  3. 将用于血清分离的血液样本在室温下静置30分钟，以促进血液凝固。若采集血液用于血浆制备，则立即进入步骤2.4。
    注意：用于血浆制备的样本可在冰上保存最多2小时，直至离心；但应尽快从采血过渡到处理，以最大限度减少游离DNA（cfDNA）的降解。
  4. 将采血管在4 °C条件下以2,000 x g 离心15分钟，以分离血浆或血清与白细胞、红细胞层。
  5. 小心操作，避免扰动白细胞层（该层位于上层血浆/血清与下层压积红细胞之间，呈薄线状），用移液器将上层血浆/血清（可能为无色、黄色或粉红色）等量分装至无菌聚丙烯螺口冻存管中，每管1 mL。
  6. 在冻存管标签上记录受试者编号、样本类型（血浆或血清）及采集日期。
  7. 将冻存管储存于-80 °C超低温冰箱中备用。若无 -80 °C冰箱，样本可在-20 °C保存最多一周。

3. 脑脊液采集与处理

  1. 从分流管、腰椎穿刺或手术中采集脑脊液（CSF）。
    注意：此类操作仅应在临床医生认为必要时进行。超出临床使用所需的额外样本可用于科研目的。
  2. 测量所采集脑脊液的体积，并记录其颜色（血性、黄色、清亮）。
  3. 在 4 °C 条件下，以 10,000 x g 离心 10 分钟，使细胞碎片沉淀。
  4. 将脑脊液上清液等量分装至聚丙烯螺口冻存管中，每管 500 µL。
  5. 在冻存管标签上记录受试者编号、标本类型及标本采集日期。保存于 -80 °C 直至使用。

4. 从液体样本中提取cfDNA

  1. 按照cfDNA提取试剂盒手册中的说明进行cfDNA提取操作12。
    1. 使用10%次氯酸钠和70%乙醇清洁实验台面和设备。
      注意：在整个操作过程中，使用PCR超净工作台、频繁更换手套，并定期使用10%次氯酸钠和70%乙醇对实验台面及设备进行去污染处理，对于防止样本污染至关重要。
    2. 从提取试剂盒中分装试剂（例如洗涤缓冲液），以避免交叉污染。
  2. 在开始提取前，将患者样本置于冰上解冻。对于血浆/血清样本，解冻1 mL分装样本；对于脑脊液（CSF）样本，解冻500 µL分装样本。
    注意：提取流程中的裂解步骤（4.5–4.8）在血浆/血清与脑脊液之间有所不同，但从步骤4.9开始，两种生物液体的后续操作完全相同。
  3. 将加热块预热至60 °C，用于裂解步骤（4.6）。
  4. 在15 mL离心管中配制裂解缓冲液与载体RNA的混合液，每份样本加入5.6 µL载体RNA和0.9 mL裂解缓冲液12。
  5. 对于血浆/血清样本，向已标记的2.0 mL离心管中加入100 µL蛋白酶K、1 mL样本以及步骤4.4中配制的0.8 mL裂解缓冲液/载体RNA混合液。在高速下脉冲涡旋振荡30秒以混匀12。
    1. 对于脑脊液样本，向2.0 mL离心管中加入125 µL蛋白酶K、500 µL样本、1 mL裂解缓冲液/载体RNA混合液以及250 µL组织裂解缓冲液。再加入125 µL 1×磷酸盐缓冲液（PBS），使总体积达到2 mL。在高速下脉冲涡旋振荡30秒以混匀12。
  6. 将样本在加热块中于60 °C孵育30分钟12。
  7. 从加热块中取出样本，将加热块温度调低至56 °C。将样本放回实验台，并将裂解液转移至新的已标记15 mL离心管中。
  8. 对于血浆/血清样本，向裂解液中加入1.8 mL核酸结合缓冲液，并脉冲涡旋振荡30秒以混匀12。
    1. 对于脑脊液样本，加入3.6 mL核酸结合缓冲液，并脉冲涡旋振荡30秒以混匀12。
  9. 将样本置于冰上孵育5分钟12。
  10. 将离心柱插入真空连接器中。打开离心柱盖子，并将一个20 mL延长管插入离心柱中12。
  11. 用移液器将15 mL离心管中的全部内容物直接加入延长管底部，避免液体残留在延长管管壁上。
  12. 关闭真空连接器的开关，启动真空泵。待压力升至900 mbar后，打开真空连接器的阀门，使样本溶液通过离心柱。
  13. 当所有裂解液完全流尽后，关闭真空泵并打开真空连接器的排气门以释放压力。待压力降至0 mbar后，关闭真空连接器的阀门和排气门。
  14. 小心移除20 mL延长管，注意不要将一个离心柱的延长管移至邻近离心柱上方，以免造成样本交叉污染。随后丢弃延长管。
  15. 向离心柱中加入600 µL第一洗涤缓冲液12。
  16. 保持收集管管盖打开，启动真空泵。待压力表读数达到900 mbar后，将真空连接器的开关转至“打开”位置，使洗涤缓冲液通过离心柱。
  17. 关闭真空泵，打开排气门释放压力，使压力降至0 mbar。将真空连接器的阀门转至“关闭”位置。
  18. 向离心柱中加入750 µL第二洗涤缓冲液，并重复步骤4.16–4.1712。
  19. 向离心柱中加入750 µL分子生物学级乙醇（MB grade ethanol），并重复步骤4.16–4.1712。
  20. 关闭离心柱盖子，将其放入一个新的2.0 mL收集管中。丢弃真空连接器12。
  21. 将装有离心柱的收集管在室温下以20,000 x g离心3分钟12。
  22. 将离心柱转移至一个新的收集管中并打开管盖。在柱子上方覆盖一张实验室吸水纸，于56 °C孵育10分钟12。
  23. 将离心柱放入洁净的1.5 mL无DNase/RNase PCR级离心管中，向柱子中心直接加入100 µL洗脱缓冲液（或分子生物学级H2O（MB H2O））。切勿用移液器枪头接触柱子表面。盖上管盖，在室温下静置3分钟。
  24. 在室温下以20,000 x g离心1分钟，以洗脱cfDNA12。
  25. 将洗脱液重新移回离心柱中，在室温下孵育3分钟。
  26. 再次以最大转速离心1分钟，进行第二次洗脱，以提高cfDNA得率（按制造商建议）。
  27. 将提取的cfDNA储存于已标记的无DNase/RNase PCR级离心管中，置于4 °C保存，或直接进入下一步（步骤5）。

5. cfDNA 的真空浓缩

  1. 将含有洗脱cfDNA的离心管插入真空浓缩仪的管架中并保持平衡。打开管盖。将真空浓缩仪的温度设置为23 °C。
  2. 开启真空浓缩仪，然后打开冷凝捕集装置。离心样品40分钟，或直至终体积达到10.5–11 µL。
    1. 如果体积低于10.5 µL，加入DNA悬浮缓冲液或MB H2O，使终体积达到10.5 µL。
  3. 用移液器将全部液体沿管壁吹打，以回收残留的DNA片段。
  4. 将样品在台式离心机上短暂离心，使管壁上的液滴沉至管底。
  5. 直接进入预扩增步骤（步骤8），或将样品在4 °C保存。
    1. 若样品需保存以备后续使用，应用实验室封口膜包裹管盖，防止污染。

6. 引物和探针的设计与制备

  1. 针对目标序列设计上下游引物以及野生型和突变型LNA探针，并向商业公司订购冻干的引物和探针（参见材料表）。
    注意：针对儿童中线胶质瘤中H3F3A p.K27M及其他目标突变的引物和探针序列，可参见Panditharatna等（2018）的补充表38。
  2. 在打开冻干引物和探针前，先短暂离心管体。根据产品说明书标注的体积，加入适量的DNA悬浮缓冲液或分子生物学级H2O，将冻干的引物和探针重悬至100 µM的浓度。
  3. 轻轻涡旋混合，或用移液器吹打数次以充分混匀，随后使用台式离心机短暂离心引物和探针。
  4. 通过将10 µL的100 µM原液加入90 µL的DNA悬浮缓冲液或分子生物学级H2O中，配制10 µM的引物和探针分装液。
  5. 通过将10 µL的10 µM引物溶液加入90 µL的DNA悬浮缓冲液或分子生物学级H2O中，配制用于预扩增的1 µM正向和反向引物分装液。
  6. 将引物和探针储存于密封避光的容器中，4 °C保存。在瓶盖处包裹实验室封口膜以防止污染，并用铝箔包裹探针以避免光照。若探针不经常使用，应于-20°C长期保存。

7. 阳性对照的选择

  1. 选择含有已知等位基因频率的目标突变、且DNA浓度已知的肿瘤组织基因组DNA（gDNA）样本作为阳性对照。
    1. 在预扩增步骤（步骤8）中使用0.025 ng的阳性对照肿瘤组织DNA。
      注：该DNA投入量可在数字PCR（dPCR）中产生强阳性信号（通过含H3F3A p.K27M突变的肿瘤组织gDNA系列稀释实验确定8），同时最小化样本用量。

8. 目标等位基因的预扩增

注意：预扩增方案参照 Jackson 等，201613。

  1. 使用10%次氯酸钠和70%乙醇清洁实验台面及设备。
  2. 准备1 µM的正向引物和反向引物、cfDNA样本、gDNA阳性对照以及DNA聚合酶预混液，并置于冰上。
  3. 根据所需扩增的cfDNA样本数量和阳性对照，计算单重或多重预扩增所需的试剂体积，方法如下：
    1. 对于单重预扩增（用于对一个目标突变的野生型和突变型等位基因进行预扩增），每份样本加入17.5 µL DNA聚合酶预混液和各3.5 µL的正向与反向引物（终浓度100 nM），配制PCR反应体系13。
    2. 对于多重预扩增（用于对两个目标突变的两组野生型和突变型等位基因进行预扩增），每份样本加入17.5 µL DNA聚合酶预混液和每组正向与反向引物各1.75 µL（终浓度50 nM）13。
      注意：配制PCR反应体系时，应多准备10%的额外体积，以弥补可能的移液误差。
  4. 将24.5 µL PCR反应体系分装至8联排PCR管的每个孔中13。
  5. 向相应孔中加入10.5 µL DNA样本，使总反应体积达到35 µL13。轻轻吹打混合液10次，确保充分混匀。
  6. 进行PCR扩增：98 °C预变性3 min；进行9个循环，每个循环包括98 °C变性10 s、退火温度退火3 min、72 °C延伸30 s；最后72 °C延伸2 min13。
  7. 将预扩增产物全部转移至已标记的无DNase/RNase PCR洁净管中，并加入140 µL TE DNA悬浮缓冲液（pH 8.0）稀释13。
  8. 用实验室封口膜包裹管盖。预扩增产物可短期保存于4 °C；如需长期保存，应置于-20 °C。

9. 使用数字PCR检测和定量目标DNA

  1. 使用10%次氯酸钠和70%乙醇清洁实验台面和设备。
  2. 将10 µM引物和探针、基因分型预混液以及DNA样本置于冰上。将液滴稳定油在室温下保存。
  3. 除液滴稳定油外，其余试剂均需轻轻涡旋混匀并短暂离心。
  4. 确保连接至液滴生成仪和定量仪（材料表）的压缩氮气瓶压力设定为90 psi。
  5. 打开液滴生成仪及其配套计算机上的仪器软件。启动软件并点击“开始初始化”。
    1. 若液滴生成仪已超过一周未使用，请先执行高压冲洗程序。
  6. 配制可满足8个PCR八联管孔及额外10%用量的dPCR反应体系，加入220 µL基因分型预混液、各8.8 µL的10 µM野生型和突变型探针、各39.6 µL的10 µM正向与反向引物，以及17.6 µL液滴稳定油14。
  7. 通过移液器将dPCR反应体系上下吹打10–20次以充分混匀。加入液滴稳定油后，禁止涡旋或离心。
  8. 取一条新的PCR八联管，将38 µL dPCR反应体系直接加入每个孔的底部14。使用洁净的枪头去除气泡。
    注意：相互锁扣或紧密包装的PCR八联管可能产生静电，导致dPCR数据分析时出现液滴融合和信号噪声。为避免此问题，应将八联管分装至独立的生物危害袋中，避免袋子过度填充，并防止管子之间相互摩擦。
  9. 向PCR八联管的相应孔中加入12 µL预扩增的DNA样本。阴性对照孔中加入12 µL分子生物学级H2O。
    注意：cfDNA样本应设置重复孔。脑脊液（CSF）样本至少进行双复孔检测，血浆/血清样本则需每样本进行三复孔检测。
  10. 将反应体系与DNA样本用移液器上下吹打10次，充分混匀。
  11. 取一个新的液滴生成仪芯片，将PCR八联管第1–8孔中的全部液体转移至芯片对应的A–H通道中。移液时避免枪头接触通道底部。
  12. 取一条新的洁净PCR八联管插入液滴生成仪中。在仪器计算机的软件中扫描或手动输入液滴生成仪芯片编号，并为每个通道命名。点击开始运行以启动液滴生成。
  13. 液滴生成完成后，取出PCR八联管并盖上封口盖。
  14. 将八联管转移至PCR仪中，并用另一条每孔含80 µL水的八联管进行平衡。
  15. 设定PCR扩增程序14如下：95 °C 预变性10分钟；45个循环（两步法）：95 °C 变性30秒，退火温度延伸2分钟；98 °C 延伸10分钟；最后于10 °C 保存。
    1. 设定升降温速率为0.5 °C/s，样本体积设为80 µL14。
  16. PCR扩增完成后，取出八联管并转移至定量仪。移除PCR八联管盖，更换为高速专用盖。
  17. 打开定量仪及其连接的计算机上的仪器软件。启动软件并点击设置运行。
  18. 将八联管放入定量仪中。
  19. 取一个新的定量仪芯片，在仪器中扫描或手动输入芯片编号，并将芯片插入仪器。
  20. 将金属屏蔽盖置于芯片上方，并关闭仪器盖。
  21. 在计算机软件中，为本次dPCR运行及每个通道（A–H）命名。选择快速模式（必须与高速盖配合使用），然后点击开始以启动定量分析。
  22. 定量完成后，取下金属屏蔽盖（保留以供重复使用），并丢弃PCR八联管和芯片。在仪器计算机上，运行日志中将包含每次运行的结果文件。使用每个样本的.fcs文件在分析软件中进行数据分析。

10. 数据分析

  1. 启动分析软件并打开 .fcs 文件以分析原始光谱数据。在“分析视图”下选择 Intact。在“样本视图”下，点击8个样本旁的复选框，使每个框中均出现勾选标记。软件将分别沿x轴和y轴绘制突变型（FAM）和野生型（HEX）等位基因的信号。
  2. 根据制造商说明15，使用计算矩阵功能对完整液滴进行光谱补偿。
  3. 在“轴选项”下调整坐标轴设置。将x轴设为最小值0、最大值30,000，y轴设为最小值-5,000、最大值10,000。当液滴簇已被识别后，可调整坐标轴以减少图表中的空白区域。
    注意：突变型和野生型簇的位置取决于所用探针、荧光染料及其浓度。
  4. 选择对应于阳性对照肿瘤组织gDNA的样本，设定阴性（最靠近原点的簇）、突变型（最靠近x轴的簇）和野生型（最靠近y轴的簇）门控区域。确保在成功实验中各簇清晰可辨且易于识别。
  5. 通过右键点击阳性对照样本，然后选择将所有设置应用于所选样本，将该阳性对照的门控设置应用至所有样本。
  6. 在图形视图下，点击多个样本标签，查看所有选定样本的图谱。将图像导出为 .TIF 文件。
  7. 在屏幕左上角的工作区标签下，选择导出分析结果（csv），并将分析后的数据文件保存为 .csv 格式。
  8. 在电子表格软件中打开 .csv 文件，查看每个样本的阴性、野生型和突变型液滴计数。通过将泊松校正后的突变型液滴数除以该样本泊松校正后的突变型与野生型液滴数之和，计算突变等位基因频率（MAF）。
    注意：应使用泊松校正计数，因为泊松统计学考虑了阳性液滴可能包含多个目标DNA拷贝这一事实 ，因此直接累加阳性液滴数可能无法得到准确的计数值16。

结果

图1 显示了两名患有弥漫性中线胶质瘤（DMG）儿童的预扩增血浆（左上图）和脑脊液（CSF，右上图）游离DNA（cfDNA）中成功检测到 H3F3A p.K27M 突变的代表性结果。cfDNA样本进行了重复分析，但每种样本类型仅展示一个代表性图谱。数字PCR（dPCR）图谱显示成功生成了液滴，每个PCR孔中产生7-9百万个液滴（其中大多数为不含目标DNA的阴性液滴）。每个PCR孔中至少生成7百万个液滴表明液滴化成功；若少于7百万，则表明实验失败，此时不应继续进行数据分析。图1 显示突变型与野生型簇在x轴和y轴方向上均有清晰分离。显著的野生型簇表明cfDNA提取成功，因为模板DNA存在。突变型簇在血浆和CSF样本中的突变等位基因频率（MAF）分别为1.60%和39.92%，证明该突变被成功检出。对于这些患者，dPCR结果与通过肿瘤组织活检样本基因组分析确认的肿瘤突变状态一致8。阴性对照（左下图）显示突变型和野生型液滴均为0，表明PCR反应体系未受污染。阳性对照肿瘤组织基因组DNA（gDNA，右下图）显示在所选特定肿瘤样本的预期等位基因频率下检测到该突变。

在图2中，展示了在一名DMG患儿的血浆游离DNA（cfDNA）中未能检测到目标突变H3F3A p.K27M的代表性结果。突变状态已通过肿瘤组织的基因组分析确认8。图中显示了两个重复PCR孔的代表性结果（上图）。每个PCR孔的总液滴数（包括阴性液滴）在700万至900万之间，表明液滴生成成功。血浆cfDNA样本中，沿y轴分布的野生型簇在每个PCR孔中约有7,000至8,000个野生型液滴，表明cfDNA提取成功（说明样本中存在目标野生型DNA）。然而，在血浆样本中未检测到任何突变型液滴。左下图显示阴性对照（MB H2O），无野生型或突变型液滴；右下图显示阳性对照——预先扩增的肿瘤组织基因组DNA（gDNA，0.025 ng），可检测到阳性突变。如本图所示，在血浆中未能检测到突变并不一定意味着患者对该目标突变位点为野生型，因为确实可能出现假阴性结果8。在某些情况下，若在初次活检时采集的血浆中未能检出突变，则可能在同一名患者后续时间点采集的血浆中检测到该突变8。

显示预扩增样本和对照样本中突变等位基因频率（MAF）的流式细胞术散点图。
图1：在中线胶质瘤患儿的预扩增血浆和脑脊液游离DNA中成功检测到H3F3A p.K27M突变。 请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术散点图比较扩增前血浆和肿瘤DNA，显示突变等位基因频率。
图2：对已知在肿瘤中携带目标突变H3F3A p.K27M的患者血浆游离DNA（cfDNA）样本进行扩增前分析时获得的假阴性结果。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在此，我们介绍了检测和定量血浆游离DNA中肿瘤突变等位基因频率的方法 患者液体活检。我们强调了该方法成功的关键步骤，包括分析前样本处理、cfDNA 提取、PCR 检测设计和数据分析。为了限制样本用量，从 1 mL 血浆中提取 cfDNA，而仅从 500 µL 脑脊液（CSF）中提取。当从 CSF 中提取时，采用与 1 mL 尿液相同的提取方案（参照 cfDNA 提取试剂盒说明书）12) 按照制造商的推荐使用。血浆与脑脊液（CSF）所需样本体积的差异，是由于脑肿瘤患者血浆中肿瘤特异性游离DNA（cfDNA）的水平低于脑脊液，因此需要更大的样本量以实现突变检测。8如果样本量充足，可使用超过1 mL的血浆以获得更高的DNA得率。然而，对于儿科患者，应尽可能减少采血量，因为对于正在接受放疗的癌症患儿而言，即使是抽血这样的简单操作也可能造成疲劳。使用1 mL血浆进行提取还可实现重复提取，以便在DNA提取失败或样本污染等情况下重复实验。

为了尽量减少任何非必需的样本使用，通常不对cfDNA进行定量。然而，我们发现血浆和脑脊液（CSF）中的cfDNA浓度范围分别为0.2–2 ng/µL和0.6–13 ng/µL。鉴于cfDNA含量较低，且肿瘤特异性突变等位基因的频率较低，必须使用与数字PCR（dPCR）相同的引物组对样本进行预扩增，以显著增加目标DNA的量，从而有助于突变检测8。将预扩增产物稀释于DNA悬浮缓冲液中，可提供足够的体积用于技术重复，有助于区分真实阳性信号。由于突变液滴的数量可能很低（例如，在血浆样本中可能仅有0–2个突变液滴），设置技术重复对于准确判断突变状态至关重要。同一份血浆样本在三个重复孔中分析时，可能一个PCR孔中检测到0个突变液滴，而另外两个孔中各检测到1–2个；因此，设置重复可提高判断突变状态的准确性。突变等位基因频率（MAF）随后通过重复孔结果的平均值计算得出。

多重预扩增（同时预扩增两种目标突变的野生型和突变等位基因）可提高单个样本的利用率，因为可以使用相同的起始材料检测两种突变。重要的是，如本文所述，多重预扩增产物可在数字PCR（dPCR）中以单重方式分析，从而简化操作流程。然而，预扩增PCR和dPCR均可实现多重化。在进行多重检测时，必须对两组引物和探针的反应条件进行优化：引物的退火温度应相近，以便在PCR扩增中共同运行；探针则应设计为产生可区分的信号簇（基于荧光信号种类和强度）。在验证一组新的引物和探针时，应运行退火温度梯度实验，以确定最佳退火温度，该温度范围可参考试剂制造商的建议。在将探针用于患者循环游离DNA（cfDNA）样本检测之前，应先使用合成DNA构建体和/或不同输入量（例如，最高达10 ng）的肿瘤组织基因组DNA（gDNA）进行验证。

为了更特异地检测突变等位基因，并减少探针与靶DNA杂交过程中的错配，可使用锁核酸（locked nucleic acid, LNA）探针。LNA 是一种核苷酸类似物，其核糖环的2'-氧原子与4'-碳原子之间通过一个亚甲基桥相连9。该亚甲基桥将核酸锁定在刚性的双环构象中，从而限制其柔性，提高双链的热稳定性，并增强探针与靶DNA杂交的特异性10,18,19。若LNA探针与模板DNA之间存在单个碱基错配，则探针与靶标之间的双链形成将变得不稳定。因此，LNA探针可提高探针结合的特异性，获得更高的信噪比11。通过对非中枢神经系统疾病患儿的血浆和脑脊液样本进行分析，已验证本检测方法使用靶向H3F3A p.K27M的LNA探针具有高度特异性，确定等位基因频率小于或等于0.001%时视为假阳性结果8。关于探针和引物设计的其他优化考虑因素，包括GC含量、扩增子大小、探针报告荧光染料和淬灭基团等，请参考数字PCR仪器制造商的指导说明14,17。尽管本方法已针对RainDance系统进行了优化，但该方案也可调整后用于其他数字PCR平台。

本文所述方法得益于数字PCR（dPCR）所实现的高灵敏度和靶向富集能力，dPCR目前仍是检测循环游离DNA（cfDNA）中稀有肿瘤突变的首选平台。尽管功能强大，dPCR在单次检测中可分析的突变数量有限。下一代测序技术（NGS）是dPCR的一种替代方案，能够同时检测多个基因中的多种突变，从而提高单个样本的利用价值。NGS已成功用于检测脑干胶质瘤患者脑脊液（CSF）和血浆中的突变20，但在cfDNA中检测肿瘤突变的灵敏度目前仍低于dPCR，其检测限为0.1%-10%的突变等位基因频率（MAF），而基于PCR的方法可达0.001%21。此外，dPCR比NGS具有更短的检测周期，可快速识别目标突变。该PCR方法适用于多种癌症类型，并可扩展用于检测热点突变及甲基化cfDNA22。

液体活检技术确实尚处于起步阶段，仍需进一步发展以针对特定疾病进行优化。在肿瘤演进背景下进行肿瘤监测将是下一个挑战，这需要具备高灵敏度检测新出现突变的能力的平台。此外，能够检测多种生物分子（如肽段、细胞因子、RNA）的平台将在评估肿瘤对治疗的反应以及推动个体化临床干预方面具有重要价值。

披露

本文所述方法包含在 Javad Nazarian 与 Eshini Panditharatna 申请的国际专利“用于检测癌症生物标志物的方法”中。

致谢

作者谨此感谢所有患者及其家属的慷慨支持。本研究得到了以下机构的资助：Smashing Walnuts 基金会（美国弗吉尼亚州米德尔堡）、V 基金会（美国佐治亚州亚特兰大）、Gabriella Miller Kids First 数据资源中心、儿童国家医院临床与转化科学研究所（5UL1TR001876-03）、Musella 基金会（美国纽约州休利特）、Matthew Larson 基金会（美国新泽西州富兰克林湖）、Lilabean 儿童脑癌研究基金会（美国马里兰州银泉市）、儿童脑瘤基金会（美国马里兰州杰曼敦）、儿童脑瘤组织联盟（美国宾夕法尼亚州费城）以及 Rally 儿童癌症研究基金会（美国佐治亚州亚特兰大）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA 悬浮缓冲液 (pH 8.0)TeknovaT0227
BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg 血液采集管 (10 mL)Becton Dickinson Diagnostics367525用于血浆采集
BD Vacutainer 塑料血清管，带红色 BD Hemogard 封盖 (10 mL)Becton Dickinson Diagnostics367895用于血清采集
漂白剂通用实验室供应商
Buffer ATLQiagen19076
无细胞 DNA 血液采集管Streck218961cfDNA 血液采集管（可选）
CentriVap 浓缩仪Labconco7810010
正向引物Integrated DNA Technologies, Inc.定制设计
MiniAmp 热循环仪Thermofisher ScientificA37834
分子生物学级无水乙醇 (200 proof)通用实验室供应商
突变探针Integrated DNA Technologies, Inc.定制设计
PAXgene 血液 ccfDNA 采集管PreAnalytiX768115cfDNA 血液采集管（可选）
PCR 8 孔条状管盖VWR10011-786
PCR 8 孔条状管AxygenPCR-0208-C
移液器 (p20, p200, p1000)通用实验室供应商
带滤芯移液器吸头 (p20, p200, p1000)通用实验室供应商
Q5 Hot Start 高保真 2x 预混液New England Biolabs IncM0494S
QIAamp Circulating Nucleic Acid 手册 QiagencfDNA 提取试剂盒手册（2013 年版）
QIAamp Circulating Nucleic Acid 试剂盒Qiagen55114cfDNA 提取试剂盒（方案步骤 4） 
QIAamp MinElute 病毒旋转柱试剂盒Qiagen57704适用于小体积（< 或 =200 µL）样本的 DNA 提取可选试剂盒
Qiavac 24 PlusQiagen19413与 QIAamp Circulating Nucleic Acids 试剂盒配合使用
Raindance 耗材试剂盒Bio-Rad20-04411包含液滴生成仪芯片、定量仪芯片、PCR 条管盖（含高速盖）以及液滴稳定油
Raindance Sense 仪器Bio-Rad定量仪器（用于方案步骤 9）
Raindance Source 仪器Bio-Rad液滴生成仪器（用于方案步骤 9）
RainDrop Analyst II 软件RainDance Technologies用于数据分析的 Analyst 软件（方案步骤 10）
制冷式蒸气捕集器SavantRVT5105-115
反向引物Integrated DNA Technologies, Inc.定制设计
Smartblock 2 mLEppendorf05 412 506
TaqMan 基因分型预混液Thermofisher Scientific4371353
Thermomixer CEppendorf14 285 562PM
野生型探针Integrated DNA Technologies, Inc.定制设计

参考文献

  1. Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32, 520-537 (2017).
  2. Hoffman, L. M., et al. Spatial genomic heterogeneity in diffuse intrinsic pontine and midline high-grade glioma: implications for diagnostic biopsy and targeted therapeutics. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), (2016).
  3. Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas. Child's Nervous System. 31 (10), 1773-1780 (2015).
  4. Leary, S., et al. Year one in the molecular era of pediatric brain tumor diagnosis: application of universal clinical targeted sequencing in an unselected cohort of children. Neuro-Oncology. 19 (4), iv21(2017).
  5. Mueller, S., et al. DIPG-40. PNOC003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma. Neuro-Oncology. 19 (4), iv14(2017).
  6. Kilburn, L., et al. DIPG-76. PNOC-003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary experience with multi-agent personalized therapy recommendations. Neuro-Oncology. 20 (2), i64(2018).
  7. Aquino, D., Gioppo, A., Finocchiaro, G., Bruzzone, M. G., Cuccarini, V. MRI in glioma immunotherapy: evidence, pitfalls, and perspectives. Journal of Immunology Research. 2017, 5813951(2017).
  8. Panditharatna, E., et al. Clinically relevant and minimally invasive tumor surveillance of pediatric diffuse midline gliomas using patient-derived liquid biopsy. Clinical Cancer Research. , (2018).
  9. Singh, S. K., Koshkin, A. A., Wengel, J., Nielsen, P. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. 29 (4), 455-456 (1998).
  10. Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50 (43), 9352-9367 (2011).
  11. Priya, N. G., Pandey, N., Rajagopal, R. LNA probes substantially improve the detection of bacterial endosymbionts in whole mount of insects by fluorescent in-situ hybridization. BMC Microbiology. 12, 81(2012).
  12. Qiagen. QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook. , 1090257(2013).
  13. Jackson, J. B., et al. Multiplex preamplification of serum DNA to facilitate reliable detection of extremely rare cancer mutations in circulating DNA by digital PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 235-243 (2016).
  14. Rain Dance Technologies. RainDrop Assay Guidelines. , LCN 50-04334 Rev. D (2016).
  15. Rain Dance Technologies. RainDrop Analyst II Operator's Manual. , LCN 50-08157, Rev. A (2015).
  16. Majumdar, N., Banerjee, S., Pallas, M., Wessel, T., Hegerich, P. Poisson Plus quantification for digital PCR system. Scientific Reports. 7, 9617(2017).
  17. Biorad. Droplet Digital PCR Applications Guide. , Life Science Group. Bulletin 6407 Rev. A. 13-0579 0214 Sig 1213 (2018).
  18. Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Moller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Review of Molecular Diagnostics. 3 (1), 27-38 (2013).
  19. Ugozzoli, L. A., Latorra, D., Puckett, R., Arar, K., Hamby, K. Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids. Analytical Biochemistry. 324 (1), 143-152 (2004).
  20. Pan, C., et al. Molecular profiling of tumors of the brainstem by sequencing of CSF-derived circulating tumor DNA. Acta Neuropathologica. , (2018).
  21. Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. , (2018).
  22. Barault, L., et al. Discovery of methylated circulating DNA biomarkers for comprehensive non-invasive monitoring of treatment response in metastatic colorectal cancer. Gut. 67 (11), 1995-2005 (2018).

重印与许可

标签

无细胞DNA数字PCR突变检测肿瘤基因分型体液分析等位基因频率光谱补偿液滴定量纵向监测
患者生物流体中肿瘤相关循环DNA的检测与监测
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。