Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

توليف معيار مبتور للكم من 2-Arashidonoylglycerol في Caenorhabditis elegans

Published: September 21, 2019 doi: 10.3791/59882
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1,3
1Instituto de Química Rosario (IQUIR-CONICET), Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 2Laboratorio de Fisiología Microbiana, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 3Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario

Summary

يصف هذا العمل طريقة قوية ومباشرة للكشف عن وقياس الإندوكانابينويد 2-أرشيدونويلغليسيرول (2-AG) في C. elegans. معيار تحليلي مُعدّ نُستخدم للتكّنّال من 2-AG بواسطة التخفيف النظائري والقياس اللوني السائل - الرذاذ الكهربائي -قياس الطيف الكتلي الترادف (LC-ESI-MS/MS).

Abstract

يقدم هذا العمل طريقة لإعداد معيار تحليلي لتحليل 2-arashidonoyl الجلسرين (2-AG) نوعيا وكميا عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة-الكهربائي التأين-جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC-ESI-MS/MS). يتم حفظ Endocannabinoids وسطاء الدهون التي تنظم العمليات البيولوجية المتعددة في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية. في C. elegans, تم العثور على 2-AG لامتلاك أدوار مختلفة, بما في ذلك تعديل تشكيل دور والتمثيل الغذائي الكولسترول. يصف هذا التقرير طريقة للتغلب على الصعوبات المرتبطة بتكاليف واستقرار المعايير المبتورة المطلوبة للقياس الكمي 2-AG. إجراء توليف المعيار بسيط ويمكن القيام به في أي مختبر، دون الحاجة إلى الخبرة التوليفية العضوية أو المعدات الخاصة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف تعديل طريقة فولتش لاستخراج المعيار المبتور من ثقافة C. elegans. وأخيرا، يتم وصف طريقة كمية وتحليلية للكشف عن 2-AG باستخدام مستقرة isotopically المسمى التناظرية 1-AG-D5، والذي يوفر نتائج موثوق بها في تشغيل الكروماتوغرافية السريعة. هذا الإجراء مفيد لدراسة الأدوار المتعددة من 2-AG في C. elegans في حين يجري أيضا تنطبق على دراسات أخرى من الأيض في الكائنات الحية المختلفة.

Introduction

Endocannabinoids تنظيم العمليات البيولوجية المتعددة في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية ويتم حفظها وسطاء الدهون1. أول الإندوكانابينويدات المكتشفة والأكثر تميزا هي أنانداميد (أرشيدونويلإيثانولاميد، AEA) و 2-أرشيدونويل الجلسرين (2-AG). Endocannabinoids تلعب العديد من الأدوار الحاسمة, بما في ذلك تلك المشاركة في نظم مكافأة الدماغ، فضلا عن إدمان المخدرات, الذاكرة, المزاج, والعمليات الأيضية2. يتم تصنيع AEA و 2-AG فقط عند الحاجة ولها فترات حياة قصيرة، ويتم تدهورها من خلال نقل البروتين التناول والتحلل المائي3.

أصبح استخدام النماذج الحيوانية مثل Caenorhabditis elegans (C. elegans)مهملدراسة مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات البيولوجية بما في ذلك المبرمج، إشارات الخلايا، دورة الخلية، قطبية الخلايا، تنظيم الجينات، التمثيل الغذائي، الشيخوخة، وتحديد الجنس4،5. بالإضافة إلى ذلك، C. elegans هو نموذج ممتاز لدراسة الأدوار الفسيولوجية للأحماض الدهنية غير المشبعة (PUFAs). وقد تم تحديد AEA في C. elegans ويتم تخفيض تحت القيود الغذائية6. هذا النقص يمتد عمر الديدان الخيطية من خلال آلية تقييد الغذائية التي يمكن قمعها عن طريق مكملات مع endocannabinoid. في الآونة الأخيرة، تم اكتشاف أن 2-AG وAEA تلعب أدوارا أساسية في تنظيم الاتجار الكولسترول في C. elegans7. والأهم من ذلك، تم تحديد أن المكملات الغذائية مع الخارجية 2-AG يمكن إنقاذ dauer اعتقال، والذي يسببه ضعف الكولسترول الاتجار في نيمان بيك نوع C1 C. elegans المسوخ.

للحصول على فهم أفضل لعلاقة 2-AG مع الاتجار بالكولسترول والعمليات البيولوجية الأخرى في الديدان الخيطية (أي الإشارات أحادية الأمينية، nociception والحركة)، فمن الأهمية بمكان لدراسة هذا المستقلب الذاتية وكيف هو تتأثر في ظل بعض الظروف البيئية والغذائية8،9،10،11،12،13. لذلك، لا بد من تصميم وتحسين طريقة للكشف عن وتحديد المحلي 2-AG في C. elegans التي هي بسيطة للاستخدام للعلماء من مختلف المجالات، وخاصة أولئك الذين يدرسون سلوك الديدان الخيطية فيما يتعلق بهذا إندوكانابينويد.

في عام 2008، نجح Lethonen وزملاء العمل في تحديد 2-AG وAEA في C. elegans باستخدام LC-MS الأساليب التحليلية14. في عام 2011، تمكنوا من توسيع هذه التقنية إلى endocannabinoids أخرى15. وقد أظهرت الأعمال الحديثة أساليب تحليلية أخرى نجحت في الكشف عن والتحديد الكمي للبطانة في C. elegans، بما في ذلك قياس الطيف الكتلي وGC-MS16،17،18، وقد كما أفيد أنه يمكن توسيع أساليب تحليلية مماثلة إلى نماذج أخرى19.

وعادة ما تنطوي الأساليب التحليلية المبلغ عنها سابقاً المستخدمة في التحديد الكمي 2-AG في العينات البيولوجية على استخدام معايير مقنَّعة يتم الحصول عليها تجارياً وتتطلب توافرها للشراء20و21. العديد من المعايير التحليلية للقياس الكمي LC-MS/MS من endocannabinoids متاحة تجاريا من مقدمي مختلف. ومع ذلك، فهي مكلفة، وحساسة، وتصبح مؤكسدة مع مرور الوقت، وذلك بسبب وجود سندات مزدوجة متعددة. وتستند الإصدارات الأكثر شيوعا من هذه المعايير على حمض الأراكيدوليك ثماني ة deuterated ومناسبة للقياس الكمي عن طريق تخفيف النظائر LC-MS/MS14،22. أيضا، يتم استبدال معظم هذه المعايير في موقف 2 من الجلسرين، مما يجعلها غير مستقرة في ظل معظم الظروف لأنها عرضة للهجرة أسيل19،23.

للتغلب على الصعوبات المرتبطة بتكاليف واستقرار هذه المعايير deuterated، يتم تقديم طريقة مريحة وبسيطة لإعداد معيار تحليلي على أساس الجلسرين د5. تسلسل لإعداد معيار خماسي ة deuterated يتطلب إجراء من ثلاث خطوات التي تؤدي إلى معيار 1-AG-D5, وهو مستقر ولا يخضع للهجرة أسيل (القضية الرئيسية عندما تهدف إلى توليف 2-monoacylglycerols).

الهدف الرئيسي هنا هو إظهار طريقة بسيطة واستنساخ لدراسة 2-AG في C. elegans، بما في ذلك توليف المعايير التحليلية deuterated، وإعداد واستخراج عينات الديدان الخيطية، والتحليل من قبل LC-MS /MS(الشكل 1 ). هذا الإجراء التركيبي يمكن تحقيقه دون المعرفة التوليفية العضوية المتطورة أو المعدات الخاصة، مما يجعلها مناسبة للعلماء من مختلف المجالات الذين يدرسون سلوك C. elegans تحت تأثير endocannabinoid. كما يمكن توسيع هذه الطريقة لتشمل نماذج دراسية أخرى، مما يجعلها مفيدة لمختلف الأهداف. وقد تم تطبيق المعيار، الذي تم إعداده كما هو ذكر هنا، لتطوير طريقة كروماتوغرافية سريعة وموثوق بها تسمح بالكشف الفعال والقياس الكمي لـ 2-AG بطريقة قابلة للاستنساخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 1-AG-D5 إعداد

ملاحظة: للحصول على 1-AG-d5 كمعيار داخلي مبتور لكمية الاختبارات، اتبع البروتوكول على النحو المفصل أدناه.

  1. الحماية التفاضلية
    1. لحماية الكحول الأولية فقط، أولا إضافة 38 ملغ من الجلسرين د8 إلى أنبوب رد فعل 10 مل باستخدام ماصة باستور وإضافة النمام المغناطيسي.
    2. إضافة 5 مل من ثنائي كلورو الميثان اللامائية (DCM) باستخدام حقنة هاملتون 5 مل، وملء الأنبوب مع N2 الجافة لإنتاج جو خامل.
    3. إعداد حمام باستخدام قارورة ديوار الضحلة مليئة خلات الإيثيل المقطر.
    4. تناسب أنبوب رد فعل مغلقة بإحكام داخل الحمام وتبريده عن طريق إضافة ببطء السائل N2 إلى خلات الإيثيل حتى يتم تجميد المذيب.
      تحذير: يغلي السائل بعنف في درجة حرارة الغرفة (RT) ويمكن أن يسبب حروقًا شديدة عند الاتصال بالعينين والجلد.
    5. إضافة 54 ملغ من التصادم اللامائية باستخدام حقنة هاملتون.
      تحذير: Collidine متقلبة ولها رائحة قوية جدا وغير سارة.
    6. إضافة 70 ملغ من كلوريد ثالث بوتيل ميثيل سيليل وتحريك الحل بأكمله لمدة 3 ح في -78 درجة مئوية على النمام المغناطيسي.
    7. بعد 3 ساعة، اترك رد الفعل للتدفئة في RT والحفاظ على التحريك لمدة 12 ساعة إضافية.
    8. إضافة 2 مل من محلول ملحي لإرواء رد الفعل.
    9. استخراج الحل 3X مع 2 مل من ثنائي كلورو الميثان المقطر باستخدام قمع فصل، وتوفير استخراج العضوية في كل مرة.
    10. الجمع بين ثلاثة مقتطفات العضوية وتجفيفها على كبريتات الصوديوم.
    11. تتبخر ثنائي كلورو الميثان تحت ضغط منخفض في مبخر دوار فراغ بعناية لتجنب التوقعات المذيبات.
    12. تنقية الخليط الخام عن طريق الكروماتوغرافيا العمود باستخدام هلام السيليكا كمرحلة ثابتة وزيادة 10٪ الهكسن / إيثيل خلات التدرج، بدءا من 100٪ هيكسان والانتهاء مع خلات إيثيل 100٪.
    13. الجمع بين الكسور التي تحتوي على المنتج وإزالة المذيب تحت ضغط منخفض في مبخر دوار فراغ للحصول على نقية 1-O، 3-O-bis-(TBDMS) الجلسرين-د5 كسائل عديم اللون.
  2. الاسترة
    1. إضافة 10 ملغ من 1-O، 3-O-bis (TBDMS) -الجلسرين-د5 (توليفها سابقا) إلى أنبوب رد فعل 10 مل باستخدام ماصة باستور وإضافة النمام المغناطيسي.
    2. إضافة 2 مل من ثنائي كلورو الميثان اللامائية باستخدام حقنة هاملتون 5 مل، وملء الأنبوب مع N2 الجافة لإنتاج جو خامل.
    3. تبريد الحل إلى 0 درجة مئوية باستخدام حمام الجليد.
    4. أضف 36 ملغ من حمض الأراكيدوليك باستخدام ميكرومازيت قابل للتعديل متعدد الحجم وحرّك.
    5. إضافة 15 ملغ من 4-ثنائي ميثيل أمينوبيريدين واثارة.
    6. إضافة 15 ملغ من N، N'-diisopropylcarbodiimide باستخدام ميكرومازيت قابل للتعديل متعددة الحجم ويحرك.
    7. دع الخليط يتفاعل عند درجة حرارة 0 درجة مئوية لمدة 3 ساعة.
    8. بعد 3 ساعة، اترك رد الفعل للتدفئة في RT والحفاظ على التحريك لمدة 12 ساعة إضافية.
    9. إضافة 2 مل من الماء لإرواء رد الفعل.
    10. استخراج الحل العضوي 3X مع 2 مل من ثنائي كلورو الميثان المقطر (DCM) باستخدام قمع فصل.
    11. ضع المستخلصات العضوية الثلاثة في نفس الأنبوب وجففها فوق كبريتات الصوديوم.
    12. تتبخر ثنائي كلورو الميثان تحت ضغط منخفض في مبخر دوار فراغ بعناية لتجنب التوقعات المذيبات.
    13. تنقية الخليط الخام عن طريق الكروماتوغرافيا العمود باستخدام هلام السيليكا كمرحلة ثابتة وزيادة 10٪ الهكسن / التدرج خلات الإيثيل، بدءا من 100٪ هيكسان والانتهاء مع 50٪ هيكسان / 50٪ خلات إيثيل.
    14. الجمع بين الكسور التي تحتوي على المنتج وإزالة المذيب تحت ضغط منخفض في مبخر دوار فراغ للحصول على نقية 1-O، 3-O-bis(TBDMS) -2-AG-D5 كسائل مصفر.
  3. إلغاء الحماية
    1. إضافة 15 ملغ من 1-O، 3-O-bis (TBDMS) -2-AG-D5 (توليفها سابقا) إلى أنبوب رد فعل 10 مل باستخدام ماصة باستور وإضافة النمام المغناطيسي.
    2. إضافة 2 مل من THF اللامائية باستخدام حقنة هاملتون 5 مل، وملء الأنبوب مع N2 الجافة لإنتاج جو خامل.
    3. تبريد الحل إلى 0 درجة مئوية باستخدام حمام الجليد.
    4. إضافة 150 ميكرولتر قطرة من 1 M رباعي الفلوريد حل في THF باستخدام حقنة هاملتون.
    5. دع رد الفعل دافئاً على RT وحرّك لمدة 1 ساعة.
    6. بعد 1 ساعة، إضافة 2 مل من الماء لإرواء رد الفعل.
    7. استخراج الحل 3X مع 2 مل من ثنائي كلورو الميثان المقطر باستخدام قمع فصل.
    8. الجمع بين ثلاثة مقتطفات العضوية وتجفيفها على كبريتات الصوديوم.
    9. تتبخر ثنائي كلورو الميثان تحت ضغط منخفض في مبخر دوار فراغ للحصول على نقية 1-AG-D5 كسائل مصفر.
  4. رصد جميع ردود الفعل من قبل طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا التي أجريت على هلام السيليكا 60 F254 أوراق الألومنيوم المغلفة مسبقا. تصور العصابات تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر بعد تلطيخ مع حل الإيثانول من 4-الأنيسالهايد.

2- إعداد الأوراق القياسية للمخزون وحلول القياس

  1. حل 1 ملغ من المعيار الداخلي 1-AG-D5 في 1 مل من ACN وsonicate لمدة 1 دقيقة للحصول على 1000 جزء في المليون حل الأسهم القياسية.
  2. لإعداد حل 1000 جزء في البوصة المستخدمة للقياس الكمي في الديدان، أولا إعداد حل 10 جزء في المليون: خذ 10 ميكرولتر من محلول الأسهم باستخدام حقنة هاملتون والتخفيف من ذلك إلى حجم نهائي من 1 مل عن طريق إضافة 990 ميكرولتر من ACN.
  3. خذ 100 ميكرو لتر من الحل المنتج في الخطوة 2.2 باستخدام حقنة هاملتون، وتمييعه إلى حجم نهائي قدره 1 مل بإضافة 900 ميكرولتر من ACN للحصول على حل 1000 جزء في البوصة المستخدمة للقياس الكمي.
  4. سونيكات لمدة دقيقة واحدة بين كل خطوة لضمان الذوبان الكامل. تخزين الحلول في -78 درجة مئوية للحفاظ على تركيزات وسلامة المعايير. بعد استخدام الحل القياسي، تدفق بعض النيتروجين قبل إغلاق القارورة لمنع الأكسدة.

3- نمو وصيانة شركة C. elegans

ملاحظة: بذور المتوسطة نمو الديدان الخيطية (NGM) لوحات أجار مع E. القولونية OP50 ونشر الديدان على هذه اللوحات.

  1. اخلط 3 غ من حمض الكلNa مع 17 غرام من أجار.
  2. إضافة 2.5 غرام من peptone، ثم إضافة 975 مل من H2O.
  3. الأوتوكلاف لمدة 50 دقيقة، ثم تبريد القارورة إلى 55 درجة مئوية.
  4. مزيج ما يلي: 1 مل من 1 M CaCl2، 1 مل من 1 م م غ سو4، 25 مل من 1 M KH2PO4 العازلة (وكلها كانت في السابق الأوتوكلاف)، و 1 مل من 5 ملغ / مل الكولسترول في الإيثانول.
  5. مع الحفاظ على بيئة معقمة، الاستغناء عن حل NGM في لوحات بيتري 60 ملم، وملء لوحات إلى ثلثي حجمها. تخزين لوحات في 4 درجة مئوية.
  6. اضرب الثقافة البكتيرية الإشريكية القولونية من مرق ة نسبة الجلسرين -80 درجة مئوية على طبق أجار LB. دعه ينمو على لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  7. التقاط مستعمرة واحدة لتلقيح 100 مل من السائل LB بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع التحريض.
    ملاحظة: ليس من الضروري التحقق من O.D. لأن هذه السلالة يمكن أن تصل إلى مرحلة ثابتة خلال هذا الوقت.
  8. إزالة لوحات NGM المخزنة، وإزالة الأغطية في غطاء محرك السيارة تدفق laminar، وترك مفتوحة للسماح تبخر الرطوبة الزائدة من لوحات.
  9. بمجرد تجفيف الأطباق، استخدم ماصة باستور لإضافة 100 ميكرولتر من OP50 E. coli إلى مركز اللوحة دون الانتشار.
  10. ترك OP50 E. كولي العشب لتنمو بين عشية وضحاها في RT أو في 37 درجة مئوية لمدة 8 ساعة.
  11. إضافة عدد الأجنة دودة المطلوب التي تم الحصول عليها عن طريق العلاج هيبوكلوريت أو "التبييض" (القسم 4).
    ملاحظة: تبريد لوحات إلى RT قبل إضافة الديدان.

4. تقنية التبييض لمزامنة الثقافات C elegans

  1. البذور وقطع الديدان على لوحات NGM 6 سم.
  2. ترك الديدان تنمو لمدة 2-3 أيام للحصول على أعداد كافية من البيض والبالغين الجاذبين على لوحة.
  3. مرة واحدة هناك ما يكفي من البيض / البالغين، صب 5 مل من M9 على لوحة.
  4. نقل الديدان إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل باستخدام ماصة زجاجية.
  5. الطرد المركزي أنبوب لمدة 2 دقيقة في 2000 × ز وبيليه الديدان.
  6. شفط معظم M9، وتجنب اضطراب بيليه دودة.
  7. إضافة 3 مل من محلول التبييض (2:1:1 نسبة هيدروكسيد الصوديوم: هيدروكسيد الصوديوم: H2O).
  8. عكس بلطف لخلط الحل لمدة 5 دقائق أو حتى ينخفض عدد الديدان الكبار سليمة.
    تحذير: لا تبيض لأكثر من 5 دقائق.
  9. الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 2000 × ز وشفط معظم محلول التبييض دون إزعاج بيليه دودة.
  10. إضافة 15 مل من M9 وتخلط جيدا.
  11. الطرد المركزي مرة أخرى في 2000 × ز لمدة 1 دقيقة.
  12. شفط معظم M9 دون إزعاج بيليه دودة.
  13. كرر الخطوات 4.10-4.12 مرة أو مرتين إضافيتين.
  14. إضافة 5 مل من M9 الطازجة وتحريك.
  15. دع البيض يفقس بين عشية وضحاها مع هزاز لطيف.

5. دودة عينة إعداد

  1. اسمحوا الأجنة N2 التي تم الحصول عليها من قبل إجراء التبييض يفقس بين عشية وضحاها في M9 العازلة (5 مل في أنبوب الطرد المركزي 15 مل) في 20 درجة مئوية.
  2. حصاد L1s متزامنة عن طريق الطرد المركزي أنبوب لمدة 2 دقيقة في 2000 × ز.
  3. غسل الديدان مع M9 العازلة 1X، ثم قياس عدد الديدان L1 الحية.
  4. البذور ما يقرب من 10،000 الديدان في لوحات NGM (10 سم قطرها) مع 1 مل من OP50 E. القولونية (المجففة سابقا).
  5. احتضان لوحات لمدة 48 ساعة في 20 درجة مئوية حتى تصل الديدان إلى مرحلة L4.
  6. حصاد الديدان باستخدام العازلة M9 الباردة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، وغسلها 1X، ثم نقلها إلى أنبوب 1.5 مل.
  7. بيليه الديدان عن طريق الطرد المركزي في 2000 × ز لمدة 1 دقيقة، والقضاء على معظم supernatant، تزج الأنابيب في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

6. استخراج الدهون

  1. ذوبان ما يقرب من 100 درجة مئوية من الكريات دودة المجمدة التي تنتمي إلى N2 على الجليد، إضافة 1.3 مل من الميثانول، وsonicate العينة لمدة 4 دقائق.
  2. إضافة 2.6 مل من الكلوروفورم، و 1.3 مل من 0.5 M KCl/0.08 M H3PO4 إلى نسبة نهائية من 1:2:1، 1000 جزء في البوصة من المعيار الداخلي 1-AG-D5،وهيدروكسيتولوين البوتيلاتي كعامل مضاد للأكسدة بتركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام/مل.
  3. دوامة العينات لمدة 1 دقيقة وsonicate في حمام المياه بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة على الجليد.
  4. دوامة العينات 2X لمدة دقيقة واحدة والطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 2000 × ز للحث على فصل المرحلة.
  5. جمع المرحلة السفلى وجمعها في أنبوب نظيفة، وتجفيفها تحت النيتروجين، وإعادة تعليق بقايا الصلبة في 100 درجة مئوية من ACN.

7. تحليل Endocannabinoid من قبل HPLC-MS / MS

  1. استخدم الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب مطياف كتلة رباعي رباعي ESI الثلاثي للكشف عن 2-AG وتحديدك من عينات الديدان الخيطية.
  2. استخدام النسبة التالية للمرحلة العكسية HPLC: من 0.0-0.5 دقيقة H2O: ACN (40:60)، 0.5-6.5 دقيقة H2O: ACN (40:60) إلى (25:75)، 6 2.5-7.5 دقيقة H2O: ACN (25:75), 7.5-8.0 min H2O:ACN (25:75) إلى (40:60), 8.0-12.0 دقيقة H2O: أ سي إن (40:60).
  3. الحفاظ على درجة حرارة العمود عند 40 درجة مئوية وتعيين درجة حرارة علبة العينات التلقائية إلى 10 درجة مئوية.
  4. تعيين شروط التأين التالية: وضع الأيون الإيجابي; تجفيف الغاز (N2)درجة الحرارة = 300 درجة مئوية؛ تجفيف معدل تدفق الغاز = 10 لتر / دقيقة؛ ضغط البخاخات = 10 UA؛ وقبعة. الجهد = 4 كيلو فولت.
  5. للكشف عن analyte، استخدم MRM مع التحولات التالية: 379.2 م / ز إلى 289.2 م / ز ل2-AG؛ و384.2 م/ض إلى 289.2 م/ض لـ 1-AG-d5.

8. قياس الكم endocannabinoid في الديدان

  1. استخدم المعيار الداخلي المندرجة 1-AG-d5 واحسب نسب منطقة الذروة للأناليت إلى المستوى الداخلي.
  2. استخدام التحولات التالية: 384.2 م/ز إلى 287.2 م/ز لـ 2-AG؛ و379.2 م/ض إلى 287.2 م/ض لـ 1-AG-d5.
  3. حساب تركيز الذاتية 2-AG عن طريق المقارنة مع نسب منطقة الذروة من المعيار deuterated باستخدام قيمة تركيز المعيار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تصنيع التناظرية ذات العلامات المتساوية من d 8 المتاحة تجارياً وحمضالأراكيدوليك باستخدام طريقة اصطناعية من 3 خطوات (الشكل 2، الشكل 3). هذه الخطوات واضحة ولا تتطلب معدات متطورة، وظروف تسيطر عليها خصيصا، أو الكواشف باهظة الثمن. وهكذا، فإن هذه الطريقة قوية ويمكن تمديدها بنجاح لتجميع monoacylglycerides التي تحتوي على الأحماض الدهنية المختلفة.

1-AG-D5 تم وصفها هيكليا باستخدام مطياف مغناطيسي نووي. 1 وأظهرت H NMR تعدد الخصائص في 5.44 جزء في المليون إلى 4.93 جزء في المليون، والذي يدمج لثمانية بروتونات الفينيل من سلسلة الأراكيدونويل والثلاثي في 2.40 جزء في المليون، المقابلة للبروتونين من موقف ألفا إلى مجموعة كاربونيل. في 2D NMR, فمن الممكن أيضا أن نرى 2.9 جزء في المليون إلى 2.7 جزء في المليون متعددة قابلة للتعيين إلى الديوتيريوم الخمسة من جزء الجلسرين.

وقد استخدمت المركبة المركبة كيميائياً 1-AG-d5 كمعيار داخلي في عينات C. elegans. تمت إضافة المعيار إلى العينات قبل استخراج ثم استخراج مع الدهون الذاتية، وذلك باستخدام طريقة مباشرة تكييفها من Folch24. توفر هذه الطريقة المعدلة قيمة استرداد عالية للمعيار، كما هو موضح من قبل القياس الكمي HPLC.

تم تحسين هذه الطريقة باستخدام التحولات 1) 384.2 م / ز إلى 287.2 م / ز ل2-AG و 2) 379.2 م / ز إلى 287.2 م / ض ل1-AG-D5، التي يتم فقدان جزيئات الجلسرين(الشكل 4). وقد حُسبت حدود الكشف (LOD) والقياس الكمي (LOQ) للمعيار باستخدام منحنى معايرة، مما أسفر عن قيم تبلغ 5 جزء في البليون و16.6 جزء في البليون على التوالي. وكان وقت الاحتفاظ بالمعيار 6.8 دقيقة.

2-AG الذاتية من عينات C. elegans تم الكشف عنها بنجاح وكميا عن طريق التخفيف النظائري مع توليفكيميائيا 1-AG-D5 باستخدام HPLC-MS/MS(الشكل 5).

وبما أن التركيزات الأصلية للمعايير المبتورة في العينات 1 و3 كانت كل منها 000 1 جزء في البليون، فمن ناحية منطقة الذروة، كان من الممكن حساب التركيز المحلي لـ 2-AG عند 340 جزء في البليون للعينة 1 و360 جزء في المليون للعينة 3، مما أسفر عن متوسط قدره 350 جزء في المليون ( الجدول 1

Figure 1
الشكل 1: موجز التوليف وأخذ عينات الديدان والقياس الكمي. لتحقيق القياس الكمي الناجح للمحلية 2-AG، كان من الضروري توليف التناظرية deuterated باستخدام تسلسل من ثلاث خطوات. بعد ذلك، تمت إضافته إلى عينات دودة، المستخرجة، وتحليلها من قبل HPLC-MS/MS. تستخدم كمعيار داخلي، والاصطناعية من 1-AG-D5 كانت الأداة المستخدمة لتحديد كمية المستقلب الذاتية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مخطط اصطناعي للحصول على 1-AG-d5. تم الحصول على كتلة من 10 ملغ من التناظرية deuterated باستخدام طريقة من ثلاث خطوات التي تنطوي على 1) حماية الجلسرين د8، 2) التحلل مع حمض الأراكيدوليك ، و 3) إزالة الحماية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التركيب الكيميائي للتناظر ية ذات العلامات المتساوية 2-AG التناظرية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الشظايا المختارة للتقدير الكمي لـ 1-AG-d5 و2-AG. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مخططات كروماتوغرام HPLC لـ 1-AG-d5 و1-AG كمعايير نقية ومعايير داخلية في عينة دودة. كان من الممكن تحليل أوقات الاحتفاظ ونرى أن 1) الدودة يبدو أن لا يكون الذاتية 1-AG و 2) سيكون لديها فقط 2-AG، ولكن معيار 1-AG-D5 سوف لا تزال تعمل كمعيار تحليلي جيد للقياس الكمي عن طريق التخفيف النظائري. وكانت التحولات المستخدمة: 384.2 م/ز إلى 287.2 م/ز لـ 2-AG، و379.2 م/ز إلى 287.2 م/ز لـ 1-AG-d5. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1- AG-d5 2-AG النسبة (2-AG/1-AG-d5)
عينة 1 71964.74 210616.08 0.34
عينة 3 74311.36 205648.43 0.36

الجدول 1: نسب منطقة الذروة للمعيار المبتور والمحلي 2-AG. وقد حُسبت النسب على أنها حاصل بين مناطق الذروة من 2-AG و1-AG-d5، على التوالي، لعينتين معزولتين، مع إضافة معيار مبتور قبل الاستخراج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Endocannabinoids هي فئة من الدهون التي تورطت في تنظيم تشكيل دور في C. elegans7. وبشكل أكثر تحديدا، فإن تركيب الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (PUFAs) مهم للاتجار بالكوليسترول والتنمية الإنجابية للدانة. وقد كشف هنا أن 2-AG، وهو حمض الأراكيدونيك الذي يحتوي على endocannabinoid، هو المسؤول عن اراحة يرقات البدور إلى دورتها العادية في الديدان التي ضعفت استقلاب الكوليسترول7.

وبالنظر إلى الأهمية المكتشفة مؤخرا من 2-AG في تعزيز الاتجار الكولسترول والعمليات البيولوجية الأخرى وكيف لا يعرف سوى القليل عن كيفية تأثير الدهون على هذه العملية، طريقة الكشف موثوق بها لهذا endocannabinoid ضروري. التطور الناجح لهذه الطريقة الاصطناعية بسيطة وقوية للحصول على التناظرية deuterated 1-AG-D5 هو خطوة رئيسية في هذا البروتوكول.

معظم الطرق المبلغ عنها لتحديد مقدار monoacylglycerols تنطوي على استخدام المعايير التحليلية المتاحة تجاريا، والتي عادة ما تكون مكلفة وغير مستقرة في ظل ظروف التخزين العادية. وهذا يجعلها غير مريحة للباحثين الذين يحتاجون إلى كميات أكبر من المعايير ومخزونات جديدة. كما أنه لا يمكن الوصول إليها بالنسبة للمختبرات ذات الميزانية المنخفضة. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة تتغلب على هذه العقبة باقتراح توليف للمعيار باستخدام مواد البدء التي يسهل الوصول إليها.

ومن اللافت للنظر أيضا أنه خلافا للأساليب الأخرى المبلغ عنها (التي تستخدم المعايير التحليلية المبتورة من مونواسيلغليسيرولز 2-البديلة التي تعاني من هجرة الأسيل في ظل العديد من الظروف، بحيث ينظر إلى اثنين من قمم الكروماتوغرافية وتؤثر على النسبية القياس الكمي عن طريق التخفيف النظائري25)،وتستخدم هذه الطريقة بكفاءة معيار تحليلي 1-بديل deuterated، وهو أيزومر واحد ولا يخضع لهجرة السيل.

الطريقة الاصطناعية هي واضحة ولا تتطلب أي ظروف متطورة، مما يجعلها مثالية لأي مختبر لديه الحد الأدنى من المعدات، والميزانية، والوصول إلى المتفاعلين. بل هو أيضا تقنية بسيطة التي يمكن استخدامها من قبل أي عالم يعمل في هذا المجال، دون الحاجة إلى تدريب خاص في التوليف العضوي. إعداد عينة دودة هو الأسلوب التقليدي، دون مزيد من المضاعفات. وأخيرا، فإن طريقة استخراج الدهون للحصول على العينات النهائية هو تعديل من بروتوكول Folch24 الذي يسمح لقيم استرداد أفضل، لأنه لا يتطلب تنقية العمود اللوني.

وتتمثل الخطوة الحاسمة في ضمان إجراء تحضير العينات واستخراج الدهون على نحو ملائم لتحقيق استرداد جيد ويمكن اكتشافه للمعيار. من المهم أيضا أن 1) إنتاج حلول الأسهم الطازجة شهريا للحفاظ على ظروف القياسية و 2) التحقق من قبل NMR-مطياف أو LC-MS أن المعيار لا يزال نقيا ولم يخضع للأكسدة أو التدهور. الحد الوحيد من هذه التقنية يعتمد في توسعها إلى دراسات أخرى قد يكون لها تركيزات محلية 2-AG أقل من LOQ المقدمة. في هذه الحالة، يجب تعديل الطريقة لضمان أن التركيز يقع بين الحدود.

في حالة الفشل أثناء البروتوكول الذي 1) لا توجد إشارة لونية مرئية من المعيار أو 2) قيمة الانتعاش من المعيار بعد استخراج أقل مما كان متوقعا، فمن المستحسن لتكرار إعداد العينة واستخراج الدهون. منذ الطريق الاصطناعية ينطوي على توليف كتلة بناء الجلسرين المحمية التي يتم أخيرا acylated مع حمض الأراكيدوليك في الخطوة الأخيرة، ويمكن توسيع هذه الطريقة إلى توليف المعايير المبتورة من monoacylglycerols أخرى، diacylglicerols, فوسفوليبيدات, والأيض ذات الصلة هيكليا.

وباختصار، يصف هذا الإجراء الجديد طريقة مباشرة وقابلة للاستنساخ للكشف عن وقياس 2-AG، والتي سوف تساعد على معالجة بعض الأسئلة التي لم يتم الرد عليها فيما يتعلق بدور هذا endocannabinoid في C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل بمنحة بحثية من المعهد الوطني للعلوم العلمية والتكنولوجية (ANPCyT, PICT 2014-3693). جي إف دي إل، جي بي، و بي إتش سي هم زملاء من كونيست. دي دي إم وجي آر إل عضوان في مهنة البحث في كونيست. نحن ممتنون لغونزالو لامبرتو (INMET) لتحليل LC-MS/MS والمناقشة المفيدة. وقد قام بتصوير وتحرير الفيديو راميرو أورتيغا وماريا سوليداد كاساسولا من إدارة العلوم في جامعة العلوم، كلية العلوم العقلية للجامعة الوطنية في روزاريو، الأرجنتين.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-dimethylaminopyridine Sigma-Aldrich 107700 reagent grade, 99%
antioxidant BHT Sigma-Aldrich W21805
Arachidonic acid Sigma-Aldrich 10931
Glycerol-d8 Sigma-Aldrich 447498
Mass detector Triple Quadrupole Thermo Scientific TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide Sigma-Aldrich D125407
NMR spectrometer Bruker Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column Thermo Fisher 25003-052130 C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride Sigma-Aldrich 190500 reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride Sigma-Aldrich 216143 1.0M in THF
UHPLC System Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol Caenorhabditis Genetics Center (CGC)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. Evolutionary origins of the endocannabinoid system. Gene. 370, 64-74 (2006).
  2. Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).
  3. Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms. Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).
  4. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).
  5. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline. Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).
  6. Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).
  7. Galles, C., et al. Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves. Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).
  8. Kurihara, J., et al. 2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves. The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).
  9. Harris, G., et al. Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans. PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).
  10. Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32. Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).
  11. Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors. Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).
  12. Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).
  13. Mills, H., et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).
  14. Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).
  15. Lehtonen, M., et al. Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).
  16. Aarnio, V., et al. Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family. Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).
  17. Annibal, A., Karalay, Ö, Latza, C., Antebi, A. A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans. Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).
  18. Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).
  19. Batugedara, H. M., et al. Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection. Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).
  20. Zhang, M. Y., et al. Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).
  21. Zoerner, A. A., et al. Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction. Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).
  22. Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).
  23. Keereetaweep, J., Chapman, K. D. Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification. Neural Plasticity. , (2016).
  24. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  25. Zoerner, A. A., et al. Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 151، endocannabinoids، C. elegans،التوليف، النظير deuterated، 2-AG، dauer، MAGs، HPLC-MS/ MS، تخفيف النظائر، القياس الكمي
توليف معيار مبتور للكم من 2-Arashidonoylglycerol في <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernández de Luco, J., Prez,… More

Fernández de Luco, J., Prez, G., Hernández Cravero, B., de Mendoza, D., Labadie, G. R. Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (151), e59882, doi:10.3791/59882 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter