Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Синтез пониженного стандарта для количественной оценки 2-Arachidonoylglycerol в Caenorhabditis elegans

Published: September 21, 2019 doi: 10.3791/59882
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1,3
1Instituto de Química Rosario (IQUIR-CONICET), Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 2Laboratorio de Fisiología Microbiana, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 3Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario

Summary

Эта работа описывает надежный и простой метод для обнаружения и количественной оценки эндоканнабиноидов 2-arachidonoylglycerol (2-AG) в C. elegans. Аналитический деутерированный стандарт, который мы подготовили и использовали для количественной оценки 2-AG с помощью изотопного разбавления и жидкой хроматографии-электроспрей ионизации-тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS/MS).

Abstract

Эта работа представляет собой метод подготовки аналитического стандарта для качественного и количественного анализа 2-арачидоилглицерола (2-AG) с помощью жидкой хроматографии-электроспрепи ионизации-тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS/MS). Эндоканнабиноиды являются консервированными липидными посредниками, которые регулируют несколько биологических процессов в различных организмах. В C. elegans, 2-AG было установлено, обладают различными ролями, в том числе модуляция dauer формирования и метаболизмхолестерина. В настоящем докладе описывается метод преодоления трудностей, связанных с затратами и стабильностью дейтерированных стандартов, необходимых для количественной оценки 2-АГ. Процедура синтеза стандарта проста и может быть выполнена в любой лаборатории, без необходимости проведения экспертизы органического синтеза или специального оборудования. Кроме того, описана модификация метода Фолч для извлечения пониженного стандарта из культуры C. elegans. Наконец, описан количественный и аналитический метод обнаружения 2-AG с использованием стабильного изотопно помеченного аналога 1-AG-d5, который обеспечивает надежные результаты в быстрохроматографическом беге. Процедура полезна для изучения нескольких ролей 2-AG в C. elegans, а также применима к другим исследованиям метаболитов в различных организмах.

Introduction

Эндоканнабиноиды регулируют несколько биологических процессов в различных организмах и сохраняют липидных посредников1. Первыми обнаруженными и наиболее хорошо характерными эндоканнабиноидами являются анандамид (арачидонайлетоламид, АЕА) и 2-арачидойный глицерол (2-AG). Эндоканнабиноиды играют много важных ролей, в том числе тех, кто участвует в системах вознаграждения мозга, а также наркомании, памяти, настроения и метаболических процессов2. AEA и 2-AG синтезируются только тогда, когда это необходимо и имеют короткий срок службы, и они деградируют через перенастройку транспортного белка и гидролиз3.

Использование животных моделей, как Caenorhabditis elegans (C. elegans) стало важным для изучения большого разнообразия биологических процессов, включая апоптоз, сигнализация клеток, клеточный цикл, клеточная полярность, регуляция генов, метаболизм, старение, и определение пола4,5. Кроме того, C. elegans является отличной моделью для изучения физиологической роли полиненасыщенных жирных кислот (ПУФА). AEA был выявлен в C. elegans и уменьшается в соответствии с диетическим ограничением6. Этот дефицит продлевает срок службы нематод через механизм диетического ограничения, которые могут быть подавлены добавками с эндоканнабиноидом. Недавно было обнаружено, что 2-AG и AEA играют основополагающую роль в регулировании торговли холестерином в C. elegans7. Что еще более важно, было установлено, что добавки с экзогенными 2-AG может спасти dauer арест, который вызван нарушениями торговли холестерином в Niemann-Pick типа C1 C. elegans мутантов.

Чтобы лучше понять связь 2-AG с торговлей холестерином и другими биологическими процессами в нематоде (т.е. моноаминерской сигнализации, ноцицепции и передвижения), крайне важно изучить этот эндогенный метаболит и как это пострадавших при определенных экологических и диетических условиях8,9,10,11,12,13. Поэтому крайне важно разработать и оптимизировать метод обнаружения и количественной оценки эндогенных 2-AG в C. elegans, который прост в использовании для ученых различных областей, особенно тех, кто изучает поведение нематод в связи с этим эндоканнабиноид.

В 2008 году Летхонен и его коллеги с помощью аналитических методов LC-MS удалось выявить 2-AG и AEA в C. elegans с помощью аналитических методов LC-MS14. В 2011 году им удалось расширить эту технику на другие эндоканнабиноиды15. Более поздние работы показали другие аналитические методы, которые были успешными в обнаружении и количественной оценке эндоканнабиноидов в C. elegans, в том числе масс-спектрометрии и GC-MS16,17,18, и он также сообщалось, что аналогичные аналитические методы могут быть расширены на другие модели19.

Ранее сообщалось аналитических методов, используемых для количественной оценки 2-AG в биологических образцов, как правило, включают в себя использование deuterated стандартов, которые приобретаются на коммерческой основе и требуют наличия для покупки20,21. Многие аналитические стандарты для LC-MS/MS количественной оценки эндоканнабиноидов коммерчески доступны у различных поставщиков. Тем не менее, они дорогие, чувствительны, и окисляются с течением времени, из-за наличия нескольких двойных облигаций. Наиболее распространенные версии этих стандартов основаны на окта-деютированной арахидоновой кислоты и подходят для количественной оценки с помощью изотопного разбавления LC-MS/MS14,22. Кроме того, большинство из этих стандартов заменяются в положении 2 глицерола, что делает их нестабильными в большинстве условий, поскольку они склонны к ацил-миграции19,23.

Для преодоления трудностей, связанных с затратами и стабильностью этих дейтерированных стандартов, представлен удобный и простой метод подготовки аналитического стандарта на основеглицерола-d 5. Последовательность для подготовки пента-деутерированный стандарт требует трехступенчатой процедуры, что приводит к стандартной 1-AG-D5, которая является стабильной и не подвергается ацил миграции (основной вопрос при направлении синтеза 2-monoacylglycerols).

Основная цель здесь заключается в том, чтобы показать простой и воспроизводимый метод для изучения 2-AG в C. elegans, в том числе синтез аналитического deuterated стандарта, подготовка и извлечение образцов нематод, и анализ LC-MS/MS (Рисунок 1 ). Эта синтетическая процедура достижима без сложных знаний органического синтеза или специального оборудования, что делает ее подходящей для ученых из разных областей, которые изучают поведение C. elegans под влиянием эндоканнабиноидов. Этот метод также может быть расширен по другим исследовательским моделям, что делает его полезным для различных целей. Стандарт, подготовленный, как сообщалось здесь, был применен для успешного разработки быстрого и надежного хроматографического метода, который позволяет эффективно обнаруживать и количественно 2-AG воспроизводимым образом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 1-AG-d5 подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения 1-AG-D5 в качестве deuterated внутреннего стандарта для количественного анализов, следуйте протоколу, как описано ниже.

  1. Дифференциальная защита
    1. Чтобы защитить только первичные спирты, сначала добавьте 38 мг глицерола-d8 в 10 мл реакционную трубку с помощью пипетки Pasteur и добавьте магнитный мешалку.
    2. Добавьте 5 мл ангидроусового дихлорметана (DCM) с помощью шприца Гамильтона 5 мл, и заполните трубку сухим N2, чтобы создать инертную атмосферу.
    3. Приготовьте ванну с помощью мелкой колбы Dewar, наполненной дистиллированным этиловым ацетатом.
    4. Приспособите герметично закрытую реакционную трубку внутри ванны и охладите ее, медленно добавляя жидкость N2 в этиловый ацетат до тех пор, пока растворитель не замерзнет.
      ВНИМАНИЕ: жидкость сильно кипит при комнатной температуре (RT) и может вызвать сильные ожоги при контакте с глазами и кожей.
    5. Добавьте 54 мг ангидроуса коллайдина с помощью шприца Гамильтона.
      ВНИМАНИЕ: Столкновение является неустойчивым и имеет очень сильный и неприятный запах.
    6. Добавьте 70 мг терт-бутилметилзилхорид хлорида и размешайте весь раствор в течение 3 ч при -78 градусов по Цельсию на магнитном усилителе.
    7. После 3 ч, оставить реакцию теплой на RT и держать помешивая еще 12 ч.
    8. Добавьте 2 мл рассола, чтобы утолить реакцию.
    9. Извлеките раствор 3x с 2 мл дистиллированного дихлорметана с помощью отделяющей воронки, сохраняя органический экстракт каждый раз.
    10. Смешайте три органических экстракта и высушите их над сульфатом натрия.
    11. Испарите дихлорметан под пониженным давлением в вакуумном роторном испарителе тщательно, чтобы избежать платежеспособных проекций.
    12. Очистите сырую смесь по колонке хроматографии с помощью кремнезема гель в качестве стационарной фазы и 10% увеличения гексан / этил ацетат градиент, начиная со 100% гексан и заканчивая 100% этилацетат.
    13. Комбинат продукт-содержащих фракций и удалить растворитель под пониженным давлением в вакуумном роторном испарителе, чтобы получить чистый 1-O,3-O-Bis-(TBDMS) глицерол-d5 как бесцветная жидкость.
  2. Этерификации
    1. Добавьте 10 мг 1-O,3-O-bis (TBDMS)-glycerol-d5 (ранее синтезированный) в 10 мл реакционную трубку с помощью пипетки Pasteur и добавьте магнитный мешалку.
    2. Добавьте 2 мл ангидроусового дихлорметана с помощью шприца Гамильтона 5 мл и заполните трубку сухим N2, чтобы создать инертную атмосферу.
    3. Охладите раствор до 0 градусов с помощью ледяной ванны.
    4. Добавьте 36 мг арахидоновой кислоты с помощью многотомного регулируемого микропипетля и перемешайте.
    5. Добавить 15 мг 4-диметиламинопиридин и перемешать.
    6. Добавьте 15 мг N,N'-diisopropylcarbodiimide с помощью многотомного регулируемого микропипетля и перемешайте.
    7. Пусть смесь реагирует на 0 кс в течение 3 ч.
    8. После 3 ч, оставить реакцию теплой на RT и держать помешивая еще 12 ч.
    9. Добавьте 2 мл воды, чтобы утолить реакцию.
    10. Извлеките органический раствор 3x с 2 мл дистиллированного дихлорметана (DCM) с помощью отделяющей воронки.
    11. Поместите три органических экстракта в ту же трубку и высушите их над сульфатом натрия.
    12. Испарите дихлорметан под пониженным давлением в вакуумном роторном испарителе тщательно, чтобы избежать платежеспособных проекций.
    13. Очистите сырую смесь по колонке хроматографии с использованием кремнезема гель в качестве стационарной фазы и 10% увеличение гексан / этил ацетат градиент, начиная от 100% гексан и заканчивая 50% гексан / 50% этил ацетат.
    14. Объедините продуктосодержащие фракции и удалите растворитель под пониженным давлением в вакуумном роторном испарителе, чтобы получить чистый 1-O, 3-O-bis (TBDMS)-2-AG-d5 в виде желтоватой жидкости.
  3. Дезащита
    1. Добавьте 15 мг 1-O,3-O-bis (TBDMS)-2-AG-d5 (ранее синтезировался) в 10 мл реакционную трубку с помощью пипетки Pasteur и добавьте магнитный мешалку.
    2. Добавьте 2 мл ангидроусового THF с помощью шприца Гамильтона 5 мл и заполните трубку сухим N2, чтобы создать инертную атмосферу.
    3. Охладите раствор до 0 градусов с помощью ледяной ванны.
    4. Добавьте 150 л л dropwise 1 M тетрабутиламмония фторид решение в THF с помощью шприца Гамильтона.
    5. Пусть реакция теплой к RT и перемешать в течение 1 ч.
    6. После 1 ч добавьте 2 мл воды, чтобы утолить реакцию.
    7. Извлеките раствор 3x с 2 мл дистиллированного дихлорметана с помощью разделительной воронки.
    8. Смешайте три органических экстракта и высушите их над сульфатом натрия.
    9. Испаряйся дихлорметана под пониженным давлением в вакуумном роторном испарителе, чтобы получить чистый 1-AG-d5 в виде желтоватой жидкости.
  4. Мониторинг всех реакций с помощью тонкослойной хроматографии выполняется на кремнезема гель 60 F254 предварительно покрытием алюминиевых листов. Визуализируйте полосы под 254 нм ультрафиолетовой лампы после окрашивания этанолиальным раствором 4-анисалдегида.

2. Подготовка стандартных складских и измерительных растворов

  1. Растворите 1 мг внутреннего стандарта 1-AG-d5 в 1 мл ACN и соните в течение 1 мин, чтобы получить стандартное стоковое решение объемом 1000 промилле.
  2. Чтобы подготовить раствор 1000 ppb, используемый для количественной оценки у червей, сначала подготовьте раствор 10 промилле: возьмите 10 л биржевого раствора с помощью шприца Гамильтона и разбавьте его до конечного объема 1 мл, добавив 990 л ACN.
  3. Возьмите 100 кЛ из раствора, произведенного в шаге 2.2 с использованием шприца Гамильтона, и разбавьте его до конечного объема 1 мл, добавив 900 л ACN для получения раствора 1000 ppb, используемого для количественной оценки.
  4. Соните в течение 1 мин между каждым шагом, чтобы обеспечить полную растворимизацию. Храните растворы при -78 градусов по Цельсию для поддержания концентрации и целостности стандартов. После использования стандартного раствора, поток некоторых азота до закрытия флакона для предотвращения окисления.

3. Рост и содержание C. elegans

ПРИМЕЧАНИЕ: Семя нематод среднего роста (NGM) агар пластины с E. coli OP50 и размножаться червей на этих пластинах.

  1. Смешайте 3 г NaCl с 17 г агара.
  2. Добавьте 2,5 г пептона, затем добавьте 975 мл H2O.
  3. Автоклав в течение 50 минут, затем охладите колбу до 55 градусов по Цельсию.
  4. Смешайте следующее: 1 мл 1 M CaCl2, 1 мл 1 M MgSO4, 25 мл 1 M KH2PO4 буфера (все из которых были ранее autoclaved), и 1 мл 5 мг / мл холестерина в этаноле.
  5. Сохраняя стерильную среду, распределяйте раствор NGM в 60 мм пластины Петри, заполняя пластины до двух третей их объема. Храните тарелки при 4 градусах по Цельсию.
  6. Полоса E. coli бактериальной культуры от -80 кС глицерол фонда на LB агар пластины. Пусть он растет на тарелке на ночь при 37 градусах Цельсия.
  7. Возьмите одну колонию, чтобы привить 100 мл жидкого LB на ночь при 37 градусах Цельсия с волнением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это не обязательно, чтобы проверить O.D., потому что этот штамм может достичь стационарной фазы в течение этого времени.
  8. Снимите хранящиеся пластины NGM, снимите крышки в ламинарном капоте и оставьте открытым, чтобы позволить испарение избыточной влаги из пластин.
  9. После того, как пластины высохнут, используйте пипетку Pasteur, чтобы добавить 100 зл и l OP50 E. coli к центру пластины, не распространяя.
  10. Оставьте газон OP50 E. coli, чтобы расти на ночь на RT или при 37 градусах по Цельсию в течение 8 ч.
  11. Добавьте желаемое число эмбрионов червей, полученных путем лечения гипохлоритом или "отбеливания" (раздел 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Охладить пластины для RT до добавления червей.

4. Метод отбеливания для синхронизации культур C elegans

  1. Семена и куски червей на 6 см NGM пластин.
  2. Оставьте червей, растущих в течение 2-3 дней, чтобы получить достаточное количество яиц и gravid взрослых на тарелке.
  3. После того, как Есть достаточно яиц / взрослых, залить 5 мл M9 на тарелку.
  4. Перенесите червей в центрифугу мощностью 15 мл с помощью стеклянной пипетки.
  5. Centrifuge трубку в течение 2 мин на 2000 х г и гранулы червей.
  6. Всасывание большую часть M9, избегая нарушения гранул червя.
  7. Добавьте 3 мл отбеливания (2:1:1 соотношение NaOH:NaOCl:H2O).
  8. Перевернуть осторожно, чтобы смешать раствор в течение 5 минут или до тех пор, пока количество нетронутых взрослых червей уменьшается.
    ВНИМАНИЕ: Не отбеливайте более 5 мин.
  9. Центрифуга в течение 1 мин при 2000 х г и всасывание большую часть отбеливания раствора, не нарушая гранулы червя.
  10. Добавьте 15 мл M9 и хорошо перемешайте.
  11. Центрифуге снова при 2000 х г в течение 1 мин.
  12. Всасывание из большинства M9, не нарушая червя гранулы.
  13. Повторите шаги 4.10-4.12 один или два раза.
  14. Добавьте 5 мл свежего M9 и агитировать.
  15. Пусть яйца люк на ночь с нежным качания.

5. Подготовка образца червя

  1. Пусть n2 эмбрионов, полученных в процессе отбеливания люк ночь в буфере M9 (5 мл в 15 мл центрифуги трубки) при 20 градусов по Цельсию.
  2. Урожай синхронизированных L1s путем центрифугации трубки в течение 2 мин на 2000 х г.
  3. Вымойте червей с m9 буфер 1x, а затем количественно количество живых червей L1.
  4. Семя примерно 10 000 червей в ngM пластины (10 см в диаметре) с 1 мл OP50 E. coli (ранее сушеные).
  5. Инкубировать пластины в течение 48 ч при 20 градусах Цельсия, пока черви не достигнут стадии L4.
  6. Урожай червей с помощью холодного буфера M9 в 15 мл центрифуги трубки, мыть их 1x, а затем передать их в 1,5 мл трубки.
  7. Пеллети червей центрифугированием при 2000 х г в течение 1 мин, устраняйте большую часть супернатанта, погружайте трубки в жидкий азот и храните при -80 градусов по Цельсию.

6. Добыча липидов

  1. Оттепели примерно 100 л замороженных гранул червя, принадлежащих N2 на льду, добавить 1,3 мл метанола и сотнифицировать образец в течение 4 мин.
  2. Добавьте 2,6 мл хлороформа и 1,3 мл 0,5 м KCl/0,08 М Н H3PO4 к окончательному соотношению 1:2:1, 1000 ppb внутреннего стандарта 1-AG-d5и бутиляционного гидрокситолуола в качестве антиоксидантного агента при конечной концентрации 50 мкг/мл.
  3. Vortex образцы для 1 мин и соники в ультразвуковой водяной бане в течение 15 минут на льду.
  4. Vortex образцы 2x в течение 1 мин и центрифуга в течение 10 мин на 2000 х г, чтобы вызвать фазовое разделение.
  5. Соберите нижнюю фазу и соберите ее в чистую трубку, высушите ее под азотом и приостановите твердые остатки в 100 КЛ ACN.

7. Эндоканнабиноидный анализ HPLC-MS/MS

  1. Используйте жидкую хроматографию в сочетании с масс-спектрометром МАСС ESI тройной квадрупольный для обнаружения и количественной оценки 2-AG из образцов нематод.
  2. Используйте следующее соотношение для обратной фазы HPLC: от 0,0-0,5 мин H2O:ACN (40:60), 0,5-6,5 мин H2O:ACN (40:60) до (25:75), 6 .5-7.5 мин H2O:ACN (25:75), 7.5-8.0 мин H2O:ACN (25:75) до (40:60), 8.0-12.0 мин H2O: ACN (40:60).
  3. Поддерживайте температуру колонки при температуре 40 градусов по Цельсию и установите температуру лотка автосэмпера до 10 градусов по Цельсию.
  4. Установите следующие условия ионизации: режим положительно-ионного; сушки газа (N2) температура 300 градусов по Цельсию; скорость сушки газа - 10 л/мин; давление небулайзера No 10 УА; и крышка. напряжение 4 кВ.
  5. Для обнаружения аналита используйте МРМ со следующими переходами: 379,2 м/с до 289,2 м/с для 2-АГ; и от 384,2 м/с до 289,2 м/с для 1-АГ-д5.

8. Кваннабиноидная количественная оценка у червей

  1. Используйте deuterated внутренний стандарт 1-AG-d5 и вычислите пиковые соотношения площади анализировать к внутреннему стандарту.
  2. Используйте следующие переходы: 384,2 м/з до 287,2 м/с для 2-АГ; и 379,2 м/с до 287,2 м/с для 1-AG-d5.
  3. Рассчитайте концентрацию эндогенных 2-AG, сравнивая пиковые соотношения площади deuterated стандарта, используя значение концентрации стандарта.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Изотопно помеченный аналог был успешно синтезированиз коммерчески доступных d 8-глицерол и арахидоновая кислота с помощью 3-ступенчатого синтетического метода(Рисунок 2, Рисунок 3). Эти шаги являются простыми и не требуют сложного оборудования, специально контролируемых условий или дорогих реагентов. Таким образом, этот метод является надежным и может быть успешно расширен для синтеза моноацильглыцеридов, содержащих различные жирные кислоты.

1-AG-d5 был структурно охарактеризован с использованием ядерной магнитной спектроскопии. 1 H NMR показал характерный мультипликатор на 5,44 пром до 4,93 пром, который интегрируется для восьми виниловых протонов арачидоиловой цепи и трипна на 2,40 пром, что соответствует двум протонам альфа-позиции в группу углерода. В 2D NMR, можно также увидеть 2,9 промилле до 2,7 промилле multiplet назначен пять дейтерия глицерол часть.

Химически синтезированный 1-AG-d5 использовался в качестве внутреннего стандарта в образцах C. elegans. Стандарт был добавлен в образцы перед извлечением затем извлечены с эндогенных липидов, используя простой метод, адаптированный из листвони24. Этот модифицированный метод обеспечивает высокое значение восстановления стандарта, как показано в количественной оценке HPLC.

Метод был оптимизирован с использованием переходов 1) 384,2 м/з до 287,2 м/з для 2-АГ и 2) 379,2 м/з до 287,2 м/з для 1-AG-d5,при котором молекулы глицерола теряются(рис. 4). Пределы обнаружения (LOD) и количественной оценки (ЛОЗ) были рассчитаны для стандарта с использованием кривой калибровки, в результате чего значения 5 ppb и 16.6 ppb, соответственно. Время удержания стандарта составило 6,8 мин.

2-AG эндогенных из образцов C. elegans был успешно обнаружен и количественно изотопного разбавления с химически синтезированных 1-AG-D5 с помощью HPLC-MS/MS (Рисунок 5).

Так как первоначальные концентрации deuterated стандартов в образцах 1 и 3 были каждый 1000 ppb, от пикового соотношения области можно было вычислить эндогенную концентрацию 2-AG на 340 ppb для образца 1 и 360 ppm для образца 3, принося в среднем 350 ppm ( Таблица 1).

Figure 1
Рисунок 1: Резюме синтеза, червя выборки и количественной оценки. Для успешной количественной оценки эндогенного 2-AG необходимо было синтезировать его deuterated аналог с помощью трехступенчатой последовательности. После этого, он был добавлен в червь образцов, извлеченных и проанализированных HPLC-MS/MS. Используется в качестве внутреннего стандарта, синтетический 1-AG-D5 был инструмент, используемый для количественной оценки эндогенного метаболита. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Синтетическая схема для получения 1-AG-d5. Масса 10 мг отступного аналога была получена с помощью трехступенчатого метода, включающегося в 1) защитуглицерола-d 8,2) аксилирования арахидоновой кислотой и 3) дезащиты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Химическая структура изотопно помеченного аналога 2-AG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Выбранные фрагментации для количественной оценки 1-AG-d5 и 2-AG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Хроматограммы HPLC для 1-AG-d5 и 1-AG в виде чистых стандартов и внутренних стандартов в образце червя. Можно было проанализировать время удержания и увидеть, что 1) червь, как представляется, не имеют эндогенных 1-AG и 2) он будет иметь только 2-AG, но стандартный 1-AG-d5 будет по-прежнему работать как хороший аналитический стандарт для количественной оценки по изотопной разбавления. Использованы переходы: 384,2 м/з до 287,2 м/с для 2-АГ и 379,2 м/с до 287,2 м/с для 1-AG-d5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

1-AG-d5 2-АГ Коэффициент (2-AG/1-AG-d5)
Пример 1 71964.74 210616.08 0.34
Пример 3 74311.36 205648.43 0.36

Таблица 1: Пиковые соотношения площадей для деутерированных стандартных и эндогенных 2-AG. Коэффициенты были рассчитаны как коэффициент между пиковыми областями 2-AG и 1-AG-d5, соответственно, для двух изолированных образцов, как с deuterated стандартом, добавленным до извлечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эндоканнабиноиды являются классом липидов, которые были вовлечены в регулирование формирования dauer в C. elegans7. В частности, синтез полиненасыщенных жирных кислот (ПУФА) имеет важное значение для торговли холестерином и репродуктивного развития червей. Здесь показано, что 2-AG, арахидоновая кислота, содержащая эндоканнабиноид, отвечает за реституцию личинки dauer к своему нормальному циклу у червей, которые имеют нарушение метаболизма холестерина7.

Учитывая недавно обнаруженную важность 2-AG в повышении оборота холестерина и других биологических процессов и о том, как мало известно о том, как липиды влияют на этот процесс, необходим надежный метод обнаружения этого эндоканнабиноида. Успешное развитие этого простого и надежного синтетического метода для получения deuterated аналога 1-AG-d5 является ключевым шагом в этом протоколе.

Большинство сообщаемых методов количественной оценки моноацилиглыцерола связаны с использованием коммерчески доступных аналитических стандартов, которые, как правило, являются дорогостоящими и нестабильными в условиях регулярного хранения. Это делает их неудобными для исследователей, которым требуется большее количество стандартов и свежих запасов. Они также недоступны для низкобюджетных лабораторий. Однако этот метод преодолевает это препятствие, предлагая синтез стандарта с использованием более доступных исходных материалов.

Примечательно также, что в отличие от других методов, сообщенных (которые используют deuterated аналитические стандарты 2-заменители моноацилглицерола, которые страдают ацил-миграцией при многих условиях, так что два хроматографических пиков видны и влияют на относительное количественной оценки по изотопной разбавления25), этот метод эффективно использует 1-заменители deuterated аналитический стандарт, который является одним изомером и не подвергается ацил-миграции.

Синтетический метод прост и не требует сложных условий, что делает его идеальным для любой лаборатории, имеющей минимальное оборудование, бюджет и доступ к реагентов. Это также простой метод, который может быть использован любым ученым, работающим в этой области, без необходимости специальной подготовки в органическом синтезе. Подготовка образца червя является обычным методом, без дальнейших осложнений. Наконец, метод извлечения липидов для получения окончательных образцов является модификацией из протокола24 Folch, которая позволяет улучшить значения восстановления, так как она не требует очистки хроматографической колонки.

Важнейшим шагом является обеспечение адекватной подготовки к образу и экстракции липидов для достижения хорошего и обнаруживаемого восстановления стандарта. Важно также, чтобы 1) производить свежие фондовые растворы ежемесячно для поддержания условий стандарта и 2) проверить ЯМР-спектроскопии или LC-MS, что стандарт по-прежнему чистый и не претерпел окисления или деградации. Единственное ограничение этого метода зависит от его расширения на другие исследования, которые могут иметь эндогенные концентрации 2-AG ниже, чем представленные LO. В этом случае метод должен быть изменен, чтобы обеспечить, чтобы концентрация упала между пределами.

В случае отказа во время протокола, в котором 1) нет видимого хроматографического сигнала стандарта или 2) восстановительный значение стандарта после извлечения ниже, чем ожидалось, рекомендуется повторить подготовку образца и липидную экстракции. Так как синтетический маршрут включает в себя синтез защищенного отлитого глицерола строительный блок, который, наконец, acylated с арахидоновой кислотой в последнем шаге, этот метод может быть расширен до синтеза отлитых стандартов других моноацилглицерол, диацильпелол, фосфолипиды и структурно связанные метаболиты.

Таким образом, эта новая процедура описывает простой и воспроизводимый метод для обнаружения и количественной оценки 2-AG, который поможет решить некоторые из неотвеченных вопросов, касающихся роли этого эндоканнабиноида в C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана исследовательским грантом Национального агенсии Промсвязьбанка Кьентифика и Текнологика (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P. и B.H.C. являются стипендиатами CONICET. D.d.M. и G.R.L. являются членами исследовательской карьеры CONICET. Мы благодарны Гонсало Ламберто (INMET) за анализ LC-MS/MS и полезное обсуждение. Видеосъемка и редактирование было сделано Рамиро Ортега и Мария Соледад Касасола из Direccion де Comunicacion де ла Сьенсия, Факультет Сиенсия Политика у Relaciones Internacionales, Университет Национальный Росарио в Росарио, Аргентина.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-dimethylaminopyridine Sigma-Aldrich 107700 reagent grade, 99%
antioxidant BHT Sigma-Aldrich W21805
Arachidonic acid Sigma-Aldrich 10931
Glycerol-d8 Sigma-Aldrich 447498
Mass detector Triple Quadrupole Thermo Scientific TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide Sigma-Aldrich D125407
NMR spectrometer Bruker Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column Thermo Fisher 25003-052130 C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride Sigma-Aldrich 190500 reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride Sigma-Aldrich 216143 1.0M in THF
UHPLC System Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol Caenorhabditis Genetics Center (CGC)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. Evolutionary origins of the endocannabinoid system. Gene. 370, 64-74 (2006).
  2. Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).
  3. Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms. Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).
  4. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).
  5. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline. Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).
  6. Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).
  7. Galles, C., et al. Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves. Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).
  8. Kurihara, J., et al. 2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves. The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).
  9. Harris, G., et al. Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans. PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).
  10. Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32. Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).
  11. Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors. Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).
  12. Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).
  13. Mills, H., et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).
  14. Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).
  15. Lehtonen, M., et al. Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).
  16. Aarnio, V., et al. Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family. Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).
  17. Annibal, A., Karalay, Ö, Latza, C., Antebi, A. A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans. Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).
  18. Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).
  19. Batugedara, H. M., et al. Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection. Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).
  20. Zhang, M. Y., et al. Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).
  21. Zoerner, A. A., et al. Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction. Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).
  22. Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).
  23. Keereetaweep, J., Chapman, K. D. Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification. Neural Plasticity. , (2016).
  24. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  25. Zoerner, A. A., et al. Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).

Tags

Биохимия Выпуск 151 эндоканнабиноиды C. elegans синтез deuterated аналоги 2-AG dauer MAGs HPLC-MS/MS изотопное разбавление количественная
Синтез пониженного стандарта для количественной оценки 2-Arachidonoylglycerol в <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernández de Luco, J., Prez,… More

Fernández de Luco, J., Prez, G., Hernández Cravero, B., de Mendoza, D., Labadie, G. R. Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (151), e59882, doi:10.3791/59882 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter