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Biochemistry

Síntese de um padrão Deuterated para a quantificação de 2-Arachidonoylglycerol em elegans do Caenorhabditis

Published: September 21, 2019 doi: 10.3791/59882
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1,3
1Instituto de Química Rosario (IQUIR-CONICET), Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 2Laboratorio de Fisiología Microbiana, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 3Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario

Summary

Este trabalho descreve um método robusto e direto para detectar e quantificar o endocanabinóide 2-arachidonoylglycerol (2-AG) em C. elegans. Um padrão analítico deuterado nos preparou e utilizou para a quantificação de 2-AG por diluição isotópica e cromatografia líquida-eletroestimulação por espectrometria de massas tandem-electrospray (LC-ESI-MS/MS).

Abstract

Este trabalho apresenta um método para preparar um padrão analítico para analisar 2-arachidonoyl glicerol (2-AG) qualitativamente e quantitativamente pela espectrometria de massas de ionização em tandem (LC-ESI-MS/MS) de cromatografia líquida-electrospray. Os endocanabinoides são conservados mediadores lipídicos que regulam vários processos biológicos em uma variedade de organismos. Em C. elegans, 2-AG foi encontrado para possuir papéis diferentes, incluindo a modulação da formação do Dauer e do metabolismo do colesterol. Este relatório descreve um método para superar as dificuldades associadas com os custos e a estabilidade de padrões deuterado exigidos para a quantificação 2-AG. O procedimento para a síntese do padrão é simples e pode ser executado em todo o laboratório, sem a necessidade para a perícia orgânica da síntese ou o equipamento especial. Além disso, é descrita uma modificação do método de Folch para extrair o padrão deuterado da cultura C. elegans . Finalmente, um método quantitativo e analítico para detectar 2-AG usando o análogo isotopicamente etiquetado estável 1-AG-d5 é descrito, que fornece resultados de confiança em um funcionamento rápido-cromatográfico. O procedimento é útil para estudar as funções múltiplas de 2-AG em C. elegans ao igualmente ser aplicável a outros estudos dos metabolitos em organismos diferentes.

Introduction

Os endocanabinoides regulam processos biológicos múltiplos em uma variedade de organismos e são mediadores lipídicos conservados1. Os primeiros endocanabinoides descobertos e mais bem caracterizados são anandamida (arachidonoylethanolamide, AEA) e 2-arachidonoyl glicerol (2-AG). Endocannabinoids desempenham muitos papéis críticos, incluindo os envolvidos em sistemas de recompensa cerebral, bem como a toxicodependência, memória, humor e processos metabólicos2. AEA e 2-AG são sintetizados somente quando necessário e têm períodos de vida curtos, e são degradados com a recaptação e a hidrólise da proteína do transporte3.

O uso de modelos animais como Caenorhabditis elegans (C. elegans) tornou-se importante para estudar a grande variedade de processos biológicos, incluindo apoptose, sinalização celular, ciclo celular, polaridade celular, regulação genética, metabolismo, envelhecimento, e determinação do sexo4,5. Adicionalmente, C. elegans é um excelente modelo para estudar os papéis fisiológicos de ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs). A AEA foi identificada em C. elegans e é reduzida restrição dietética6. Esta deficiência estende a vida útil do nematoide através de um mecanismo de restrição dietética que pode ser suprimida pela suplementação com o endocanabinoide. Recentemente, descobriu-se que 2-AG e AEA desempenham papéis fundamentais na regulação do tráfico de colesterol em C. elegans7. Mais importante, determinou-se que a suplementação com 2-AG exógeno pode resgatar Dauer prisão, que é causada pelo tráfico de colesterol prejudicada em Niemann-Pick tipo C1 C. elegans mutantes.

Para obter uma melhor compreensão da relação 2-AG com o tráfico de colesterol e outros processos biológicos no nematódeo (i.e., sinalização monoaminérgica, nocicepção e locomoção), é crucial estudar este metabolito endógeno e como é afetados determinadas condições ambientais e dietéticas8,9,10,11,12,13. Portanto, é imperativo projetar e otimizar um método para detectar e quantificar 2-AG endógena em C. elegans que é simples de usar para cientistas de diferentes campos, especialmente aqueles que estudam o comportamento do nematódeo em relação a este endocanabinóide.

Em 2008, Lethonen e colegas de trabalho conseguiram identificar 2-AG e AEA em C. elegans utilizando métodos analíticos LC-MS14. Em 2011, conseguiram ampliar essa técnica para outros endocanabinoides15. Trabalhos mais recentes mostraram outros métodos analíticos que têm sido bem-sucedidos na detecção e quantificação de endocanabinoides em C. elegans, incluindoespectrometria de massas e GC-MS16,17,18, etem também foi relatado que métodos analíticos semelhantes podem ser expandidos para outros modelos19.

Os métodos analíticos previamente relatados usados para quantificar 2-AG em amostras biológicas envolvem geralmente o uso de padrões deuterado que são adquiridos comercialmente e exigem a disponibilidade para a compra20,21. Muitos padrões analíticos para a quantificação de LC-MS/MS de endocanabinoides estão disponíveis comercialmente a partir de diferentes fornecedores. No entanto, eles são caros, são sensíveis, e se tornam oxidados ao longo do tempo, devido à presença de múltiplas ligações duplas. As versões mais comuns destas normas baseiam-se no ácido araquidônico Octa-deuterado e são adequadas para quantificação por diluição isotópica LC-MS/MS14,22. Além disso, a maioria destes padrões são substituídos na posição 2 do glicerol, tornando-os instáveis na maioria das condições, uma vez que são propensas à migração de acilo19,23.

Para superar as dificuldades associadas aos custos e à estabilidade desses padrões deuterados, um método conveniente e simples é apresentado para elaborar um padrão analítico baseado em glicerol-d5. A sequência para preparar o padrão penta-deuterated requer um procedimento de três etapas que resulte no padrão 1-AG-d5, que é estável e não sofre migração de acilo (a principal questão quando se pretende sintetizar 2-monoacilgliceróis).

O objetivo principal aqui é mostrar um método simples e reprodutível para estudar 2-AG em C. elegans, incluindo a síntese do padrão analítico deuterado, preparação e extração das amostras de nematódeos e análise por LC-MS/MS (Figura 1 ). Este procedimento sintético é realizável sem o conhecimento orgânico sofisticado da síntese ou o equipamento especial, fazendo o apropriado para cientistas dos campos diferentes que estão estudando o comportamento de C. elegans a influência do endocanabinóide. O método também é expansível para outros modelos de estudo, tornando-o útil para diferentes alvos. O padrão, preparado como relatado aqui, foi aplicado para desenvolver com sucesso um método cromatográfico rápido e de confiança que permita a deteção e a quantificação eficazes de 2 AG em uma maneira reprodutível.

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Protocol

1.1-AG-d5 preparação

Nota: para a obtenção de 1-AG-d5 como um padrão interno deuterado para ensaios de quantificação, siga o protocolo conforme detalhado abaixo.

  1. Proteção diferencial
    1. Para proteger somente álcoois primários, primeiro adicione 38 mg de glicerol-d8 a um tubo de reação de 10 ml usando uma pipeta Pasteur e adicione um agitador magnético.
    2. Adicione 5 mL de diclorometano anidro (DCM) utilizando uma seringa Hamilton de 5 mL e encha o tubo com N2 seco para produzir uma atmosfera inerte.
    3. Prepare um banho usando um balão raso de Dewar enchido com o acetato de etilo destilado.
    4. Encaixe o tubo de reacção hermeticamente fechado no interior do banho e fixe-o adicionando lentamente o líquido N2 ao acetato de etila até que o solvente esteja congelado.
      PRECAUÇÃO: o líquido ferve violentamente à temperatura ambiente (RT) e pode provocar queimaduras graves ao contactar os olhos e a pele.
    5. Adicione 54 mg de colidina anidra usando uma seringa de Hamilton.
      Cuidado: a Collidine é volátil e tem um aroma muito forte e desagradável.
    6. Adicionar 70 mg de cloreto de tert-butildimetilsilílico e agitar toda a solução durante 3 h a-78 ° c num agitador magnético.
    7. Após 3 h, deixe a reacção para aquecer no RT e continue mexendo por um adicional de 12 h.
    8. Adicionar 2 mL de salmoura para saciar a reacção.
    9. Extraia a solução 3x com 2 mL de diclorometano destilado usando um funil de separação, salvando o extrato orgânico de cada vez.
    10. Combine os três extratos orgânicos e seque-os sobre o sulfato de sódio.
    11. Evate o diclorometano a pressão reduzida em um Evaporador giratório do vácuo com cuidado para evitar projeções solventes.
    12. Purificar a mistura bruta por cromatografia em coluna utilizando sílica gel como a fase estacionária e um gradiente de 10% crescente de hexano/acetato de etilo, a partir de 100% de hexano e acabamento com 100% de acetato de etilo.
    13. Combine as frações que contêm o produto e retire o solvente pressão reduzida em um evaporador rotativo a vácuo para obter o puro 1-O, 3-O-bis-(TBDMS) glicerol-d5 como um líquido incolor.
  2. Esterificação
    1. Adicionar 10 mg de 1-o, 3-O-bis (TBDMS)-glicerol-d5 (previamente sintetizado) a um tubo de reacção de 10 ml utilizando uma pipeta Pasteur e adicionar um agitador magnético.
    2. Adicione 2 mL de diclorometano anidro utilizando uma seringa Hamilton de 5 mL e encha o tubo com N2 seco para produzir uma atmosfera inerte.
    3. Resfrie a solução para 0 ° c usando um banho de gelo.
    4. Adicione 36 mg de ácido araquidônico usando uma micropipeta ajustável de vários volumes e mexa.
    5. Adicione 15 mgs de 4-dimethylaminopyridine e mexa.
    6. Adicionar 15 mg de N, n'-diisopropylcarbodiimida usando uma micropipeta ajustável de vários volumes e mexa.
    7. Deixe a mistura reagir a 0 ° c durante 3 h.
    8. Após 3 h, deixe a reacção para aquecer no RT e continue mexendo por um adicional de 12 h.
    9. Adicionar 2 mL de água para saciar a reacção.
    10. Extraia a solução orgânica 3x com 2 mL de diclorometano destilado (DCM) usando um funil de separação.
    11. Coloque os três extratos orgânicos no mesmo tubo e seque-os sobre o sulfato de sódio.
    12. Evate o diclorometano a pressão reduzida em um Evaporador giratório do vácuo com cuidado para evitar projeções solventes.
    13. Purificar a mistura bruta por cromatografia em coluna utilizando sílica gel como a fase estacionária e um gradiente de 10% crescente de hexano/acetato de etilo, a partir de 100% hexano e terminando com 50% hexano/50% acetato de etilo.
    14. Combine as frações contendo produtos e retire o solvente pressão reduzida em um evaporador rotativo a vácuo para obter o puro 1-O, 3-O-bis (TBDMS)-2-AG-d5 como um líquido amarelado.
  3. Desproteção
    1. Adicionar 15 mg do 1-o, 3-O-bis (TBDMS)-2-AG-d5 (previamente sintetizado) a um tubo de reacção de 10 ml utilizando uma pipeta Pasteur e adicionar um agitador magnético.
    2. Adicione 2 mL de THF anidro usando uma seringa de 5 mL Hamilton, e encha o tubo com N seco2 para produzir uma atmosfera inerte.
    3. Resfrie a solução para 0 ° c usando um banho de gelo.
    4. Adicionar 150 μL de solução de fluoreto de tetrabutylamónio de 1 M em THF usando uma seringa de Hamilton.
    5. Deixe a reação quente para RT e mexa por 1 h.
    6. Após 1 h, adicione 2 mL de água para saciar a reacção.
    7. Extraia a solução 3x com 2 mL de diclorometano destilado usando um funil de separação.
    8. Combine os três extratos orgânicos e seque-os sobre o sulfato de sódio.
    9. Evate o diclorometano a pressão reduzida em um Evaporador giratório do vácuo para obter o 1 puro AG-d5 como um líquido amarelado.
  4. Monitore todas as reações por cromatografia em camada fina realizada em gel de sílica 60 F254 chapas de alumínio pré-revestidas. Visualize as bandas uma lâmpada UV de 254 nm após a coloração com uma solução etanólico de 4-Anisaldeído.

2. preparação de estoque padrão e soluções de medição

  1. Dissolva 1 mg do padrão interno 1-AG-d5 em 1 ml de ACN e proceda por 1 min para obter a solução de estoque padrão de 1.000 ppm.
  2. Para preparar a solução 1.000 ppb utilizada para quantificação em vermes, prepare primeiro uma solução de 10 ppm: Tome 10 μL da solução de stock utilizando uma seringa de Hamilton e dilui-a num volume final de 1 mL adicionando 990 μL de ACN.
  3. Tome 100 μL da solução produzida no passo 2,2 utilizando uma seringa de Hamilton e dilui-a num volume final de 1 mL adicionando 900 μL de ACN para obter a solução de 1.000 ppb utilizada para a quantificação.
  4. SONICATE por 1 min entre cada passo para garantir a solubilização completa. Armazene as soluções a-78 ° c para manter as concentrações e a integridade das normas. Depois que a solução padrão é usada, flua algum nitrogênio antes de fechar o tubo de ensaio para impedir a oxidação.

3. crescimento e manutenção de C. elegans

Nota: semeie as placas do agar do meio de crescimento do nematoide (NGM) com e . coli OP50 e propague os sem-fins nestas placas.

  1. Misture 3 g de NaCl com 17 g de agar.
  2. Adicionar 2,5 g de peptona, em seguida, adicionar 975 mL de H2O.
  3. Autoclave para 50 min, em seguida, arrefecer o balão para 55 ° c.
  4. Misture o seguinte: 1 mL de 1 M de CaCl2, 1 ml de 1 m MgSO4, 25 ml de 1 m KH2po4 tampão (todos os quais foram previamente esterilizados) e 1 ml de 5 mg/ml de colesterol em etanol.
  5. Ao manter um ambiente estéril, dispense a solução de NGM em placas de Petri de 60 milímetros, enchendo as placas a dois terços de seu volume. Guarde as placas a 4 ° c.
  6. Raia a cultura bacteriana de E. coli de um estoque de glicerol-80 ° c na placa de agar lb. Deixe crescer na placa durante a noite em 37 ° c.
  7. Pegue uma única colônia para inocular 100 mL de LB líquida durante a noite a 37 ° c com agitação.
    Nota: não é necessário verific o O.D. porque esta tensão pode alcangar a fase estacionária sobre este tempo.
  8. Retire as placas NGM armazenadas, retire as tampas na capa do fluxo laminar e deixe-a aberta para permitir a evaporação do excesso de humidade das placas.
  9. Uma vez que as placas são secas, use uma pipeta de Pasteur para adicionar 100 μL de OP50 E. coli ao centro da placa sem espalhar.
  10. Deixe o gramado de OP50 E. coli para crescer durante a noite no RT ou em 37 ° c por 8 h.
  11. Adicionar o número desejado de embriões de vermes obtidos por tratamento com hipoclorito ou "branqueamento" (secção 4).
    Nota: arrefecer as placas para RT antes da adição de vermes.

4. técnica de branqueamento para a sincronização C elegans culturas

  1. Vermes de semente e pedaços em placas NGM de 6 cm.
  2. Deixe os vermes crescendo por 2-3 dias para obter números suficientes de ovos e adultos gravid na placa.
  3. Uma vez que há bastante ovos/adultos, despeje 5 mL de M9 na placa.
  4. Transfira os vermes para um tubo de centrífuga de 15 mL usando uma pipeta de vidro.
  5. Centrifugue o tubo por 2 min a 2.000 x g e pellet os vermes.
  6. Sucção para fora a maioria do M9, evitando o distúrbio da pelota do sem-fim.
  7. Adicionar 3 mL de solução de branqueamento (2:1:1 proporção de NaOH: NaOCl: H2O).
  8. Inverta suavemente para misturar a solução durante 5 min ou até que o número de vermes adultos intactos diminua.
    Cuidado: não lixívia por mais de 5 min.
  9. Centrifugue por 1 minuto em 2.000 x g e sucção a maioria da solução de branqueamento sem perturbar a pelota do sem-fim.
  10. Adicione 15 mL de M9 e misture bem.
  11. Centrifugar novamente a 2000 x g durante 1 min.
  12. Sucção para fora a maioria do M9 sem perturbar a pelota do sem-fim.
  13. Repita os passos 4.10-4.12 uma ou duas vezes mais.
  14. Adicionar 5 mL de M9 fresco e agitar.
  15. Deixe os ovos eclodirem durante a noite com o balanço suave.

5. preparação da amostra do sem-fim

  1. Deixe que os embriões N2 obtidos pelo procedimento de branqueamento escotilha durante a noite no tampão M9 (5 mL em um tubo de centrífuga de 15 mL) a 20 ° c.
  2. Colher a L1s sincronizada centrifugação do tubo durante 2 min a 2.000 x g.
  3. Lave os vermes com o tampão M9 1x e, em seguida, quantifique o número de worms L1 vivos.
  4. Sementes de aproximadamente 10.000 vermes em placas NGM (10 cm de diâmetro) com 1 mL de OP50 E. coli (previamente secas).
  5. Incubar as placas para 48 h a 20 ° c até que os vermes alcancem o estágio L4.
  6. Colher os vermes usando frio M9 buffer em um tubo de centrífuga de 15 mL, lave-os 1x, em seguida, e transferi-los para um tubo de 1,5 mL.
  7. Pellet os vermes por centrifugação em 2.000 x g por 1 min, eliminar a maior parte do sobrenadante, mergulhar os tubos em nitrogênio líquido, e armazenar a-80 ° c.

6. extração de lipídios

  1. Descongelar aproximadamente 100 μL de pellets de minhoca congelados pertencentes a N2 no gelo, adicionar 1,3 mL de metanol e sonicar a amostra durante 4 min.
  2. Adicionar 2,6 mL de clorofórmio, e 1,3 mL de 0,5 M KCl/0,08 M H3po4 a uma relação final de 1:2:1, 1.000 ppb do padrão interno 1-AG-d5, e hidroxitolueno butil como um agente antioxidante na concentração final de 50 μg/ml.
  3. Vortex as amostras para 1 min e proceda em um banho de água ultra-sônica para 15 min no gelo.
  4. Vórtice as amostras 2x por 1 min e centrifugar por 10 min a 2.000 x g para induzir a separação da fase.
  5. Recolher a fase inferior e recolhê-lo em um tubo limpo, seque-o nitrogênio, e ressuscitem o resíduo sólido em 100 μL de ACN.

7. análise endocanabinoide por HPLC-MS/MS

  1. Use a cromatografia líquida acoplada com um espectrómetro maciço do Quadrupole de ESI para detectar e quantificar 2 AG das amostras do nematoide.
  2. Use a seguinte relação para a HPLC da fase invertida: de 0,0-0,5 min H2o:acn (40:60), 0,5-6,5 min h2o:acn (40:60) a (25:75), 6,5-7,5 min h2o:ACN (25:75), 7,5-8,0 min h2o:ACN (25:75) a (40:60), 8.0-12.0 min h2O: ACN (40:60).
  3. Mantenha a temperatura da coluna a 40 ° c e ajuste a temperatura da bandeja do amostrador automático para 10 ° c.
  4. Defina as seguintes condições de ionização: modo de íon positivo; temperatura do gás de secagem (N2) = 300 ° c; vazão de gás de secagem = 10 L/min; pressão do nebulizador = 10 UA; e boné. tensão = 4 kV.
  5. Para a deteção do analito, use o MRM com as seguintes transições: 379,2 m/z a 289,2 m/z para 2-AG; e 384,2 m/z a 289,2 m/z para 1-AG-d5.

8. quantificação de endocanabinoides em vermes

  1. Use o padrão interno deuterado 1-AG-d5 e calcule as relações máximas da área do analito ao padrão interno.
  2. Use as seguintes transições: 384,2 m/z a 287,2 m/z para 2-AG; e 379,2 m/z a 287,2 m/z para 1-AG-d5.
  3. Calcule a concentração do 2-AG endógeno comparando com as proporções de pico de área do padrão deuterado usando o valor de concentração do padrão.

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Representative Results

Um análogo isotopicamente marcado foi sintetizado com sucesso a partir de d8-glicerol e ácido araquidônico comercialmente disponíveis usando um método sintético de 3 etapas (Figura 2, Figura 3). Estes passos são simples e não necessitam de equipamentos sofisticados, especialmente condições controladas, ou reagentes caros. Assim, este método é robusto e pode ser estendido com sucesso para sintetizar monoacilglicerídeos contendo diferentes ácidos graxos.

1-AG-d5 foi caracterizado estruturalmente usando a espectroscopia magnética nuclear. 1. º H NMR mostrou o multiplet característico em 5,44 ppm a 4,93 ppm, que integra para os oito prótons do vinil da corrente do arachidonoyl e do Triplet em 2,40 ppm, correspondendo aos dois prótons da posição alfa ao grupo carbonila. Em 2D NMR, também é possível ver um 2,9 ppm para 2,7 ppm multiplet atribuível aos cinco deutério da porção de glicerol.

O 1-AG-d5 quimicamente sintetizado foi utilizado como padrão interno em amostras de C. elegans . O padrão foi adicionado às amostras antes da extração, em seguida, extraída com os lipídios endógenos, utilizando um método direto adaptado de Folch24. Este método modificado fornece um valor elevado da recuperação do padrão, como mostrado pela quantificação da HPLC.

O método foi otimizado utilizando as transições 1) 384,2 m/z para 287,2 m/z para 2-AG e 2) 379,2 m/z para 287,2 m/z para 1-AG-d5, em que as moléculas de glicerol são perdidas (Figura 4). Os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) foram calculados para o padrão utilizando uma curva de calibração, resultando em valores de 5 PPB e 16,6 ppb, respectivamente. O tempo de retenção para o padrão foi de 6,8 min.

2-AG endógena das amostras de C. elegans foi detectada com sucesso e quantificada por diluição isotópica com o 1-AG-d5 quimicamente sintetizado utilizando HPLC-MS/MS (Figura 5).

Uma vez que as concentrações originais dos padrões deuterados nas amostras 1 e 3 foram cada 1.000 ppb, a partir da razão de pico de área foi possível calcular a concentração endógena de 2-AG em 340 ppb para a amostra 1 e 360 ppm para a amostra 3, produzindo uma média de 350 ppm ( Tabela 1).

Figure 1
Figura 1: Resumo da síntese, amostragem de vermes e quantificação. Para conseguir a quantificação bem sucedida do 2-AG endógeno, era necessário sintetizar seu Analog deutated usando uma seqüência de três etapas. Posteriormente, foi adicionada a amostras de vermes, extraídas e analisadas por HPLC-MS/MS. utilizado como padrão interno, o sintético de 1-AG-d5 foi a ferramenta utilizada para quantificar o metabolito endógeno. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: esquema sintético para a obtenção de 1-AG-d5. Uma massa de 10 mgs do Analog deutated foi obtida usando o método da três-etapa que envolve 1) proteção do glicerol-d8, 2) acilação com ácido araquidônico, e 3) deprotection. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: estrutura química do análogo isotopicamente rotulado 2-AG. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: fragmentações selecionadas para quantificação de 1-AG-d5 e 2-AG. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: cromatogramas de HPLC para 1-AG-d5 e 1-AG como padrões puros e padrões internos em uma amostra de Worm. Foi possível analisar os tempos de retenção e ver que 1) o verme parece não ter endógeno 1-AG e 2) ele só teria 2-AG, mas o padrão 1-AG-d5 ainda funcionará como um bom padrão analítico para quantificação por diluição isotópica. As transições utilizadas foram: 384,2 m/z a 287,2 m/z para 2-AG, e 379,2 m/z a 287,2 m/z para 1-AG-d5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1-AG-d5 2-AG Relação (2-AG/1-AG-d5)
Amostra 1 71964,74 210616, 8 0,34
Amostra 3 74311,36 205648,43 0,36

Tabela 1: relações de área de pico para o padrão deuterado e 2-AG endógena. As proporções foram calculadas como quociente entre as áreas de pico de 2-AG e 1-AG-d5, respectivamente, para duas amostras isoladas, ambas com padrão deuterado adicionado antes da extração.

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Discussion

Os endocanabinoides são uma classe de lipídios que têm sido implicados na regulação da formação de Dauer em C. elegans7. Mais especificamente, a síntese de ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) é importante para o tráfico de colesterol e o desenvolvimento reprodutivo de vermes. Revela-se aqui que 2-AG, um ácido araquidônico que contem o endocannabinoid, é responsável para restituir a larva do Dauer a seu ciclo normal nos sem-fins que prejudicaram o metabolismo do colesterol7.

Dada a importância recentemente descoberto de 2-AG no aprimoramento do tráfico de colesterol e outros processos biológicos e como pouco se sabe sobre como os lipídios influenciam este processo, um método de detecção confiável para este endocanabinoide é necessário. O desenvolvimento bem sucedido deste método sintético simples e robusto para obter o análogo deuterado 1-AG-d5 é uma etapa chave neste protocolo.

A maioria dos métodos relatados para quantificar diacilgliceróis envolve o uso de padrões analíticos comercialmente disponíveis, que são geralmente caros e instáveis condições de armazenamento regulares. Isso os torna inconveniente para os pesquisadores que necessitam de maiores quantidades de padrões e estoques frescos. Eles também são inacessíveis para laboratórios de baixo orçamento. No entanto, este método supera este obstáculo, propondo a síntese do padrão usando materiais de partida mais acessíveis.

Também é notável que o contrário a outros métodos relatados (que usam padrões analíticos deuterado de diacilgliceróis 2-substituídos que sofrem a Acyl-migração muitas circunstâncias, de modo que dois picos cromatográficos estejam vistos e afetem o parente quantificação por diluição isotópica25), este método utiliza eficientemente um padrão analítico deuterado 1-substituído, que é um único isómero e não sofre de acilo-migração.

O método sintético é simples e não requer condições sofisticadas, tornando-o ideal para qualquer laboratório com equipamento mínimo, orçamento e acesso a reagentes. É também uma técnica simples que pode ser usada por qualquer cientista que trabalha no campo, sem a necessidade de formação especial em síntese orgânica. A preparação da amostra do sem-fim é o método convencional, sem complicações mais adicionais. Finalmente, o método de extração lipídica para obtenção das amostras finais é uma modificação do protocolo de Folch24 que possibilita melhores valores de recuperação, uma vez que não requer purificação de coluna cromatográfica.

A etapa crítica é assegurar-se de que a preparação da amostra e a extração do lipido sejam executadas adequadamente para conseguir a boa e a recuperação detectável do padrão. Também é importante para 1) produzir soluções de estoque fresco mensalmente para manter as condições do padrão e 2) verificação por RMN-espectroscopia ou LC-MS que o padrão ainda é puro e não sofreu oxidação ou degradação. A única limitação dessa técnica depende de sua expansão para outros estudos que possam ter concentrações endógenas de 2-AG inferiores ao LOQ apresentado. Neste caso, o método deve ser modificado para garantir que a concentração caia entre os limites.

No caso de falha durante o protocolo em que 1) não há sinal cromatográfico visível do padrão ou 2) o valor de recuperação do padrão após a extração é menor do que o esperado, recomenda-se repetir a preparação da amostra e extração de lipídios. Desde que a rota sintética envolve a síntese de um bloco de edifício deuterado protegido do glicerol que seja finalmente acilado com ácido araquidônico na última etapa, este método pode ser expandido à síntese de padrões deuterado de outros monoacylglycerols, diacylgliceróis, fosfolipídios e metabólitos estruturalmente relacionados.

Em síntese, este novo procedimento descreve um método simples e reprodutível para detecção e quantificação de 2-AG, o que ajudará a abordar algumas das perguntas não respondidas sobre o papel deste endocanabinoide em C. elegans.

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Disclosures

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da Agencia Nacional de Promoción científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., e B.H.C. são companheiros da CONICET. D.d.M. e G.R.L. são membros da carreira de pesquisa da CONICET. Estamos gratos a Gonzalo Lamberto (INMET) para a análise LC-MS/MS e discussão útil. A filmagem e edição de vídeo foi feita por Ramiro Ortega e María Soledad Casasola da Dirección de comunicación de la Ciencia, Facultad de ciencia política y relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario em Rosario, Argentina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-dimethylaminopyridine Sigma-Aldrich 107700 reagent grade, 99%
antioxidant BHT Sigma-Aldrich W21805
Arachidonic acid Sigma-Aldrich 10931
Glycerol-d8 Sigma-Aldrich 447498
Mass detector Triple Quadrupole Thermo Scientific TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide Sigma-Aldrich D125407
NMR spectrometer Bruker Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column Thermo Fisher 25003-052130 C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride Sigma-Aldrich 190500 reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride Sigma-Aldrich 216143 1.0M in THF
UHPLC System Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol Caenorhabditis Genetics Center (CGC)

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Bioquímica edição 151 endocanabinoides C. elegans síntese análogos deuterados 2-AG Dauer Mags HPLC-MS/MS diluição isotópica quantificação
Síntese de um padrão Deuterated para a quantificação de 2-Arachidonoylglycerol em <em>elegans do Caenorhabditis</em>
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Fernández de Luco, J., Prez,… More

Fernández de Luco, J., Prez, G., Hernández Cravero, B., de Mendoza, D., Labadie, G. R. Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (151), e59882, doi:10.3791/59882 (2019).

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