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Biochemistry

Caenorhabditis elegans में 2-Arachidonoylglycerol के क्वांटाइज के लिए एक ड्यूरेटेड मानक का संश्लेषण

Published: September 21, 2019 doi: 10.3791/59882
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1,3
1Instituto de Química Rosario (IQUIR-CONICET), Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 2Laboratorio de Fisiología Microbiana, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 3Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario

Summary

यह काम का पता लगाने और endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) सी elegansमें की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मजबूत और सीधा तरीका का वर्णन करता है। एक विश्लेषणात्मक ड्यूरेट मानक हमें तैयार किया और isotopic तहलका और तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा 2-AG की मात्रा के लिए इस्तेमाल किया-electrospray ionization-टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-ईएसआई-एमएस /

Abstract

यह काम 2-arachidonoyl ग्लिसरॉल (2-AG) गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से तरल क्रोमैटोग्राफी-इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण-टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस) का विश्लेषण करने के लिए एक विश्लेषणात्मक मानक तैयार करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। एंडोकैनाबिनोइड लिपिड मध्यस्थों को संरक्षित कर ते हैं जो विभिन्न जीवों में अनेक जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं। सी elegansमें, 2-AG dauer गठन और कोलेस्ट्रॉल चयापचय के मॉडुलन सहित विभिन्न भूमिकाओं के अधिकारी पाया गया है. यह रिपोर्ट 2-AG परिमाणीकरण के लिए आवश्यक ड्यूरेट मानकों की लागत और स्थिरता से जुड़ी कठिनाइयों को दूर करने के लिए एक विधि का वर्णन करती है। मानक के संश्लेषण के लिए प्रक्रिया सरल है और किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है, कार्बनिक संश्लेषण विशेषज्ञता या विशेष उपकरणों के लिए आवश्यकता के बिना. इसके अलावा, C. elegans संस्कृति से deuterated मानक निकालने के लिए Folch विधि का एक संशोधन का वर्णन किया गया है. अंत में, एक मात्रात्मक और विश्लेषणात्मक विधि स्थिर आइसोटोप्लासी लेबल एनालॉग 1-AG-d5 का उपयोग कर 2-AG का पता लगाने के लिए वर्णित है, जो एक तेजी से वर्णलेखीय चलाने में विश्वसनीय परिणाम प्रदान करता है. प्रक्रिया सी elegans में 2-AG की कई भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, जबकि भी विभिन्न जीवों में चयापचयों के अन्य अध्ययनों के लिए लागू किया जा रहा है.

Introduction

एंडोकैनाबिनोइड विभिन्न प्रकार के जीवों में अनेक जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं और लिपिड मध्यस्थ1का संरक्षण करते हैं। पहली खोज की और सबसे अच्छी तरह से विशेषता endocannabinoids anandamide (arachidonoylethanolamide, एईए) और 2-arachidonoyl ग्लिसरॉल (2-एजी) हैं। Endocannabinoids मस्तिष्क इनाम प्रणाली के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नशीली दवाओं की लत, स्मृति, मूड, और चयापचय प्रक्रियाओं2में शामिल उन सहित कई महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. एईए और 2-एजी केवल संश्लेषित कर रहे हैं जब जरूरत है और कम जीवन काल है, और वे परिवहन प्रोटीन reuptake और hydrolysis3के माध्यम से अपमानित कर रहे हैं.

Caenorhabditis elegans (सी elegans) जैसे पशु मॉडल का उपयोग apoptosis सहित जैविक प्रक्रियाओं की बड़ी विविधता का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हो गया है, सेल संकेतन, सेल चक्र, सेल polarity, जीन विनियमन, चयापचय, उम्र बढ़ने, और लिंग निर्धारण4,5. इसके अतिरिक्त, सी elegans polyunsaturated फैटी एसिड (PUFAs) की शारीरिक भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है. एईए की पहचान सी एलिगेंस में की गई है और इसे आहार प्रतिबंध6के तहत कम किया गया है . यह कमी एक आहार प्रतिबंध तंत्र है कि endocannabinoid के साथ पूरकता द्वारा दबा या जा सकता है के माध्यम से सूत्रकृमि की उम्र फैली हुई है. हाल ही में, यह पता चला है कि 2-AG और AEA सी elegans7में कोलेस्ट्रॉल की तस्करी के विनियमन में मौलिक भूमिका निभाते हैं. इससे भी महत्वपूर्ण बात, यह निर्धारित किया गया था कि exogenous के साथ पूरकता 2-AG dauer गिरफ्तारी बचाव कर सकते हैं, जो Niemann-पिक प्रकार C1 सी elegans उत्परिवर्ती में बिगड़ा कोलेस्ट्रॉल की तस्करी के कारण होता है.

सूत्रकृमि में कोलेस्ट्रॉल की तस्करी और अन्य जैविक प्रक्रियाओं के साथ 2-AG के संबंधों की बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए (यानी, मोनोएमिनर्जिक संकेतन, नोसिसेप्शन और चलन), यह इस अंतर्जात मेटाबोलाइट का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह कैसे है कुछ पर्यावरण और आहार संबंधी परिस्थितियों में प्रभावित8,9,10,11,12,13. इसलिए, यह डिजाइन और एक विधि का पता लगाने और सी elegans में अंतर्जात 2-AG मात्रा निर्धारित करने के लिए आवश्यक है कि विभिन्न क्षेत्रों के वैज्ञानिकों के लिए उपयोग करने के लिए सरल है, विशेष रूप से जो लोग इस के संबंध में सूत्रकृमि के व्यवहार का अध्ययन एन्डोकैनाबिनॉइड.

2008 में, Lethonen और सहकर्मियों LC-एमएस विश्लेषणात्मक तरीकों14का उपयोग कर सी elegans में 2-AG और एईए की पहचान करने में सफल रहा। 2011 में, वे अन्य endocannabinoids15करने के लिए इस तकनीक का विस्तार करने में कामयाब रहे. हाल ही में काम अन्य विश्लेषणात्मक तरीकों है कि पता लगाने और सी elegansमें endocannabinoids की मात्रा में सफल रहा है दिखाया गया है , बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री और जीसी-एमएस16सहित ,17,18, और यह है यह भी सूचित किया गया है कि इसी प्रकार की विश्लेषणात्मक विधियों का विस्तार अन्य मॉडलों में किया जा सकताहै.

पहले जैविक नमूनों में 2-एजी की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रयुक्त विश्लेषणात्मक विधियों की रिपोर्ट की गई थी जिसमें आमतौर पर ड्यूरेट मानकों का उपयोग शामिल होता है जो वाणिज्यिक रूप से प्राप्त किए जाते हैं और खरीद के लिए उपलब्धता की आवश्यकता होती है20,21. एंडोक्नाबिनोइड के एलसी-एमएस/एमएस परिमाणीकरण के लिए कई विश्लेषणात्मक मानक विभिन्न प्रदाताओं से वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हैं। फिर भी, वे महंगे हैं, संवेदनशील हैं, और समय के साथ ऑक्सीकरण हो जाते हैं, कई डबल बांड की उपस्थिति के कारण. इन मानकों का सबसे आम संस्करण ऑक्टा-ड्यूरेटेड अराचिडोनिक एसिड पर आधारित है और आइसोटोप कमजोर पड़ने एलसी-एमएस14,22द्वारा परिमाणीकरण के लिए उपयुक्त हैं। इसके अलावा, इन मानकों में से अधिकांश ग्लिसरॉल की स्थिति 2 में प्रतिस्थापित कर रहे हैं, उन्हें ज्यादातर परिस्थितियों में अस्थिर कर रही है क्योंकि वे acyl प्रवास के लिए प्रवण हैं19,23.

लागत और इन deuterated मानकों की स्थिरता के साथ जुड़े कठिनाइयों को दूर करने के लिए, एक सुविधाजनक और सरल विधि ग्लिसरोल-डी5के आधार पर एक विश्लेषणात्मक मानक तैयार करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है। पेंटा-ड्यूरेट मानक तैयार करने के लिए अनुक्रम एक तीन-चरण प्रक्रिया है कि मानक में परिणाम की आवश्यकता है 1-AG-d5, जो स्थिर है और acyl प्रवास से गुजरना नहीं है (मुख्य मुद्दा जब 2-monoacylglycerols संश्लेषित करने के लिए लक्ष्य).

यहाँ मुख्य उद्देश्य सी elegansमें 2-AG अध्ययन करने के लिए एक सरल और reproduible विधि दिखाने के लिए है, विश्लेषणात्मक deuterated मानक के संश्लेषण सहित, तैयारी और सूत्रकृमि के नमूनों की निकासी, और LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण (चित्र 1) ). इस सिंथेटिक प्रक्रिया परिष्कृत कार्बनिक संश्लेषण ज्ञान या विशेष उपकरणों के बिना प्राप्त है, यह विभिन्न क्षेत्रों जो endocannabinoid प्रभाव के तहत सी elegans व्यवहार का अध्ययन कर रहे हैं से वैज्ञानिकों के लिए उपयुक्त बना रही है. विधि भी अन्य अध्ययन मॉडल के लिए विस्तार योग्य है, यह विभिन्न लक्ष्यों के लिए उपयोगी बना रही है. मानक, यहाँ की सूचना के रूप में तैयार, सफलतापूर्वक एक तेजी से और विश्वसनीय क्रोमैटोग्राफी विधि है कि प्रभावी पता लगाने और एक reproduible तरीके से 2-एजी के परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है विकसित करने के लिए लागू किया गया है.

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Protocol

1. 1-AG-d5 तैयारी

नोट: मात्रा निर्धारण assays के लिए एक deuterated आंतरिक मानक के रूप में 1-AG-d5 प्राप्त करने के लिए, नीचे विस्तृत के रूप में प्रोटोकॉल का पालन करें.

  1. विभेदक संरक्षण
    1. केवल प्राथमिक alcohols की रक्षा करने के लिए, पहले जोड़ें 38 ग्लिसरॉल-डी के मिलीग्राम8 एक 10 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर और एक चुंबकीय उत्तेजक जोड़ें.
    2. एक 5 एमएल हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर anhydrous dichloromethane (डीसीएम) के 5 एमएल जोड़ें, और एक निष्क्रिय वातावरण उपज के लिए सूखी एन2 के साथ ट्यूब को भरने।
    3. आसुत एथिल एसीटेट से भरा एक उथले देवर फ्लास्क का उपयोग कर एक स्नान तैयार करें।
    4. स्नान के अंदर hermetically बंद प्रतिक्रिया ट्यूब फिट और धीरे धीरे विलायक जमे हुए है जब तक एथिल एसीटेट करने के लिए तरल एन2 जोड़कर इसे ठंडा.
      चेतावनी: तरल हिंसक कमरे के तापमान (आरटी) पर फोड़े और गंभीर जलता है जब आंखों और त्वचा से संपर्क कर सकते हैं.
    5. हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग करके 54 मिलीग्राम एनहाइड्रोस कोलिडीन जोड़ें।
      चेतावनी: Collidine अस्थिर है और एक बहुत मजबूत और अप्रिय खुशबू है.
    6. 70 मिलीग्राम टर्ट-ब्यूटिलडिमिथिल क्लोराइड जोड़ें और एक चुंबकीय उत्तेजक पर -78 डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए पूरे समाधान हलचल।
    7. 3 ज के बाद, RT पर गर्म करने के लिए प्रतिक्रिया छोड़ दें और एक अतिरिक्त 12 ज के लिए सरगर्मी रखने के लिए।
    8. अभिक्रिया को शमन करने के लिए 2 एमएल लवणीय ताक डालना।
    9. एक अलग कीप का उपयोग कर आसुत dichloromethane के 2 एमएल के साथ समाधान 3x निकालें, कार्बनिक निकालने हर बार बचत.
    10. तीन कार्बनिक निष्कर्षों का मिश्रण है और सोडियम सल्फेट पर उन्हें सूखी.
    11. विलायक अनुमानों से बचने के लिए ध्यान से एक वैक्यूम रोटरी वाष्पित्र में कम दबाव के तहत dichloromethane वाष्पित करें।
    12. स्थिर चरण के रूप में सिलिका जेल का उपयोग कर स्तंभ क्रोमैटोग्राफी द्वारा कच्चे मिश्रण को शुद्ध करें और 10% हेक्सेन/एथिल एसीटेट ग्रेडिएंट के रूप में, 100% हेक्सेन से शुरू होता है और 100% एथिल एसीटेट के साथ परिष्करण।
    13. उत्पाद युक्त भिन्नों का मिश्रण है और एक बेरंग तरल के रूप में शुद्ध 1-O,O,3-O-bis-(TBDMS) ग्लिसरोल-डी5 प्राप्त करने के लिए एक वैक्यूम रोटरी वाष्पित्र में कम दबाव के तहत विलायक को हटा दें।
  2. एस्टरीकरण
    1. जोड़ें 10 मिलीग्राम के 1-O,3-O-bis (TBDMS)-glycerol-d5 (पहले संश्लेषित) एक 10 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर और एक चुंबकीय उत्तेजक जोड़ें.
    2. एक 5 एमएल हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर anhydrous dichloromethane के 2 एमएल जोड़ें, और एक निष्क्रिय वातावरण उपज के लिए सूखी एन2 के साथ ट्यूब को भरने।
    3. एक बर्फ स्नान का उपयोग कर 0 डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान शांत।
    4. एक बहु मात्रा समायोज्य micropipette का उपयोग कर arachidonic एसिड के 36 मिलीग्राम जोड़ें और हलचल.
    5. 4-डाइमेथिलैमिनोपाइरिडीन के 15 मिलीग्राम जोड़ें और हलचल करें।
    6. एक बहु मात्रा समायोज्य micropipette का उपयोग कर N,N'-diisopropylcarbodiimide के 15 मिलीग्राम जोड़ें और हलचल.
    7. मिश्रण को 3 ज के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर अभिक्रिया करने दीजिए।
    8. 3 ज के बाद, RT पर गर्म करने के लिए प्रतिक्रिया छोड़ दें और एक अतिरिक्त 12 ज के लिए सरगर्मी रखने के लिए।
    9. अभिक्रिया को शमन करने के लिए 2 एमएल जल जोड़ें।
    10. एक अलग कीप का उपयोग कर आसुत dichloromethane (DCM) के 2 एमएल के साथ कार्बनिक समाधान 3x निकालें।
    11. एक ही ट्यूब में तीन कार्बनिक अर्क प्लेस और सोडियम सल्फेट पर उन्हें सूखी.
    12. विलायक अनुमानों से बचने के लिए ध्यान से एक वैक्यूम रोटरी वाष्पित्र में कम दबाव के तहत dichloromethane वाष्पित करें।
    13. स्थिर चरण के रूप में सिलिका जेल का उपयोग कर स्तंभ क्रोमैटोग्राफी द्वारा कच्चे मिश्रण को शुद्ध करें और 10% बढ़ते हेक्सेन/ एथिल एसीटेट ग्रेडिएंट, 100% हेक्सेन से शुरू और 50% हेक्सेन/50% एथिल एसीटेट के साथ परिष्करण।
    14. उत्पाद युक्त भिन्नों का मिश्रण है और एक पीला तरल के रूप में शुद्ध 1-O, 3-O-bis (टीबीडीएमएस)-2-AG-d5 प्राप्त करने के लिए एक वैक्यूम रोटरी वाष्पित्र में कम दबाव के तहत विलायक को हटा दें।
  3. सुरक्षा
    1. जोड़ें 15 मिलीग्राम की 1-O,O-bis (TBDMS)-2-AG-d5 (पहले संश्लेषित) एक 10 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर और एक चुंबकीय उत्तेजक जोड़ें.
    2. एक 5 एमएल हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर anhydrous THF के 2 एमएल जोड़ें, और एक निष्क्रिय वातावरण उपज के लिए सूखी एन2 के साथ ट्यूब को भरने।
    3. एक बर्फ स्नान का उपयोग कर 0 डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान शांत।
    4. एक हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर THF में 1 M tetrabutylammonium फ्लोराइड समाधान के 150 $L dropwise जोड़ें.
    5. प्रतिक्रिया आरटी के लिए गर्म करते हैं और 1 ज के लिए हलचल।
    6. 1 ज के बाद, अभिक्रिया को शमन करने के लिए 2 एमएल जल डालें।
    7. एक अलग कीप का उपयोग कर आसुत डाइक्लोरोमेथेन के 2 एमएल के साथ समाधान 3x निकालें।
    8. तीन कार्बनिक निष्कर्षों का मिश्रण है और सोडियम सल्फेट पर उन्हें सूखी.
    9. एक वैक्यूम रोटरी वाष्पित्र में कम दबाव के तहत dichloromethane वाष्पित करने के लिए एक पीले रंग के तरल के रूप में शुद्ध 1-AG-d5 प्राप्त करने के लिए.
  4. सिलिका जेल 60 एफ254 पूर्व लेपित एल्यूमीनियम शीट पर प्रदर्शन पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा सभी प्रतिक्रियाओं की निगरानी करें। 4-anisaldehyde के एक इथेनॉलिक समाधान के साथ धुंधला करने के बाद एक 254 एनएम यूवी लैंप के तहत बैंड कल्पना।

2. मानक स्टॉक की तैयारी और समाधान को मापने

  1. 1 000 पीपीएम मानक स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए 1 मिनट के लिए 1 एमएल में आंतरिक मानक 1-AG-d5 की 1 मिलीग्राम भंग करें।
  2. कीड़े में परिमाणीकरण के लिए इस्तेमाल किया 1,000 पीपीबी समाधान तैयार करने के लिए, पहले एक 10 पीपीएम समाधान तैयार: एक हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर शेयर समाधान के 10 डिग्री सेल्सियस ले और यह ACN के 990 $L जोड़कर 1 एमएल के अंतिम मात्रा में पतला.
  3. एक हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर चरण 2.2 में उत्पादित समाधान से 100 $L ले लो, और यह ACN के 900 $L जोड़ने के लिए 1,000 पीपीबी समाधान परिमाणीकरण के लिए इस्तेमाल किया प्राप्त करने के द्वारा एक अंतिम मात्रा के लिए पतला.
  4. पूरा solubilization सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक कदम के बीच 1 मिनट के लिए Sonicate. मानकों की सांद्रता और अखंडता को बनाए रखने के लिए -78 डिग्री सेल्सियस पर समाधानों को संग्रहीत करें। मानक समाधान का उपयोग किया जाता है के बाद, ऑक्सीकरण को रोकने के लिए शीशी बंद करने से पहले कुछ नाइट्रोजन प्रवाह.

3. सी एलिगेंस का विकास और रखरखाव

नोट: ई. कोलाई OP50 के साथ सूत्रकृमि विकास माध्यम (एनजीएम) आगर प्लेटों बीज और इन प्लेटों पर कीड़े का प्रचार।

  1. 17 ग्राम एगार के साथ 3 ग्राम नाक्कर मिलाएं।
  2. 2.5 ग्राम पेपटोन डालें, फिर 975 एमएल एच2हे जोड़ें।
  3. 50 मिनट के लिए ऑटोक्लेव, फिर फ्लास्क को 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  4. निम्नलिखित मिश्रण: 1 M CaCl2के 1 एमएल , 1 M MgSO4के 1 एमएल , 1 M KH2पीओ4 बफर के 25 एमएल (सभी जिनमें से पहले autoclaved किया गया है), और 1 एमएल के 5 mg/
  5. एक बाँझ वातावरण को बनाए रखने के दौरान, 60 मिमी पेट्री प्लेटों में एनजीएम समाधान वितरित, उनकी मात्रा के दो तिहाई करने के लिए प्लेटों को भरने। प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. एलबी गार प्लेट पर एक -80 डिग्री ग्लिसरोल स्टॉक से ई. कोलाई जीवाणु संस्कृति को स्ट्रीक करें। इसे प्लेट पर रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने दें।
  7. आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर तरल एलबी के 100 एमएल टीका करने के लिए एक ही कॉलोनी उठाओ।
    नोट: यह तनाव इस समय से अधिक स्थिर चरण तक पहुँच सकते हैं क्योंकि O.D. की जाँच करने के लिए आवश्यक नहीं है।
  8. संग्रहीत एनजीएम प्लेटों को निकालें, लेमिनर प्रवाह हुड में ढक्कन ों को हटा दें, और प्लेटों से अतिरिक्त नमी के वाष्पीकरण की अनुमति देने के लिए खुला छोड़ दें।
  9. एक बार प्लेटें सूख रहे हैं, एक Pasteur pippette का उपयोग करने के लिए फैला एप्पी 50 ई. कोलाई के केंद्र में बिना फैल के प्लेट के केंद्र में 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ने के लिए.
  10. OP50 ई. कोलाई लॉन छोड़ आरटी पर रात भर बढ़ने के लिए या 8 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर.
  11. hypochlorite उपचार या "ब्लीचिंग" (धारा 4) द्वारा प्राप्त वांछित संख्या कीड़ा भ्रूण जोड़ें.
    नोट: कीड़े के अलावा से पहले आरटी करने के लिए प्लेटों को शांत।

4. सी elegans संस्कृतियों तुल्यकालन के लिए ब्लीचिंग तकनीक

  1. 6 सेमी एनजीएम प्लेटों पर बीज और खंड कीड़े।
  2. कीड़े 2-3 दिनों के लिए बढ़ छोड़ थाली पर अंडे और gravid वयस्कों की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए.
  3. एक बार पर्याप्त अंडे/वयस्क होने पर, M9 का 5 एमएल प्लेट पर डाल दें।
  4. कीड़े एक गिलास पिपेट का उपयोग कर एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरण।
  5. 2,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए ट्यूब सेंट्रीफ्यूज और कीड़े गोली।
  6. M9 के अधिकांश बाहर सक्शन, कीड़ा गोली की अशांति से बचने.
  7. ब्लीचिंग समाधान के 3 एमएल जोड़ें (2:1:1 NaOH का अनुपात:NaOCl:H2हे).
  8. 5 मिनट के लिए या बरकरार वयस्क कीड़े की संख्या कम हो जाती है जब तक समाधान मिश्रण करने के लिए धीरे उलटा.
    चेतावनी: 5 मिनट से अधिक के लिए ब्लीच न करें।
  9. 2,000 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और कीड़ा गोली परेशान किए बिना विरंजन समाधान के अधिकांश चूषण।
  10. M9 के 15 एमएल जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण.
  11. 1 मिनट के लिए 2000 x ग्राम पर फिर से सेंट्रीफ्यूज।
  12. कीड़ा गोली परेशान किए बिना M9 के अधिकांश बाहर सक्शन.
  13. 4-10-4.12 एक या दो बार चरणों को दोहराएँ.
  14. ताजा M9 के 5 एमएल जोड़ें और आंदोलन.
  15. अंडे कोमल रॉकिंग के साथ रात भर अंडे से निकलते हैं।

5. कृमि नमूना तैयारी

  1. ब्लीचिंग प्रक्रिया द्वारा प्राप्त N2 भ्रूण 20 डिग्री सेल्सियस पर M9 बफर (5 एमएल एक 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में) में रात भर से निकलते हैं।
  2. 2000 x ग्रामपर 2 मिनट के लिए ट्यूब centrifuging द्वारा सिंक्रनाइज़ L1s फसल .
  3. M9 बफर 1x के साथ कीड़े धो लें, तो जीना L1 कीड़े की संख्या मात्रा निर्धारित.
  4. एनजीएम प्लेटों (10 सेमी व्यास) में लगभग 10,000 कीड़े बोए जाते हैं, जिसमें 1 एमएल ओपी 50 ई. कोलाई (पहले सूख जाता था)।
  5. 20 डिग्री सेल्सियस पर 48 एच के लिए प्लेटों को तब तक इनक्यूबेट करें जब तक किड़े एल 4 चरण तक नहीं पहुंच जाते।
  6. एक 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ठंड M9 बफर का उपयोग कर कीड़े फसल, उन्हें 1x धोने, तो और उन्हें एक 1.5 एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
  7. 1 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कीड़े गोली, supernatant के अधिकांश को खत्म करने, तरल नाइट्रोजन में ट्यूब विसर्जित, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

6. लिपिड निष्कर्षण

  1. बर्फ पर N2 से संबंधित जमे हुए कीड़ा छर्रों के लगभग 100 $L thaw, मेथनॉल के 1.3 एमएल जोड़ने के लिए, और 4 मिनट के लिए नमूना sonicate।
  2. क्लोरोफॉर्म के 2.6 एमएल जोड़ें, और 0.5 एम केसीएल/0.08 एम एच3पीओ4 के अंतिम अनुपात में 1:2:1, आंतरिक मानक 1-एजी-डी5के 1,000 पीपीबी, और 50 डिग्री सेल्सियस की अंतिम सांद्रता में एक एंटीऑक्सीडेंट एजेंट के रूप में butylated hydroxytoluene जोड़ें।
  3. 1 मिनट के लिए नमूने भंवर और बर्फ पर 15 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक पानी स्नान में sonicate।
  4. चरण जुदाई प्रेरित करने के लिए 2,000 x g पर 10 मिनट के लिए नमूने 2x और अपकेंद्रित्र।
  5. निचले चरण को एकत्र कीजिए और इसे एक स्वच्छ ट्यूब में एकत्र करें, इसे नाइट्रोजन के नीचे सुखा लें, और एसीएन के 100 डिग्री एल में ठोस अवशेषों को पुन: निलंबित करें।

7. HPLC-MS/MS द्वारा Endocannabinoid विश्लेषण

  1. तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करें एक ईएसआई ट्रिपल चौगुले जन स्पेक्ट्रोमीटर के साथ युग्मित का पता लगाने और सूत्रकृमि नमूनों से 2-AG मात्रा निर्धारित करने के लिए।
  2. उलटे चरण HPLC के लिए निम्न अनुपात का उपयोग करें: से 0.0-0.5 मिनट H2O:ACN (40:60), 0.5-6.5 मिनट एच2O:ACN (40:60) करने के लिए (25:75), 6 5-7.5 मिनट एच2ओ:ए.सी.एन.(25:75), 7.5-8.0 मिनट एच2ओ:ए.सी.एन.(25:75) से (40:60), 8.0-12.0 मिन एच2ओ: ए.सी.एन. (40:60)।
  3. 40 डिग्री सेल्सियस पर स्तंभ तापमान बनाए रखने और autosampler ट्रे तापमान 10 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट करें।
  4. निम्न आयनन शर्तें सेट करें: धनात्मक-आयन मोड; सुखाने गैस (एन2) तापमान ] 300 डिग्री सेल्सियस; सुखाने गैस प्रवाह दर $ 10 L/min; नेबुलाइज़र दबाव ] 10 UA; और टोपी. वोल्टता - 4 केवी.
  5. analyte का पता लगाने के लिए, निम्नलिखित संक्रमण के साथ MRM का उपयोग करें: 379.2 m/z करने के लिए 289.2 m/z 2-AG के लिए; और 384.2 m/z करने के लिए 289.2 m/z के लिए 1-AG-d5.

8. कीड़े में Endocannabinoid परिमाणीकरण

  1. deuterated आंतरिक मानक 1-AG-d5 का उपयोग करें और आंतरिक मानक करने के लिए analyte के शिखर क्षेत्र अनुपात की गणना।
  2. निम्न संक्रमण का उपयोग करें: 384.2 m/z करने के लिए 287.2 m/z 2-AG के लिए; और 379.2 m/z करने के लिए 287.2 m/z के लिए 1-AG-d5.
  3. मानक की एकाग्रता मूल्य का उपयोग कर deuterated मानक के शिखर क्षेत्र अनुपात की तुलना करके अंतर्जात 2-AG की एकाग्रता की गणना.

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Representative Results

एक समस्थानिक रूप से लेबल किए गए एनालॉग को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डी 8-ग्लिसरॉल और अराकिडोनिक अम्ल से 3-चरणीय कृत्रिम विधि का उपयोग करके सफलतापूर्वक संश्लेषित किया गया था (चित्र 2, चित्र 3)। ये कदम सरल हैं और परिष्कृत उपकरण, विशेष रूप से नियंत्रित स्थितियों, या महंगी अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं है. इस प्रकार, इस विधि मजबूत है और सफलतापूर्वक विभिन्न फैटी एसिड युक्त मोनोएसाइग्लिसराइड्स संश्लेषित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

1-AG-d5 संरचनात्मक परमाणु चुंबकीय स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर विशेषता थी. 1 एच एनएमआर ने 5.44 पीपीएम से 4.93 पीपीएम तक की विशेषता बहुगुणित को दिखाया, जो आर्किडोनोइल चेन के आठ विनाइल प्रोटॉनों के लिए एकीकृत होता है और 2.40 पीपीएम पर ट्रिपल होता है, जो अल्फा स्थिति के दो प्रोटॉनों को कार्बनिल समूह के अनुरूप करता है। 2डी एनएमआर में, ग्लिसरोल भाग के पांच ड्यूटेरियम के लिए 2.9 पीपीएम से 2.7 पीपीएम बहुश्य को देखना भी संभव है।

रासायनिक संश्लेषित 1-AG-d5 सी elegans नमूनों में एक आंतरिक मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया था. मानक निष्कर्षण से पहले नमूनों में जोड़ा गया था तो अंतर्जात लिपिड के साथ निकाला, एक सरल विधि Folch24से अनुकूलित का उपयोग कर. इस संशोधित विधि मानक के एक उच्च वसूली मूल्य प्रदान करता है, के रूप में HPLC परिमाणीकरण द्वारा दिखाया गया है.

विधि संक्रमण का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था 1) 384.2 m/z करने के लिए 287.2 m/z के लिए 2-AG और 2) 379.2 m/z करने के लिए 287.2 m/z करने के लिए 287.2 m/z के लिए 1-AG-d5, जिसमें ग्लिसरॉल अणु खो रहे हैं (चित्र 4) . पता लगाने की सीमा (एलओडी) और परिमाणीकरण (LOQ) मानक के लिए गणना की गई एक अंशांकन वक्र का उपयोग कर, के मूल्यों में जिसके परिणामस्वरूप 5 पीपीबी और 16.6 पीपीबी, क्रमशः. मानक के लिए प्रतिधारण समय 6.8 मिनट था.

सी एलिगन नमूनों से 2-AG अंतर्जात सफलतापूर्वक पता लगाया गया था और रासायनिक संश्लेषित 1-AG-d5 HPLC-MS/MSकाउपयोग कर के साथ आइसोटोपिक कमजोर पड़ने द्वारा परिमाणित किया गया था ।

के बाद से नमूनों में deuterated मानकों की मूल सांद्रता 1 और 3 प्रत्येक 1,000 पीपीबी थे, शिखर क्षेत्र अनुपात से यह नमूना 1 और नमूने के लिए 360 पीपीएम के लिए 340 पीपीबी पर 2-एजी के अंतर्जात एकाग्रता की गणना करने के लिए संभव था 3, 350 पीपीएम के एक औसत उपज ( तालिका 1)

Figure 1
चित्र 1: संश्लेषण का सारांश, कीड़ा नमूना, और परिमाणीकरण. अंतर्जात 2-AG के सफल परिमाणीकरण को प्राप्त करने के लिए, यह एक तीन कदम अनुक्रम का उपयोग कर अपने deuterated अनुरूप संश्लेषित करने के लिए आवश्यक था. बाद में, यह कीड़ा के नमूने में जोड़ा गया था, निकाला, और HPLC-MS/MS. द्वारा विश्लेषण एक आंतरिक मानक के रूप में इस्तेमाल किया, 1-AG-d5 के सिंथेटिक उपकरण अंतर्जात चयापचय मात्रा में इस्तेमाल किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: 1-AG-d5प्राप्त करने के लिए सिंथेटिक योजना | ड्यूरेट एनालॉग के 10 मिलीग्राम का एक द्रव्यमान तीन-चरण विधि का उपयोग करकेप्राप्त किया गया था जिसमें 1) ग्लिसरॉल-डी 8 की सुरक्षा, 2) अराचिडोनिक एसिड के साथ एकcylation, और 3) deprotection. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: समस्थानिक रूप से लेबल किए गए 2-AG एनालॉग की रासायनिक संरचना. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: 1-AG-d5 और 2-AG के परिमाणीकरण के लिए चयनित विखंडन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र5: HPLC क्रोमैटोग्राम के लिए 1-AG-d5 और 1-AG शुद्ध मानकों और एक कीड़ा नमूने में आंतरिक मानकों के रूप में. यह प्रतिधारण समय का विश्लेषण करने के लिए और देखना संभव था कि 1) कीड़ा अंतर्जात नहीं प्रतीत होता है 1-AG और 2) यह केवल 2-AG होगा, लेकिन मानक 1-AG-d5 अभी भी isoito कमजोर पड़ने से परिमाणीकरण के लिए एक अच्छा विश्लेषणात्मक मानक के रूप में काम करेंगे. इस्तेमाल किए गए संक्रमण थे: 384.2 m/z करने के लिए 287.2 m/z के लिए 2-AG, और 379.2 m/z करने के लिए 287.2 m/z के लिए 1-AG-d5. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1-एजी-डी5 2-एजी अनुपात (2-AG/1-AG-d5)
नमूना 1 71964.74 210616.08 0.34
नमूना 3 74311.36 205648.43 0.36

तालिका 1: deuterated मानक और अंतर्जात 2-AG के लिए पीक क्षेत्र अनुपात. अनुपात 2-एजी और 1-AG-d5 के शिखर क्षेत्रों के बीच एक भागफल के रूप में गणना की गई, क्रमशः दो अलग नमूने के लिए, दोनों deuterated मानक के साथ निष्कर्षण से पहले जोड़ा.

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Discussion

एंडोक्नाबिनोइड लिपिड का एक वर्ग है जिसे सी एलिगन्स7में डाउर गठन के विनियमन में फंसाया गया है . अधिक विशेष रूप से, पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड (पीयूए) का संश्लेषण कोलेस्ट्रॉल की तस्करी और कीड़े के प्रजनन विकास के लिए महत्वपूर्ण है। यहां यह पता चला है कि 2-एजी, एंडोकेनाबिनोइड युक्त एक अराकिडोनिक एसिड, कीड़े में अपने सामान्य चक्र के लिए डाउर लार्वा को आराम करने के लिए जिम्मेदार है जो कोलेस्ट्रॉल चयापचय7को खराब कर दिया है।

कोलेस्ट्रॉल की तस्करी और अन्य जैविक प्रक्रियाओं की वृद्धि में 2-AG के हाल ही में पता चला महत्व को देखते हुए और कैसे थोड़ा कैसे लिपिड इस प्रक्रिया को प्रभावित के बारे में जाना जाता है, इस endocannabinoid के लिए एक विश्वसनीय पहचान विधि आवश्यक है. deuterated एनालॉग प्राप्त करने के लिए इस सरल और मजबूत सिंथेटिक विधि का सफल विकास 1-AG-d5 इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है।

मोनोऐसाइग्लिसरॉल की मात्रा निर्धारित करने के लिए सूचित किए गए तरीकों में से अधिकांश में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विश्लेषणात्मक मानकों का उपयोग शामिल है, जो आमतौर पर नियमित भंडारण की स्थिति के तहत महंगे और अस्थिर होते हैं। यह उन्हें शोधकर्ताओं, जो मानकों और ताजा शेयरों की बड़ी मात्रा की आवश्यकता के लिए असुविधाजनक बनाता है. वे भी कम बजट प्रयोगशालाओं के लिए पहुँच से बाहर हैं. हालांकि, इस विधि और अधिक सुलभ शुरू सामग्री का उपयोग कर मानक के संश्लेषण का प्रस्ताव द्वारा इस बाधा को दूर.

यह भी उल्लेखनीय है कि अन्य सूचित तरीकों के विपरीत (जो 2-प्रतिस्थापित मोनोऐग्लिसरोलॉल के ड्यूरेटेड विश्लेषणात्मक मानकों का उपयोग करते हैं जो कई परिस्थितियों में acyl-migration पीड़ित होते हैं, ताकि दो क्रोमैटोग्राफी चोटियों को देखा और रिश्तेदार को प्रभावित किया जाए समस्थानिक तनुता25द्वारा परिमाणीकरण , इस विधि कुशलतापूर्वक एक 1-substituted deuterated विश्लेषणात्मक मानक है, जो एक एकल समावयव है और acyl-migration से गुजरना नहीं है का उपयोग करता है.

सिंथेटिक विधि सरल है और कोई परिष्कृत शर्तों की आवश्यकता है, यह किसी भी प्रयोगशाला न्यूनतम उपकरण होने के लिए आदर्श बनाने, बजट, और reactants के लिए उपयोग. यह भी एक सरल तकनीक है कि किसी भी क्षेत्र में काम कर रहे वैज्ञानिक द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है, कार्बनिक संश्लेषण में विशेष प्रशिक्षण के लिए आवश्यकता के बिना. कीड़ा नमूना तैयारी पारंपरिक विधि है, आगे जटिलताओं के बिना. अंत में, लिपिड निष्कर्षण विधि अंतिम नमूने प्राप्त करने के लिए है Folch प्रोटोकॉल से एक संशोधन है24 कि बेहतर वसूली मूल्यों के लिए अनुमति देता है, क्योंकि यह क्रोमैटोग्राफी स्तंभ शोधन की आवश्यकता नहीं है.

महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि नमूना तैयारी और लिपिड निष्कर्षण मानक के अच्छे और पता लगाने योग्य वसूली को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त रूप से प्रदर्शन कर रहे हैं। यह भी महत्वपूर्ण है 1) ताजा स्टॉक समाधान मासिक उत्पादन मानक की स्थिति बनाए रखने के लिए और 2) NMR-स्पेक्ट्रोस्कोपी या LC-MS द्वारा जांच है कि मानक अभी भी शुद्ध है और ऑक्सीकरण या गिरावट नहीं आया है. इस तकनीक की केवल सीमा अंतर्जात हो सकता है कि अन्य अध्ययनों के लिए अपने विस्तार में निर्भर करता है 2-एजी प्रस्तुत LOQ की तुलना में कम सांद्रता. इस मामले में, विधि एकाग्रता सीमा के बीच गिर जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए संशोधित किया जाना चाहिए.

प्रोटोकॉल के दौरान विफलता के मामले में जिसमें 1) मानक का कोई दृश्यमान क्रोमैटोग्राफी संकेत नहीं है या 2) निष्कर्षण की अपेक्षा कम होने के बाद मानक का वसूली मूल्य, नमूना तैयारी और लिपिड निष्कर्षण को दोहराने की सिफारिश की जाती है। चूंकि सिंथेटिक मार्ग में एक संरक्षित ड्यूरेटेड ग्लिसरॉल बिल्डिंग ब्लॉक का संश्लेषण शामिल है जो अंत में अंतिम चरण में अराकिडोनिक एसिड के साथ acylateed है, इस विधि को अन्य मोनोऐसिग्लिसरोल के ड्यूरेटेड मानकों के संश्लेषण के लिए विस्तारित किया जा सकता है, डाइसाइल्ग्लिसरोलॉल, फॉस्फोलिपिड, और संरचनात्मक रूप से संबंधित चयापचय।

संक्षेप में, इस नई प्रक्रिया का पता लगाने और 2-AG, जो सी elegansमें इस endocannabinoid की भूमिका के बारे में अनुत्तरित सवालों में से कुछ को संबोधित करने में मदद मिलेगी की मात्रा का पता लगाने के लिए एक सरल और reproducible विधि का वर्णन करता है.

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

यह काम Agencia Nacional de Promoci]n Cient]fica y Tecnol]gica (ANPCyT, PICT 2014-3693) से एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. J.F.d.L., G.P., और B.H.C. CONICET से साथी हैं. D.d.M. और G.R.L. CONICET के अनुसंधान कैरियर के सदस्य हैं. हम LC-MS/MS विश्लेषण और उपयोगी चर्चा के लिए गोंजालो Lamberto (INMET) के लिए आभारी हैं. वीडियो शूटिंग और संपादन Ramiro Ortega और मारिआ Soledad Casasola द्वारा किया गया है Direccien de Comunicaci-n de la Ciencia, Facultad de Ciencia पोलेटिका y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario में Rosario, अर्जेंटीना.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-dimethylaminopyridine Sigma-Aldrich 107700 reagent grade, 99%
antioxidant BHT Sigma-Aldrich W21805
Arachidonic acid Sigma-Aldrich 10931
Glycerol-d8 Sigma-Aldrich 447498
Mass detector Triple Quadrupole Thermo Scientific TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide Sigma-Aldrich D125407
NMR spectrometer Bruker Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column Thermo Fisher 25003-052130 C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride Sigma-Aldrich 190500 reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride Sigma-Aldrich 216143 1.0M in THF
UHPLC System Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol Caenorhabditis Genetics Center (CGC)

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References

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जैव रसायन अंक 151 endocannabinoids सी elegans,संश्लेषण deuterated एनालॉग 2-AG dauer MAGs HPLC-MS/MS समस्थानिक तनुता परिमाणीकरण
<em>Caenorhabditis elegans</em> में 2-Arachidonoylglycerol के क्वांटाइज के लिए एक ड्यूरेटेड मानक का संश्लेषण
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Fernández de Luco, J., Prez,… More

Fernández de Luco, J., Prez, G., Hernández Cravero, B., de Mendoza, D., Labadie, G. R. Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (151), e59882, doi:10.3791/59882 (2019).

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