Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man udfører hurtige lave omkostninger luciferase analyser på medium-gennemløb ved hjælp af en insulin-linked gaussia luciferase som en proxy for insulinsekretion fra beta celler. Analysen kan udføres med de fleste luminescens plade læsere og multikanalspipetter.
Abstract
Udførelse af antistof baserede analyser for udskilt insulin post-prøve samling kræver normalt et par timer til en dag af assay tid og kan være dyrt, afhængigt af den specifikke analyse. Udskilles luciferase analyser fremskynde resultater og sænke assay cost per prøve betydeligt. Her præsenterer vi en relativt underudnyttet tilgang til at måle insulin sekretoriske aktivitet fra bugspytkirtel β celler ved hjælp af Gaussia luciferase genetisk indsat i C-peptid. Under proteolytisk behandling af proinsulin, er C-peptid exciteret frigive luciferase i insulin sekretorisk vesikel, hvor det er co-udskilles med insulin. Resultaterne kan opnås inden for få minutter efterprøve udtagning på grund af hastigheden af luciferase assays. En begrænsning af analysen er, at det er en relativ måling af insulinsekretion og ikke en absolut kvantitation. Men denne protokol er økonomisk, skalerbar, og kan udføres ved hjælp af de fleste standard luminescens plade læsere. Analoge og digitale multikanalpipetter letter flere trin i analysen. Mange forskellige eksperimentelle variationer kan testes samtidigt. Når en fokuseret sæt betingelser er besluttet, bør insulinkoncentrationer måles direkte ved hjælp af antistof-baserede analyser med standard kurver for at bekræfte luciferase assay resultater.
Introduction
Den metode præsenteret her tillader insulinsekretion fra en genetisk modificeret beta cellelinje, der skal analyseres hurtigt og billigt i 96-brønd-plade format. Nøglen til denne protokol er en modificeret version af insulin med den naturligt udskillede gaussia luciferase (gluc, ~ 18 kDa) indsat (Se figur 1) ind i C-peptid til at generere insulin-gaussia (insgluc)1,2. Andre større proteiner, såsom gfp (~ 25 kDa), er med succes blevet indsat i C-peptid af insulin og udstillet den forventede post-translationel behandling fra proinsulin-gfp til insulin og gfp-C-peptid3,4. For analysen i denne protokol, er gluc blevet codon-optimeret til pattedyr udtryk og to mutationer er blevet indført for at forbedre glød-lignende kinetik5,6. Flere kombinationer og replikater af behandlingsbetingelser kan let testes i 96-brønd-plade format og sekretions resultaterne kan opnås umiddelbart efter forsøget.
En stor fordel, som tidligere nævnt2, er den lave pris på denne luciferase-baserede sekretion måling (< $0,01/Well), som adskiller det fra de relativt højere omkostninger og tekniske aspekter af enzym-linked immunosorbent analyser ( > $2/Well) og homogen tids-løst fluorescens (HTRF) eller anden Förster resonans energi Transfer (FRET)-baseret antistof (> $1/Well) assays. I sammenligning med disse antistof baserede assays, som måler koncentrationen af insulin ved at referere til en standardkurve, måler InsGLuc-analysen sekretorisk aktivitet som en relativ sammenligning for at kontrollere brønde på pladen. Derfor kræver ethvert eksperiment, at der medtages passende kontrol. Denne sondring er en byttehandel for at muliggøre hurtige og billige målinger. Insgluc-sekretionen er imidlertid påvist at være stærkt korreleret med insulinsekretion målt ved ELISA1,2. Denne teknologi er blevet skaleret til høj-gennemløb screening1,2,7 og har ført til identifikation af nye modulatorer af insulinsekretion, herunder en spændings-gated kalium kanal inhibitor7 samt en naturlig produkt hæmmer af β cellefunktion, chromomycin a28. Brugen af InsGLuc er mest velegnet til forskere, der planlægger at løbende teste mange forskellige behandlingsbetingelser for deres indvirkning på insulinsekretion. I opfølgende eksperimenter er det nødvendigt at gentage de vigtigste fund i en forældre β cellelinje, og optimalt i murine eller humane Holme, og måle insulinsekretion ved hjælp af en antistof-baseret assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af reagenser, medier og buffere (tabel 1)
- Forbered MIN6 komplette medier i 500 mL høj glukose (4,5 g/L) Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med følgende tilsætningsstoffer: 15% føtalt kvægserum (FBS), 100 enheder/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 292 μg/mL L-glutamin og 50 μM β-mercaptoethanol.
Bemærk: den stabile cellelinje i dette tilfælde vedligeholdes i 250 μg/mL G418 antibiotikum. - Forbered Krebs-ringer bicarbonat buffer (KRBH) ved at lave en opløsning, der indeholder 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7,4), 24 mM NaHCO3, 1 mm mgcl2, 2 mm CaCl2, og 1 mg/ml radioimmunassay-grade kvægserum albumin (BSA). Glucose skal tilsættes, når det er specificeret fra en 2 M bestand.
Bemærk: KRBH bruges til at inkuleere cellerne med og uden stimulering for at vurdere insulin og/eller Gaussia luciferasesekretion. - Klargør coelenterazin (CTZ) stamopløsning på følgende måde. Der tilberedes syrnet methanol ved tilsætning af 106 μL koncentreret HCl til 10 mL methanol. Dernæst opløses lyofiliseret CTZ i syrnet methanol ved 1 mg/mL og opbevares ved-80 °C i skruelåg.
Bemærk: disse bestande bevarer tilstrækkelig aktivitet i rutinemæssige luciferase assays, selv efter 1 år med korrekt opbevaring. - Forbered Gaussia luciferase (GLuc) analyse buffer baseret på litteratur9 samt patentinformation10 til støtte i Half-Life af gaussia luciferase assay i 96 brønd plade format. Brug formlen: 25 mM Tris pH 8,5 mM EDTA, 5% glycerol, 1 mg/mL na2po4, 300 mm natriumascorbat, 200 mm na2så3 i vand. Fryselagre ved-20 °C. Efter optøning opbevares bufferen ved 4 °C.
- Til klargøring af Gaussia luciferase-arbejdsopløsning tilsættes 4,2 μL/mL af 1 mg/mL (2,36 mM) CTZ-stamopløsning til GLuc-analyse buffer. Dette resulterer i en 2x arbejdsopløsning på 10 μM CTZ, som vil have en 5 μM slutkoncentration i analysen.
2. kultur af insgluc MIN6 celler og såning til sekretion analyser
- Til kultur MIN6 celler, trypsinize og frø cellerne en gang om ugen ved hjælp af standard cellekultur teknikker. Skift medie på cellerne hver anden til tre dage. Inkluder passende selektions antibiotikum, såsom 250 μg/mL G418 i mediet.
- For at give et tilstrækkeligt antal celler ugentligt til eksperimenter, vedligeholde cellerne i T75 kolber. Såning 6 x 106 celler pr. T75 i 10 ml medier vil typisk give 30 x 106 til 40 x 106 celler i alt pr. T75 efter 7 dages kultur.
- For at forberede celler til plating i 96-brønd plader, vask en konfluent T75 af InsGLuc MIN6 celler to gange med PBS og tilsæt 2 mL trypsin. Der inkubeeres ved 37 °C i ~ 5 min, eller indtil cellerne dissocierer fra kolben. Bestem celle koncentrationen pr. milliliter.
- Cellerne i det komplette medie fortyndes til 1 x 106 celler/ml, hvilket resulterer i 1 x 105 celler i 100 μl pr. brønd i en 96-brønd plade. Cellerne skal være tilstrækkeligt konflydende for analysen efter 3 – 4 dage.
Bemærk: for at forlænge kultur perioden kan halvdelen af celle koncentrationen være belagt. Der kræves ikke medieændringer før analysens dag, medmindre cellerne skal underkastes eksperimentelle behandlinger.
- Cellerne i det komplette medie fortyndes til 1 x 106 celler/ml, hvilket resulterer i 1 x 105 celler i 100 μl pr. brønd i en 96-brønd plade. Cellerne skal være tilstrækkeligt konflydende for analysen efter 3 – 4 dage.
3. glukose-stimuleret Gaussia luciferasesekretions analyse
- På analysens dag forberedes nok KRBH til eksperimentet (trin 1,2). Der kræves et minimum på 50 mL KRBH pr. 96-brønd plade, og der skal derfor tilberedes mindst 75 mL for at sikre tilstrækkelig buffer til forsøget. Forbered ekstra buffer, hvis forskellige kombinationer af stof behandlingsbetingelser vil kræve KRBH til fortynding.
- Forbered et reservoir med glucose-fri KRBH. Dechifrere mediet fra 96-brønd pladen (s) ved hurtigt at invertere pladen over en laboratorie vask og derefter blot fast på en stak papirservietter for at fjerne overskydende medium.
- Brug enten en elektronisk eller manuel 8-kanals pipette til at pipettere 100 μL/brønd KRBH fra reservoiret på tværs af 96-brønd pladen (-erne). Gentag for i alt to skyller.
- (Valgfrit trin i akutte sammensatte behandlinger) Hvis du ikke udfører lægemiddelbehandlinger, skal du fortsætte med trin 3,5 og 3,6 uden ændringer. For at teste virkningerne af små molekyler på insulinsekretion, kan forbindelser tilsættes til cellerne i forinkubations perioden, stimulering periode, eller begge dele.
- En teknik er at tilføje forbindelser i batch til KRBH i 1,5 mL rør og bruge en justerbar 8-kanals digital pipette til at overføre Drug-KRBH fra rørene til celler i 96-brønd plader.
Bemærk: Hvis der ikke findes en justerbar pipette, kan der laves en replika 96-brønd plade af Drug-KRBH, og en 8-kanals standard pipette kan bruges til at overføre buffer. Yderligere modifikationer af behandlings paradigmet kan foretages til behandling af celler i 24 timer i medier før analysen, som tidligere beskrevet1,8.
- En teknik er at tilføje forbindelser i batch til KRBH i 1,5 mL rør og bruge en justerbar 8-kanals digital pipette til at overføre Drug-KRBH fra rørene til celler i 96-brønd plader.
- Der tilsættes 100 μL KRBH med den ønskede koncentration af glucose eller forbindelser, og skålen anbringes i en 37 °C-inkubator i 1 time.
Bemærk: afhængigt af den eksperimentelle layout, er det yderst nyttigt at have en elektronisk multikanalpipette, der tillader overgangen kanal afstande fra en kolonne af otte 1,5-mL rør til 8 rækker af en 96-brønd plade. - Efter 1 h forinkubation, dekanteres buffer i vasken og blot fast på papir håndklæde. Tilsæt 100 μL glucosefri KRBH pr. brønd for at skylle den akkumulerede baggrund af Gaussia luciferase væk. Pladen forrådnede igen, og der tilsættes kontrol-og stimulerende forhold til pladen ved 100 μL pr. brønd. Skålen anbringes i en 37 °C-inkubator i 1 time.
- Saml forsigtigt 50 μL supernatanten ved hjælp af en multikanalpipette, skiftende spidser mellem behandlings forholdene efter behov, og Overfør supernatanten til en ren, uigennemsigtig hvid 96-brønd-analyse plade.
Bemærk: hvid-walled Clear-Bundplader kan bruges, hvis det er nødvendigt, selv om en betydelig mængde af luciferase signal vil gå tabt. - Efter opsamling af 50 μL KRBH supernatant kan prøven straks analyseres. Om nødvendigt forsegles og opbevares prøverne ved 4 °c i et par dage (gluc-aktivitet halveringstiden ~ 6 dage) eller-20 °c i op til en måned11,12.
4. udskillede Gaussia luciferase-assay
- Til klargøring af GLuc-analysens arbejdsopløsning skal den påkrævede mængde CTZ-stamopløsning (4,2 μL/mL) afpipetteres i GLuc-analyse buffer. For at forhindre opvarmning af CTZ, pipette CTZ hurtigt ved-80 °C fryser eller holde røret på tøris.
- Ved hjælp af en elektronisk multikanalpipette tilsættes hurtigt 50 μL af GLuc-analysens arbejdsopløsning pr. brønd på tværs af 96-brønd skålen, der indeholder de indsamlede KRBH-supernatanter. Hvis der er nogen dråber på siderne af nogen brønde, kort Drej pladen i en bord-top swing-skovl centrifuge.
- Læs luminescens i en egnet plade læser inden for få minutter og læs hver brønd med en 0,1-integrationstid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at måle resultaterne af analysen under kontrolbetingelser, en simpel glukose dosis-respons kurve eller en stimulation ved hjælp af diazoxid paradigme kan fuldføres. I tilfælde af førstnævnte bør præ-inkuering af cellerne i 1 time i glukose frie tilstande efterfulgt af behandling i 1 time med stigende glukose koncentrationer resultere i meget lidt sekretions aktivitet ved og under 5 mM, mens øget sekretion observeres over 8 mM glucose (figur 2). Stimulation med 35 mM KCl fungerer også som en positiv kontrol for stimuleret sekretion. Inklusion af sekretions modulerende lægemidler i stimulerings perioden bør give den forventede hæmning eller potensering af den udskillede GLuc-aktivitet (figur 3). For eksempel binder diazoxid KATP kanalen og forhindrer det i at lukke ved forhøjet [ATP/ADP] ratio, blokerende membran depolarisering og forhindre sekretion13. Phorbøl estere som para-methoxyamphetamine (PMA) aktivere protein kinase C (PKC) og er kendt forstærkere af insulinsekretion14. Endelig aktiverer stimulering med 1 μM epinephrin α2a-adrenerge receptorer, som igen aktiverer det heterotrimkemiske G-protein kompleks GI, hæmmer membran depolarisering og insulinsekretion15. Det er vigtigt at erkende, at mens MIN6 celler er en udødelig cellelinje, de begynder at miste korrekt glukose-induceret insulinsekretion svar (såsom venstre-forskydning af respons kurven) efter forlænget passage16. Af denne grund, det er god praksis at rutinemæssigt kultur alle MIN6 cellelinjer i op til otte uger (opdeling én gang om ugen), før du starter forfra fra flydende kvælstof bestande.
Figur 1: Beskrivelse af InsGLuc-indberetteren. (A) for det første blev der genereret en stabil β-cellelinje (i dette tilfælde MIN6 celler), der udtrykte insulin-gaussia transgen fra rotte insulin promotoren. (B) det fulde protein syntetiseres og emballeres i insulin granulat sammen med endogene insulin. Prohormone convertaser kløver peptid, angivet med asterisker. C) det forarbejdede insulin og gaussia udskilles samtidig, og luciferaseaktiviteten påvises ved tilsætning af ctz i en ATP-uafhængig, iltafhængig reaktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: InsGLuc-indberetteren er en trofast proxy for insulinsekretionen fra MIN6 beta celler. (A) MIN6 InsGLuc-cellers respons på øget Glucosekoncentration og KCl (35 mm) med gaussia luciferasesekretion. Data er den gennemsnitlige fold luciferaseaktivitet ± SE sammenlignet med 0 mM glucose betingelser for tre uafhængige eksperimenter. *, P < 0,05. Tallet er blevet ændret med tilladelse fra Kalwat et al. ACS sensorer 20161. © 2016 American Chemical Society. (B) InsGLuc reporter i MIN6 celler udviser den forventede sekretoriske respons på diazoxid (DZ) paradigme, hvor 250 μM DZ behandling holder KATP kanal åben, blokerende membran depolarisering medmindre ekstracellulære KCl (35 mm) er forudsat at fremkalde den "udløsende" calcium tilstrømning. Yderligere tilsætning af glucose (20 mM) under DZ + KCl tilstand afslører den metaboliske amplifikation af sekretion, der opstår uden yderligere stigninger i calcium tilstrømning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: medtagelse af sekretions modulerende forbindelser under glukose stimulerer InsGLuc-sekretionen. InsGLuc MIN6 celler belagt i 96-godt format som beskrevet blev forinkueret i glucose-fri KRBH for 1 h. cellerne blev derefter behandlet med eller uden 20 mM glucose ved tilstedeværelse af dimethylsulfoxid (DMSO) (0,1%), KCl (35 mM), diazoxid (250 μM), PMA (100 nM) eller epinephrin (1 μM) i 1 h. søjlediagram repræsenterer middelværdien ± SE af mindst 3 uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Krebs-ringer bikarbonat buffer (KRBH) | |||
| Stamopløsning eller pulver | Lager | Afsluttende koncentration | 100 mL |
| KCl | 0,25 mio. | 5 mM i | 2 ml af |
| Nacl | 4 M fra | 120 mM | 3 ml af |
| Hepes, pH 7,4 | 1 M fra | 15 mM i | 1,5 ml |
| Af NaHCO3 | 0,5 mio. | 24 mM i | 4,8 ml |
| MgCl2 | 1 M fra | 1 mM i | 0,1 ml |
| CaCl2 | 1 M fra | 2 mM i | 0,2 ml |
| Vand | H2o | 88,4 ml | |
| RIA-kvalitet BSA | Pulver | 1 mg/mL | 100 mg/min. |
| Gør frisk på dagen for eksperimentet. | |||
| Gaussia-analyse buffer * | |||
| Stamopløsning eller pulver | Lager | Afsluttende koncentration | 50 mL |
| Dinatriumphosphat | Pulver | 0,1% (1 mg/mL) | 50 mg/min. |
| Glycerol | 40% af | 5 | 6,25 mL |
| Natrium bromid | Pulver | 150 mM | 772 mg/min. |
| EDTA pH 8 | 0,5 m | 1 mM i | 100 μL |
| Tris-HCl-pH 8 | 1M | 25 mM i | 1,25 mL |
| Ascorbinsyre * | Pulver | 300 mM | 2,64 g |
| Na2SO3** | Pulver | 200 mM | 1,26 g |
| Vand | op til 50mL | ||
| Opbevares i aliquoter ved-20 °C, tø én ad gangen og opbevares ved 4 °C. | |||
| * Modificeret opskrift fra luft et al. BMC Biochemistry 2014, 15:14. | |||
| Syrnet MeOH | |||
| Stamopløsning eller pulver | Lager | Afsluttende koncentration | 10 mL af |
| Methanol | 100% af | 10 mL af | |
| Hcl | 11,65 mio. | 1,06% af | 0,106 mL |
| Coelenterazin-opløsning | |||
| Stamopløsning eller pulver | Lager | Afsluttende koncentration | 1 mL af |
| Har du en | Pulver | 1 mg/mL (2,36 mM) | 1 mg og derover |
| Syrnet methanol | 1 mL af | ||
| 4,2 μL af lager pr. 1 mL Gaussia analyse buffer resulterer i 10 μM CTZ til brug som en 2x arbejdsopløsning. | |||
| For eksempel tilsættes 50 μL af 2x arbejdsopløsning til 50 μL KRBH-prøve indeholdende udskilt Gaussia. | |||
Tabel 1: opskrifter på buffer og stamopløsning, der bruges til at udføre de præsenterede assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri præsenterer vi en metode til hurtigt at vurdere glukose-stimuleret insulinsekretion svar fra MIN6 β celler. For de bedste svar i analysen er det vigtigt at frø MIN6 celler på den rette tæthed og give dem mulighed for at blive 85-95% konflydende. Dette forbedrer β celle responser på glukose på grund af forbedrede celle celle kontakter og synkronisering, som forekommer både i primære Holme17,18,19,20,21 samt MIN6 cellerne16,18. For at forhindre tab i sekretoriske respons på glukose stimulation, er det vigtigt at opretholde cellerne på så lavt en passage som muligt og kultur cellerne for kun 6-8 uger før optøning af et nyt hætteglas fra flydende kvælstof bestande. Der kan foretages ændringer i forpladnings strategien i protokol afsnit 2 for at tilpasse den til det tilgængelige udstyr efter behov. Plating insgluc MIN6 celler i 96-brønd plader til sekretion analyser giver et stort antal brønde til eksperimentelle manipulationer (herunder replikater) samt opretholdelse af nøjagtigheden af plating i en normal Lab indstilling, som plating i retter med højere brønd numre kræver ofte særligt udstyr, der normalt er tilgængeligt i højgennemløbs-screening kerner.
Aktuelle analyser for insulinsekretion, bortset fra den indirekte luciferase assay beskrevet her, omfatter: Elisas, der bruger kolorimetriske udlæsninger (direkte assay), radioimmunassays (konkurrence analyse), som bruger radioaktive udlæsninger, fret-baseret antistof konkurrence analyse22 og HTRF23 , der bruger stress mellem Dye-relaterede antistoffer til at måle insulin direkte, og DNA aptamers24. Hver af disse metoder har sine egne fordele, men generelt er de dyrere og/eller tidskrævende end en luciferase assay. En vigtig begrænsning af InsGLuc-analysen er, at den Co-udskillede luciferase-aktivitet kun er en proxy for den faktiske insulinsekretion. Derudover, der er ingen forventet forskel i luciferase aktivitet mellem gaussia med fragmenter af C-peptid på sin N-og C-Termini eller gaussia inden for forbedredes protein, som gaussia luciferase er blevet anvendt med succes som et tag til at måle udskillelsen af andre proteiner25. Dette fremhæver kravet om bekræftelse undersøgelser ved hjælp af analyser at måle forarbejdet insulin specifikt. Alternativer til direkte og indirekte målinger af insulinsekretion kan også anvendes til at vurdere β cellefunktion. En række optiske reportere findes for udlæsninger, herunder ATP: ADP ratio, calcium tilstrømning, nad+/NADH ratio, ekstracellulære signal-regulerede kinaser (Erk) aktivering, eller cyklisk adenosin monophosphat (Camp) niveauer26.
Især de fremtidige anvendelser af InsGLuc synes at være i screening med høj produktion. Denne analyse er allerede blevet brugt i en håndfuld offentliggjorte små skærme1,2 og ikke-offentliggjorte større skærme er enten afsluttet7 eller i gang. Udvikling af andre iterationer af denne teknologi kan indebære tagging af andre udskillede Islet hormoner med luciferases at lette hurtige målinger, såsom for Glucagon eller somatostatin. Ændringer kan foretages under alle omstændigheder, hvor celle linjen genoprettes ved hjælp af alternative tilgange, herunder CRISPR/Cas9, lentivirus, eller transposase-medieret indsættelse i en passende beta cellelinje. Yderligere mulige ændringer af den oprindelige reporter kan omfatte udskiftning af suppleant udskillede luciferases for gaussia eller kombinere flere forskellige udskillede luciferaser forbundet med forskellige hormoner til en multiplex assay. Ud over cellekultur præsenterer CRISPR/Cas9 teknologi muligheden for at generere en musemodel, hvor en egnet luciferase bliver slået ind i C-peptidkodnings området i Ins2 i genomet. En sådan mus ville være mulig, da Transgene mus er blevet skabt med GFP slået ind på det samme C-peptid-sted27 og ville muliggøre måling af endogene β cellefunktion med en luciferaseassay in vivo eller ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker alle nuværende og tidligere medlemmer af Cobb laboratoriet for værdifulde arbejde og diskussioner, og Dionne ware for administrativ assistance. Michael Kalwat understøttes af en juvenil diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R. Dette arbejde blev gjort muligt gennem NIH R37 DK34128 og Welch Foundation Grant I1243 til Melanie Cobb. Tidlige dele af dette arbejde blev også støttet af en NIH F32 DK100113 til Michael Kalwat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
- Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
- Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
- Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
- Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
- Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
- Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
- Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. , WO2018175324A1 (2018).
- Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).
- Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
- Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
- Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
- Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).
- Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
- Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
- Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
- Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
- Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
- Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).
- Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
- Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
