Summary
Este protocolo descreve como executar rápidos ensaios de luciferase de baixo custo em média taxa de transferência usando uma luciferase de Gaussia ligada à insulina como um proxy para a secreção de insulina de células beta. O ensaio pode ser realizado com a maioria dos leitores de placas de luminescência e pipetas multicanal.
Abstract
Executar ensaios baseados em anticorpos para a coleta de insulina secretada pós-amostra geralmente requer algumas horas para um dia de tempo de ensaio e pode ser caro, dependendo do ensaio específico. Os ensaios de luciferase secretados aceleram os resultados e reduzem substancialmente o custo do ensaio por amostra. Aqui nós apresentamos uma aproximação relativamente subutilizado para avaliar a atividade secretora do insulin das pilhas do β pancreatic usando o luciferase do Gaussia introduzido genetically dentro do C-peptide. Durante o processamento proteolítico do proinsulin, o C-peptide é extirpado liberando o luciferase dentro do vesícula secretora do insulin onde é cosecretado com insulin. Os resultados podem ser obtidos em poucos minutos após a coleta da amostra por causa da velocidade dos ensaios de luciferase. Uma limitação do ensaio é que é uma medida relativa da secreção de insulina e não uma quantitação absoluta. Entretanto, este protocolo é econômico, evolutivo, e pode ser executado usando a maioria de leitores padrão da placa da luminescência. As pipetas multicanais analógicas e digitais facilitam várias etapas do ensaio. Muitas variações experimentais diferentes podem ser testadas simultaneamente. Uma vez que um conjunto focado de condições são decididas, as concentrações de insulina devem ser medidas diretamente usando ensaios baseados em anticorpos com curvas padrão para confirmar os resultados do ensaio luciferase.
Introduction
O método apresentado aqui permite que a secreção de insulina de uma linha de célula beta geneticamente modificada seja ensaiada rapidamente e de forma acessível no formato 96-well-Plate. A chave a este protocolo é uma versão modificada do insulin com o luciferase naturalmente-secreted da Gaussia (gluc, ~ 18 KDa) introduzido ( Veja Figura 1) no C-peptide para gerar o insulin-Gaussia (insgluc)1,2. Outras proteínas maiores, como a GFP (~ 25 kDa), foram inseridas com sucesso no peptídeo C de insulina e exibiram o processamento pós-translacional esperado de proinsulina-GFP para insulina e GFP-C-peptídeo3,4. Para o ensaio neste protocolo, o gluc foi aperfeiçoado Codon para a expressão dos mamíferos e duas mutações foram introduzidas para realçar a cinética Glow-like5,6. Múltiplas combinações e repetições de condições de tratamento podem ser facilmente testadas em formato 96-bem-Plate e os resultados da secreção podem ser obtidos imediatamente após o experimento.
Uma vantagem principal, como observado previamente2, é o baixo custo desta medida da secreção luciferase-baseada (< $0.01/well) que o diferencia dos custos e dos aspectos técnicos relativamente mais elevados de ensaios enzima-lig da imunoabsorção (ELISAs) ( > $2/bem) e a fluorescência tempo-resolvida homogénea (HTRF) ou a outra transferência da energia da ressonância de Förster (FRET)-baseou o anticorpo (> $1/well) ensaios. Em comparação com estes ensaios baseados em anticorpos, que medem a concentração de insulina referenciando uma curva padrão, o ensaio InsGLuc mede a atividade secretora como uma comparação relativa aos poços de controle na placa. Por esse motivo, cada experimento requer a inclusão de controles adequados. Esta distinção é um trade-off para permitir medições rápidas e baratas. No entanto, a secreção de insgluc demonstrou ser altamente correlacionada com a secreção de insulina,medida por Elisa1,2. Esta tecnologia foi dimensionada para a triagem de alta taxa de transferência1,2,7 e levou à identificação de novos moduladores de secreção de insulina, incluindo um inibidor de canal de potássio voltagem-gated7 bem como um inibidor de produto natural da função de célula β, a cromomicina a28. O uso de InsGLuc é mais adequado para pesquisadores que planejam continuamente testar muitas condições de tratamento diferentes para o seu impacto na secreção de insulina. Em experimentos de acompanhamento é necessário repetir os principais achados em uma linha celular β parental, e otimamente em ilhotas murinas ou humanas, e medir a secreção de insulina usando um ensaio baseado em anticorpos.
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Protocol
1. preparação de reagentes, suportes e amortecedores (tabela 1)
- Prepare MIN6 mídia completa em 500 mL de alta glicose (4,5 g/L) o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com os seguintes aditivos: 15% soro fetal bovino (FBS), 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 292 μg/mL L-glutamina e 50 μM β-Mercaptoetanol.
Nota: a linha celular estável neste caso é mantida em 250 μg/mL de antibiótico G418. - Prepare o tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer (KRBH) fazendo uma solução contendo 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7,4), 24 mM NaHCO3, 1 mm MgCl2, 2 mm CAcl2e 1 mg/ml radioimunoensaio-grau de albumina sérica bovina (BSA). A glicose deve ser adicionada quando especificado a partir de um estoque de 2 M.
Nota: KRBH é utilizado para incubar as células com e sem estimulação, a fim de avaliar a insulina e/ou Gaussia luciferase secreção. - Prepare a solução de estoque de Coelenterazina (CTZ) da seguinte maneira. Prepare o metanol acidificado adicionando 106 μL de HCl concentrado a 10 mL de metanol. Em seguida, dissolva a CTZ liofilizada em metanol acidificado a 1 mg/mL e armazene a-80 ° c em tubos com tampa de rosca.
Nota: Estes estoques mantêm a atividade suficiente em ensaios rotineiros da luciferase, mesmo depois de 1 ano do armazenamento apropriado. - Prepare o tampão do ensaio da luciferase de Gaussia (GLuc) baseado na literatura9 as well as a informação10 da patente para ajudar na meia-vida do ensaio da luciferase de Gaussia no formato da placa do poço 96. Use a fórmula: 25 mM TRIS pH 8, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1 mg/mL nd2po4, 300 mm ascorbato de sódio, 200 mm na2so3 em água. Congelar estoques em-20 ° c. Depois de descongelar, guarde o tampão a 4 ° c.
- Para preparar a solução de trabalho da Gaussia luciferase, adicione 4,2 μL/mL da solução em estoque de 1 mg/mL (2,36 mM) CTZ ao tampão do ensaio GLuc. Isso resulta em uma solução de trabalho 2x de 10 μM de CTZ que terá uma concentração final de 5 μM no ensaio.
2. cultura de InsGLuc MIN6 células e semeadura para ensaios de secreção
- Para cultura MIN6 células, Trypsinize e semente as células uma vez por semana usando técnicas de cultura de células padrão. Mude a mídia nas células a cada dois a três dias. Inclua o antibiótico de seleção apropriado, como 250 μg/mL de G418 na mídia.
- Para fornecer um número suficiente de células semanalmente para experimentos, mantenha as células em T75 frascos. Semeando 6 x 106 células por T75 em 10 ml de mídia normalmente produzirá 30 x 106 para 40 x 106 células total por T75 após 7 dias de cultura.
- Para preparar as células para o revestimento em placas 96-well, lave um T75 confluente de células MIN6 InsGLuc duas vezes com PBS e adicione 2 mL de tripsina. Incubar a 37 ° c durante ~ 5 min ou até que as células se dissociem do balão. Determine a concentração de células por mililitro.
- Diluir as células na mídia completa para 1 x 106 células/ml para resultar em 1 x 105 células em 100 μl por poço em uma placa 96-bem. As células devem ser suficientemente confluentes para o ensaio após 3 – 4 dias.
Nota: para estender o período da cultura, a metade da concentração da pilha pode ser chapeada. As alterações na mídia não são necessárias antes do dia do ensaio, a menos que as células devam ser submetidas a tratamentos experimentais.
- Diluir as células na mídia completa para 1 x 106 células/ml para resultar em 1 x 105 células em 100 μl por poço em uma placa 96-bem. As células devem ser suficientemente confluentes para o ensaio após 3 – 4 dias.
3. glicose-estimulado Gaussia luciferase ensaio de secreção
- No dia do ensaio Prepare KRBH suficiente para o experimento (etapa 1,2). Um mínimo de 50 mL de KRBH por placa de 96 poços é necessário, portanto, prepare pelo menos 75 mL para garantir uma reserva suficiente para o experimento. Prepare o amortecedor extra se as combinações diferentes de condições do tratamento da droga exigirem KRBH para a diluição.
- Prepare um reservatório com KRBH sem glicose. Decantar o meio de 96-bem placa (s), invertendo rapidamente a placa sobre um dissipador de laboratório e, em seguida, blot firmemente em uma pilha de toalhas de papel para remover o excesso de meio.
- Usando uma pipeta eletrônica ou manual de 8 canais, Pipete 100 μL/poço KRBH do reservatório em toda a placa (s) de 96 poços. Repita para um total de duas lavas.
- (Etapa opcional de tratamentos compostos agudos) Se não estiver realizando tratamentos medicamentoso, prossiga com as etapas 3,5 e 3,6 sem modificação. Para testar os efeitos de pequenas moléculas na secreção de insulina, os compostos podem ser adicionados às células durante o período de pré-incubação, período de estimulação, ou ambos.
- Uma técnica é adicionar compostos em lote ao KRBH em tubos de 1,5 mL e usar uma pipeta digital ajustável de 8 canais para transferir a droga-KRBH dos tubos para as células em placas 96-well.
Nota: se uma pipeta ajustável não está disponível, uma placa 96-well da réplica da medicina-KRBH pode ser feita e uma pipeta padrão de 8 canais pode ser usada para transferir o amortecedor. Outras modificações no paradigma do tratamento podem ser feitas para tratar as células por 24 h nos meios de comunicação prévio ao ensaio, conforme descrito anteriormente1,8.
- Uma técnica é adicionar compostos em lote ao KRBH em tubos de 1,5 mL e usar uma pipeta digital ajustável de 8 canais para transferir a droga-KRBH dos tubos para as células em placas 96-well.
- Adicione 100 μL de KRBH contendo a concentração desejada de glicose ou compostos e coloque o prato na incubadora de 37 ° c por 1 h.
Nota: dependendo do layout experimental, é extremamente útil ter uma pipeta multicanal eletrônica que permite a transição das distâncias do canal de uma coluna de oito tubos de 1,5 mL para as 8 fileiras de uma placa de 96 poços. - Após o 1 h de pré-incubação, decantar o tampão no dissipador e borrar firmemente na toalha de papel. Adicionar 100 μL de KRBH sem glucose por poço para lavar o fundo acumulado da Gaussia luciferase. Decantar a placa novamente e adicionar condições de controle e estimulantes à placa em 100 μL por poço. Coloque o prato na incubadora de 37 ° c por 1 h.
- Colete cuidadosamente 50 μL de sobrenadante usando uma pipeta multicanal, alterando as pontas entre as condições de tratamento conforme necessário, e transfira o sobrenadante para uma placa de ensaio branco opaco limpa 96-bem.
Nota: placas de fundo claro com paredes brancas podem ser usadas se necessário, embora uma quantidade significativa de sinal de luciferase seja perdida. - Após a coleta de 50 μL de sobrenadante KRBH, a amostra pode ser ensaiada imediatamente. Se necessário, sele e armazene amostras em 4 ° c por alguns dias (meia-vida da atividade do gluc ~ 6 dias) ou-20 ° c por até um mês11,12.
4. ensaio secretado da luciferase da Gaussia
- Para preparar a solução de trabalho do ensaio GLuc, pipete a quantidade necessária de solução de estoque de CTZ (4,2 μL/mL) no tampão de ensaio GLuc. Para evitar aquecer o CTZ, pipete o CTZ rapidamente no congelador-80 ° c ou mantenha o tubo em gelo seco.
- Utilizando uma pipeta multicanal electrónica, adicione rapidamente 50 μL da solução de trabalho de ensaio GLuc por poço em todo o prato de 96 poços contendo os sobrenadantes KRBH recolhidos. Se houver qualquer gota nas laterais de qualquer poços, gire brevemente a placa em uma mesa-Top centrífuga swing-balde.
- Leia a luminescência em um leitor de placa adequado dentro de alguns minutos e ler cada poço com um tempo de integração de 0,1 s.
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Representative Results
Para avaliar o desempenho do ensaio condições de controle, uma curva de dose-resposta de glicose simples ou uma estimulação usando o paradigma de diazóxido podem ser concluídas. No caso do primeiro, a pré-incubação das células para 1 h em condições livres de glicose seguidas pelo tratamento de 1 h com concentrações crescentes de glicose deve resultar em pouca atividade secretora e abaixo de 5 mM, enquanto o aumento da secreção é observado acima de 8 mM de glicose (Figura 2). A estimulação com 35 milímetros KCl igualmente sere como um controle positivo para a secreção estimulada. A inclusão de fármacos moduladores de secreção durante o período de estimulação deve dar a esperada inibição ou potenciação da atividade de GLuc secretada (Figura 3). Por exemplo, o diazóxido liga o canal KATP e impede que ele se feche após o aumento da relação [ATP/ADP], bloqueando a despolarização da membrana e impedindo a secreção13. Os ésteres de phorbol como para-metoxianfetamina (PMA) ativam a proteína quinase C (PKC) e são amplificadores conhecidos de secreção de insulina14. Finalmente, a estimulação com epinefrina de 1 μM ativa receptores α2a-adrenérgicos que, por sua vez, ativam o complexo de proteína G heterotrimérica GI, inibindo a despolarização da membrana e a secreção de insulina15. É importante reconhecer que enquanto as células MIN6 são uma linhagem celular imortal, elas começam a perder as respostas adequadas de secreção de insulina induzida por glicose (como o deslocamento à esquerda da curva de resposta) após o de estendido16. Por esta razão, é uma boa prática a cultura rotineiramente todas as linhas de célula MIN6 por até oito semanas (dividindo uma vez por semana) antes de começar sobre de estoques de nitrogênio líquido.
Figura 1: Descrição do repórter InsGLuc. (A) primeiramente, uma linha celular estável do β (neste caso MIN6 pilhas) foi gerada expressando o transgene do insulin-Gaussia do promotor do insulin do rato. B) a proteína completa é sintetizada e embalada em grânulos de insulina, juntamente com insulina endógena. Prohormone convertases Cleave o peptide, indicado por asteriscos. (C) a insulina processada e a Gaussia são cosecretadas e a atividade da luciferase é detectada pela adição de ctz em uma reação independente de ATP, dependente de oxigênio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: o repórter de InsGLuc é um proxy fiel da secreção de insulina de MIN6 células beta. (A) resposta das células de MIN6 insgluc ao aumento das concentrações de glicose e KCl (35 mm) com secreção da Gaussia luciferase. Os dados são a atividade média da luciferase da dobra ± SE comparado às condições da glicose de 0 milímetros para três experimentos independentes. *, P < 0, 5. A figura foi modificada com permissão de Kalwat et al. sensores ACS 20161. © 2016 sociedade química americana. (B) o repórter do insgluc em MIN6 pilhas exibe a resposta secretora esperada ao paradigma do diazóxido (DZ) onde o tratamento de 250 μm DZ prende o canal doATP de K aberto, obstruindo a despolarização da membrana a menos que o KCl extracelular (35 milímetros) for fornecido para provocar o influxo de cálcio "desencadeante". Adição adicional de glicose (20 mM) a condição de DZ + KCl revela a amplificação metabólica da secreção que ocorre sem aumentos adicionais no influxo de cálcio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: inclusão de compostos que modulam a secreção durante a glicose-estimula a secreção de InsGLuc. As pilhas MIN6 chapeadas no formato 96-well como descrito foram pré-incubada em krbh glucose-livre para 1 h. as pilhas foram tratadas então com ou sem a glicose de 20 milímetros na presença de dimetil sulfóxido (DMSO) (0,1%), KCl (35 milímetros), diazóxido (250 μm), PMA (100 nanômetro), epinefrina (1 μM) por 1 h. o gráfico de barras representa a média ± SE de pelo menos 3 experimentos independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tampão do bicarbonate de Krebs-Ringer (KRBH) | |||
| Solução de estoque ou pó | Estoque | Concentração final | 100 mL |
| Kcl | 0,25 M | de 5 mM | 2 ml de |
| Nacl | de 4 M | 120 milímetros | 3 ml de |
| HEPES, pH 7,4 | 1 M de | de 15 mM | 1,5 ml |
| NaHCO3 | 0,5 M | de 24 mM | 4,8 ml |
| MgCl2 | 1 M de | de 1 mM | 0,1 ml |
| CaCl2 | 1 M de | de 2 mM | 0,2 ml |
| Água | H2o | 88,4 ml | |
| RIA-grau BSA | Pó | 1 mg/mL | 100 mg |
| Faça fresco no dia da experiência. | |||
| Tampão de ensaio Gaussia * | |||
| Solução de estoque ou pó | Estoque | Concentração final | 50 mL |
| Fosfato dissódico | Pó | 0,1% (1 mg/mL) | 50 mg |
| Glicerol | 40% de | 5 | 6,25 mL |
| Brometo de sódio | Pó | 150 milímetros | 772 mg |
| PH do EDTA 8 | de 0,5 m | de 1 mM | 100 μL |
| Tris-HCl pH 8 | 1M | de 25 mM | 1,25 mL |
| Ácido ascórbico * | Pó | 300 milímetros | 2,64 g |
| Na2SO3** | Pó | 200 milímetros | 1,26 g |
| Água | até 50mL | ||
| Conservar em alíquotas a-20 ° c, descongelar um de cada vez e manter a 4 ° c. | |||
| * Receita modificada de Luft et al. BMC bioquímica 2014, 15:14. | |||
| MeOH acidificado | |||
| Solução de estoque ou pó | Estoque | Concentração final | 10 mL de |
| Metanol | 100% de | 10 mL de | |
| Hcl | 11,65 M | 1, 6% de | 0,106 mL |
| Solução de Coelenterazina | |||
| Solução de estoque ou pó | Estoque | Concentração final | 1 mL de |
| Coelenterazine | Pó | 1 mg/mL (2,36 mM) | 1 mg de |
| Metanol acidificado | 1 mL de | ||
| 4,2 μL de estoque por 1 mL de tampão de ensaio Gaussia resulta em 10 μM de CTZ para ser usado como uma solução de trabalho 2x. | |||
| Por exemplo, adicione 50 μL de solução de trabalho 2x a 50 μL de amostra de KRBH contendo Gaussia secretado. | |||
Tabela 1: receitas de solução tampão e estoque utilizadas para realizar os ensaios apresentados.
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Discussion
Nisto nós apresentamos um método para avaliar ràpida as respostas glicose-estimuladas da secreção do insulin das pilhas de MIN6 β. Para as melhores respostas no ensaio é importante para sementes as células MIN6 na densidade adequada e permitir-lhes tornar-se 85-95% confluente. Isto melhora respostas da pilha β à glicose por causa dos contatos e da sincronização melhorados da pilha-pilha, que ocorre ambos nas ilhotas preliminares17,18,19,20,21 assim como MIN6 células16,18. Para evitar perdas na resposta secretora à estimulação da glicose, é importante manter as células em tão baixa de uma passagem quanto possível e cultura das células por apenas 6-8 semanas antes de descongelar um novo frasco de estoques de nitrogênio líquido. As modificações podem ser feitas à estratégia do chapeamento na seção 2 do protocolo para adaptar-se ao equipamento disponível como necessário. Chapeamento de células InsGLuc MIN6 em placas 96-well para ensaios de secreção proporciona um grande número de poços para manipulações experimentais (incluindo réplicas), bem como manter a precisão do chapeamento em um ambiente de laboratório normal, como chapeamento em pratos com maior bem Normalmente, os números exigem equipamentos especiais geralmente disponíveis em núcleos de triagem de alta produtividade.
Os ensaios atuais para a secreção de insulina, além do ensaio de luciferase indireta descrito aqui, incluem: ELISAs que usam leituras colorimétricas (ensaio direto), radioimunoensaios (ensaio de competição) que usam leituras radioativas, anticorpo baseado em traste ensaio da competição22 e htrf23 que usa o fret entre anticorpos Dye-lig para medir diretamente o insulin, e os aptâmeros do ADN24. Cada um destes métodos tem suas próprias vantagens, mas em geral eles são mais caros e/ou demorados do que um ensaio luciferase. Uma limitação chave do ensaio InsGLuc é o fato de que a atividade luminescente da luciferase cosecretada é apenas um proxy para a secreção de insulina real. Adicionalmente, não há nenhuma diferença esperada na atividade do luciferase entre Gaussia com fragmentos do c-peptide em seus N-e c-Termini ou Gaussia dentro da proteína do pró-insulina, como o luciferase de Gaussia foi usado com sucesso como um tag para medir a secreção de outras proteínas25. Isso destaca a exigência de estudos de confirmação usando ensaios que medem a insulina processada especificamente. Alternativas para medições diretas e indiretas da secreção de insulina também podem ser usadas para avaliar a função da célula β. Uma variedade de repórteres óticos existem para leituras que incluem a relação do ATP: ADP, o Influx do cálcio, a relação de nad+/NADH, a ativação sinal-regulada extracelular dos quinases (Erk), ou os níveis cíclicos do monofosfato da adenosina (acampamento)26.
As futuras aplicações do InsGLuc, em particular, parecem estar na triagem de alta taxa de transferência. Este ensaio já foi usado em um punhado de telas pequenas publicadas1,2 e telas maiores não publicadas são concluídas7 ou em andamento. O desenvolvimento de outras iterações desta tecnologia pode envolver a marcação de outras hormonas de Illet secretado com luciferases para facilitar medidas rápidas, tais como para o glucagon ou o Somatostatin. Modificações podem ser feitas em qualquer caso em que a linha celular é recriada usando abordagens alternativas, incluindo CRISPR/Cas9, Lentivirus, ou inserção mediada por transposase em qualquer linha de célula beta adequada. Modificações possíveis adicionais ao repórter original podem incluir a substituição de luciferases secretadas alternadas para a Gaussia ou a combinação de várias luciferases secretadas diferentes ligadas a diferentes hormônios para um ensaio multiplexado. Além da cultura celular, a tecnologia CRISPR/Cas9 apresenta a possibilidade de gerar um modelo de camundongo onde uma luciferase adequada é derrubada na região codificadora de peptídeos C de Ins2 no genoma. Tal rato seria praticável dado que os ratos transgênicas estiveram criados com o GFP batido dentro ao mesmo local27 do C-peptide e permitiria a medida da função endógena da pilha do β com um ensaio do luciferase in vivo ou ex vivo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a todos os membros atuais e antigos do laboratório de Cobb por trabalho valioso e discussões, e Dionne Ware para assistência administrativa. Michael Kalwat é apoiado por um juvenil diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R. Este trabalho foi possibilitido através da NIH R37 DK34128 e da Welch Foundation Grant I1243 para Melanie Cobb. As partes adiantadas deste trabalho foram apoiadas igualmente por um NIH F32 DK100113 a Michael Kalwat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
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