Aqui, demonstramos como configurar um volt-AMPEREMETER barato com frequência de saída programável que pode ser usado com eletrodos de pauzinho disponíveis comercialmente para medições de resistência elétrica transepielial/endotelial.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Uma aproximação simples para executar medidas de TEER usando um volt-AMPEREMETER self-made com freqüência programável da saída
Neste artigo
Resumo
Resumo
A resistência elétrica transepielial/endotelial (TEER) tem sido utilizada desde a década de 1980 para determinar a confluência e a permeabilidade dos sistemas de barreira in vitro. Na maioria dos casos, os elétrodos do chopstick são usados para determinar a impedância elétrica entre o compartimento superior e mais baixo de um sistema da inserção do filtro da cultura da pilha que contem monolayers celulares. A membrana do filtro permite que as células aderem, polarizar e interagir construindo junções apertadas. Esta técnica foi descrita com uma variedade de linhas de pilha diferentes (por exemplo, pilhas da barreira do sangue-cérebro, da barreira sangue-cerebrospinal do líquido, ou do intervalo gastrintestinal e pulmonar). Os dispositivos da medida de TEER podem prontamente ser obtidos dos fornecedores diferentes do equipamento de laboratório. No entanto, há soluções mais rentáveis e personalizáveis imagináveis se um voltamômetro apropriado for automontado. O objetivo geral desta publicação é configurar um dispositivo confiável com freqüência de saída programável que pode ser usado com eletrodos de pauzinho disponíveis comercialmente para medição TEER.
Introdução
As células epiteliais e endoteliais funcionam como limites celulares, separando os lados apical e basolateral do corpo. Se forem conectados através de junções apertadas, a difusão passiva da substância através dos espaços transcelulares paracelulares é restringida1, tendo por resultado a formação de uma barreira seletivamente permeável. Vários sistemas de barreira artificial foram desenvolvidos2 usando células endoteliais microvasculares (hbmec, barreira hematoencefálica3,4,5,6,7), plexo
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. montagem de um volt-AMPEREMETER básico para a medida do TEER
- Prepare um carregador USB padrão como a fonte de alimentação de 5 V DC, um cabo de extensão USB, um microcontrolador que será usado como um gerador de onda quadrada programável, dois multímetros padrão que são capazes de medir corrente alternada e tensão como raiz média quadrada ( True-RMS), quatro cabos com plugues da banana, um cabo de extensão do telefone com um conector fêmea RJ14 que inclui seis pinos com os quatro internos prendidos (6P4C), dois cabos curtos, um terminal do brilho, um 120 kΩ Pre-resistor, ferrules da extremidade do fio, e lugs de solda. As ferramentas exigidas são um desca....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Para comparar a operação de um voltamômetro automontado com sua contraparte comercialmente disponível, foi registrado um oscilosgrama de tensão de ambos os dispositivos.
Como mostrado na Figura 2a, oinstrumento de referência gerou um sinal de onda quadrada com uma amplitude de 80 MV e um tempo de oscilação de 80 MS, que corresponde a uma frequência de 12,5 Hz, quando operando em carga com um res.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Antes que um voltamômetro self-made possa ser usado em uma rotina diária, é essencial verific o dispositivo para a função apropriada. No nosso caso, uma meia-hora de oscilação de 40 MS (12,5 Hz) foi programada, mas o tempo de oscilação efetivo acabou por ser de 60 MS (16,7 Hz). Esta imprecisão do emissor de tempo do microcontrolador não teve nenhum impacto detectável em medidas de TEER. Talvez seja melhor determinar a freqüência real usando a configuração de freqüência de um dos multímetros. Se algum desvio for encontrad.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Herman Liggesmeyer e Marvin Bende pelo seu aconselhamento especializado em Eletrotécnica e informática.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 120 kOhm | Equipamento geral (genérico) | ||
| Cabos | Equipamento geral (genérico) | ||
| Cabos | Equipamento geral (genérico) | ||
| Eletrodo de pauzinho | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Eletrodo de pauzinho (alternativo) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| de crimpagem | Ferramenta geral | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Soro fetal de bezerro (FCS)/Soro fetal bovino (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Inserções de filtro 3µ m translúcido | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Decapador | de isolamento Ferramenta geral | ||
| Terminal de brilho Equipamento | geral (genérico) | ||
| Osciloscópio | HAMEG | Escopo de armazenamento digital HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y gravador | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Ferro | Ferramenta geral | ||
| Terminais | Equipamento geral (genérico) | ||
| Cabo telefônico com conector | Equipamento geral (genérico) | ||
| Resistor de teste | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| Multímetros True-RMS | VOLTCRAFT | VC185 | |
| Carregador | Equipamento geral (genérico) | ||
| Cabo | Equipamento geral (genérico) | ||
| Voltohímetro para medição TEER | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohímetro para medição TEER (alternativa) | Merck Millicell | ERS | |
| Virolas | Equipamento geral (genérico) |
Referências
- Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
- Daniels, B. P.,
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
