Denne protokollen er designet for avbildning og analyse av dynamikken i celleorientering og vevsvekst i Drosophila abdominal epithelia som fruktfluen gjennomgår metamorfose. Metodikken som er beskrevet her, kan brukes på studiet av ulike utviklingsstadier, vev og subcellulære strukturer i Drosophila eller andre modellorganismer.
Innenfor flercellede organismer viser modne vev og organer høye grader av orden i de romlige arrangementene til deres bestanddeler celler. Et bemerkelsesverdig eksempel er gitt av sensorisk epithelia, hvor celler av samme eller distinkte identiteter er samlet via cellecelleadhesjon som viser svært organiserte planarmønstre. Celler justeres til hverandre i samme retning og viser tilsvarende polaritet over store avstander. Denne organiseringen av den modne epithelia er etablert i løpet av morfogenese. For å forstå hvordan den planære ordningen av den modne epithelia oppnås, er det avgjørende å spore celleorientering og vekstdynamikk med høy spatiotemporal gjengivelse under utviklingen in vivo. Robuste analytiske verktøy er også avgjørende for å identifisere og karakterisere lokale til globale overganger. Drosophila pupa er et ideelt system for å evaluere orientert celleform endrer underliggende epitelmorogenese. Det pupale utviklende epitelet utgjør den ytre overflaten av immobile kroppen, slik at langsiktig avbildning av intakte dyr. Protokollen som er beskrevet her er utformet for å bilde og analysere celleatferd på både globale og lokale nivåer i pupal abdominal epidermis som den vokser. Metodikken som er beskrevet, kan enkelt tilpasses avbildningen av celleatferd i andre utviklingsstadier, vev, subcellulære strukturer eller modellorganismer.
For å oppnå sine roller, epitelvev fullt ut stole på den romlige organiseringen av sine cellulære komponenter. I de fleste epithelia er celler ikke bare pakket mot hverandre for å skape et presist brosteinslag, men de orienterer seg i forhold til kroppsaksene.
Den funksjonelle betydningen av presis vevsorganisasjon er åpenbar i sensorisk epithelia, som virveldyr indre øre og netthinnen. I det første tilfellet justerer hår- og støtteceller i en bestemt aksial retning for effektivt å føle mekaniske innganger som lyd og bevegelse1,2. På samme måte er fotoreseptorcelle romlig organisasjon avgjørende for å oppnå optimale optiske egenskaper ved netthinnen3. Romlig kontroll av celleposisjon og orientering er dermed av særlig relevans for riktig fysiologisk funksjon.
Drosophila er et holometaboløs insekt som gjennomgår en fullstendig transformasjon av larvalkroppsstrukturene gjennom metamorfose, noe som gir opphav til sitt voksne vev. Drosophila pupa er en utmerket modell for noninvasiv levende avbildning av en rekke dynamiske hendelser, inkludert utviklingscellemigrasjon4,celledeling og vekstdynamikk5,muskelsammentrekning6,celledød7,sårreparasjon8og celleorientering9. I den voksne Drosophilaviser det eksterne epitelet en høy grad av orden. Dette observeres lett på arrangementer av trichomes (dvs. celle fremspring som stammer fra enkelt epitelceller) og sensoriske bust over hele flyets kroppsoverflate10. Faktisk er trichomes justert i parallelle rader som styrer luftstrømmen11. Morfogenesen til den voksne epithelia og det bestilte arrangementet av de enkelte cellene starter under embryogenese og kulminerer under pupale stadier. Mens i embryoer celledelinger, intercalations, og form endrer alle redusere vevsorden12,13, dette er tilbake på senere stadier av utviklingen, spesielt på pupal stadier, når flyet nærmer modenhet9.
Immobile Drosophila pupa gir et ideelt system for å evaluere celleform og orienteringsendringer. Den pupale abdominal epidermis presenterer spesielle fordeler. Mens forløperne til det voksne hodet, thorax, kjønnsorganer og vedlegg vokser og blir mønstret fra larvestadier, histoblasts, som er integrert i larval epidermis, begynner å vokse og differensiere bare ved pupariation14. Denne funksjonen tillater sporing av alle spatiotemporal hendelser involvert i etableringen av vev orden i sin helhet9.
Histoblasts er spesifisert under embryonal utvikling ved kontralaterale stillinger i hvert presumptivt buksegment. Den dorsale abdominal epidermis av den voksne stammer fra dorsolaterally plassert histoblast reir tilstede i fremre og bakre rom15,16. Etter hvert som histoblaster utvides, erstatter larval epitelceller (LECer), smelter de kontralaterale reirene ved dorsalmidlinjen som danner et sammenføyningsark17,,18,,19,,20.
Dette arbeidet beskriver 1) en metodikk for disseksjon, montering og langsiktig levende avbildning av Drosophila-puppene, og 2) analytiske metoder for å studere dynamikken i cellulær orientering og vekst ved høy spatiotemporal oppløsning. En detaljert protokoll er gitt her, som dekker alle trinnene som kreves fra den første pupae forberedelse (dvs. iscenesettelse og bildebehandling) til utvinning og kvantifisering av retningsretningsitet og orientering funksjoner. Vi beskriver også hvordan man utlede lokale vevsegenskaper fra analysen av cellekloner. Alle de beskrevne trinnene er minimalt invasive og tillater langsiktige live analyser. Metodene som er beskrevet her, kan enkelt tilpasses og brukes på andre utviklingsstadier, vev eller modellorganismer.
Lang rekkevidde er en viktig egenskap ved de fleste funksjonelle fysiologiske enheter. Under morfogenese oppnås orden gjennom integrering av komplekse instruksjoner implementert med høy temporal og romlig presisjon. Flere og multilevel begrensninger er integrert i stereotype vev ordninger.
Polaritet og retningsbestemthet er avgjørende for å bestille romlig ordning under utvikling. Polaritet innebærer symmetribrudd under utviklingen. Oppnåelse av asymmetri er nødvendig for fastsettelse a…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke medlemmer av Martín-Blanco-laboratoriet for nyttige diskusjoner. Vi takker også Nic Tapon (The Crick Institute, London, STORBRITANNIA), Bloomington Stock Center (University of Indiana, USA) og FlyBase (for Drosophila genmerknad). Federica Mangione ble støttet av et JAE-CSIC predoktorstipend. Martín-Blanco-laboratoriet ble finansiert fra Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P og BFU2017-82876-P) og fra Fundación Ramón Areces.
Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |