Här presenterar vi ett protokoll med vilket pre-och/eller postsynaptiska kalcium kan visualiseras i samband med Drosophila inlärning och minne. In vivo kalcium avbildning med hjälp av synaptically lokaliserade kalcium sensorer kombineras med en klassisk lukt Konditionerings paradigm så att den synaptiska plasticitet som ligger bakom denna typ av associativt lärande kan bestämmas.
Årtionden av forskning i många modellorganismer har lett till det nuvarande konceptet av synaptisk plasticitet underliggande inlärning och minnesbildning. Lärande-inducerad förändringar i synaptisk transmission är ofta fördelade över många nervceller och nivåer av behandling i hjärnan. Därför, metoder för att visualisera inlärnings beroende synaptisk plasticitet över nervceller behövs. Frukten flyger Drosophila melanogaster representerar en särskilt gynnsam modell organism för att studera neuronala kretsar underliggande inlärning. Det protokoll som presenteras här visar ett sätt på vilket de processer som ligger till grund för bildandet av associativa lukt minnen, det vill säga synaptisk aktivitet och deras förändringar, kan övervakas in vivo. Med hjälp av det breda spektrum av genetiska verktyg som finns i Drosophilaär det möjligt att uttryckligen uttrycka genetiskt kodade kalcium indikatorer i bestämda cellpopulationer och till och med enstaka celler. Genom att fastställa en fluga på plats, och öppna huvudet kapseln, är det möjligt att visualisera kalciumdynamiken i dessa celler samtidigt leverera lukt stimuli. Dessutom visar vi en uppsättning där flugan kan utsättas, samtidigt, till elektriska stötar till kroppen. Detta ger ett system där flugor kan genomgå klassisk lukt konditionering-varvid en tidigare naiv lukt är lärt sig att förknippas med elektrisk chock straff-samtidigt som representationen av denna lukt (och andra otränade lukter) är observerats i hjärnan via två-Photon mikroskopi. Vårt labb har tidigare rapporterat generering av synaptically lokaliserade kalcium sensorer, vilket gör att man kan begränsa fluorescerande kalcium signaler till pre-eller postsynaptiska fack. Två-Photon mikroskopi ger ett sätt att rumsligt lösa fina strukturer. Vi exemplifierar detta genom att fokusera på nervceller som integrerar information från svamp kroppen, en högre ordningens centrum av insekten hjärnan. Sammantaget ger detta protokoll en metod för att undersöka synaptiska anslutningar mellan nervceller vars aktivitet är modulerad som ett resultat av luktsinnet lärande.
Att dechiffrera var och hur informationen förvärvas i hjärnan genom inlärning och därefter lagras som minne utgör en av de mest utmanande uppgifterna i neurovetenskap1. Neurovetenskaplig forskning har lett till begreppet förändring i synaptisk transmission som neuronala substrat som ligger bakom inlärning och minnesbildning2,3. Det är en hypotes om att, under inlärning, synaptiska anslutningar mellan neuronala ensembler som är aktiva under uppfattningen av en stimulans bli modifierad så att deras kombinerade aktivitet mönstret kan hämtas under minne minns, vilket instruerar framtida beteendemässiga åtgärd4. Dessa “engram celler” och deras synapser är ofta fördelade över hjärnans regioner och nivåer av bearbetning, vilket gör det svårt att tilldela observerade förändringar i synaptisk transmission till inlärning av en uppgift eller en stimulans. Att lokalisera och visualisera de synaptiska förändringar som är causally kopplade till en specifik inlärnings uppgift man behöver en lämplig modellsystem som gör det möjligt att exakt begränsa dessa synapser.
För en sådan strävan, Drosophila melanogaster är särskilt lämplig eftersom den kombinerar relativ hjärna enkelhet, beteendemässiga rikedom, och experimentell tillgänglighet. Bland de väletablerade modellorganismerna ligger Drosophila mellan Nematoden C. elegans och genetiskt tractable däggdjur som möss när det gäller neuronala komplexitet. Det stereotypic antalet neuroner (~ 300) och begränsad beteendemässiga repertoar observeras i C. elegans. Däggdjur, å andra sidan, har miljontals nervceller och svindlande beteendemässiga komplexitet. Hjärnan av frukten flyga är, med sin ~ 100 000, nervceller betydligt mindre än hjärnan hos de flesta ryggradsdjur, och många av nervceller är individuellt identifierbara5. Ändå visar Drosophila ett brett spektrum av komplexa beteenden, inklusive en förmåga att uppvisa robust associativt lukt lärande och minnesbildning, först beskrev över 40 år sedan6. Under loppet av denna klassiska konditioneringen förfarande, grupper av flugor utsätts för en lukt som den konditionerade stimulus (CS+) medan de får en straffa elektrisk chock som obetingad stimulans (USA). En andra lukt (CS–) presenteras sedan utan bestraffning. Därmed, djuren lär sig att undvika lukten i samband med bestraffning, som kan testas i en senare valsituation mellan de två lukter, CS+ och cs–. Arbetet med att dissekera det neuronala underlaget bakom detta beteende i Drosophila har identifierat svamp kroppar (MB) som den primära platsen för “engram”7,8,9,10 och, därför, kretsen av denna hjärna regionen var och är föremål för intensiv forskning för att avslöja den logik genom vilken ett minne engram förvärvas och lagras (nyligen granskats i11,12).
Den Drosophila MB består av ~ 2 000 inneboende nervceller (Kenyon celler) per halvklotet, organiserade i parallella axonala projektioner13. Axoner av lukt projektion nervceller utvidgas till den laterala protocerebra och till MB calyces, den viktigaste dendritiska inmatnings platsen för MB och få lukt input från på lobes. Den långa, parallella axoner bunt Kenyon celler utgör stjälken och loberna. De flesta Kenyon celler dela bildar horisontella β/β’-lober genom att utvidga en säkerhet mot mittlinjen i hjärnan, och den vertikala α/α’-lobes genom att förlänga andra säkerheter projicering i dorsala-främre riktning. Den andra gruppen av Kenyon celler bildar den horisontella γ-loberna13 i MB där inlärningsprocessen och efterföljande kortsiktiga minnesbildning kan lokaliseras10. Den MB lober få afferenta input och ge efferent utgång, som båda är typiskt begränsad till distinkta compartmental sub-regioner längs Kenyon cellen axoner14,15,16. I synnerhet, afferenta dopaminerga MB input nervceller har visat sig medla värdebaserad, t. ex., straffande, förstärkande effekter i associativt lukt lärande15,17. Stereotypic och individuellt identifierbar efferent MB utgång nervceller från svampen kroppen lober integrera information över ett stort antal Kenyon celler, mål olika hjärnområden och bära beteende-Instruktiv aptitretande eller aversiva information15 . Denna neuronala arkitektur har lett till ett koncept för organisationen av associativa engram. Lukter är relativt exakt kodade av glest aktiverade ensembler av Kenyon celler. Den sammanfallande aktiviteten av dessa Kenyon cell ensembler och frisättning av dopamin-framkallat genom att straffa stimuli-modulerar överföring från Kenyon cell presynapses på MB utgång nervceller så att djuren kommer därefter att undvika denna lukt10 ,12. Vi använder detta ganska exakt definierade och lokaliserade engram som ett paradigmatisk fall för att illustrera hur dessa lärande-beroende förändringar i synaptisk aktivitet kan bestämmas och övervakas.
Värdet av Drosophila som modellsystem förlitar sig starkt på den oöverträffade genetiska verktygslådan som tillåter en att uttrycka transgener för att identifiera, övervaka och kontrollera enstaka neuroner inom komplexa kretsar18. Tillkomsten av tekniker för neuronala aktivitet övervakning-såsom kalcium avbildning, diskuteras här-har tillåtit för bestämning av neuronala aktivitetsmönster som svar på en viss stimulans. Genom att kombinera specifika Gal4-driven uttryck av genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) med lukt stimulering, kan man visualisera lukt-framkallade kalciumdynamiken i neuroner av intresse19. I detta protokoll visas att genom att ytterligare koppla denna teknik med en klassisk konditionering paradigm, är det möjligt att undersöka dessa lukt svar i samband med inlärning. Inlärningsinducerad plasticitet kan ytterligare dissekeras med hjälp av GECIs som inte bara är lokaliserade till en enda specifik neuron, men också till specifika underavdelningar av en neuron. Pech et al.20 har etablerat ett urval av verktyg som tillåter just detta. Genom att rikta GCaMP321 till antingen pre-eller postsynapse-via länkning till ryggradsdjur Synaptophysin eller dHomer, respektive20-differentiell modulering av dessa platser kan särskiljas. Denna lokalisering ger i detta sammanhang en fördel framför de flesta GECIs som är ubiquitously närvarande i hela Cytosol-t. ex.,GCaMP GCaMP321, eller GCaMP623 -eftersom det innebär att pre-och postsynaptiska transienter kan vara skiljas från den totala integrerade kalcium tillströmningen som uppstår som ett resultat av neuron aktivering. Detta kan ge ledtrådar om platsen och typer av plasticitet som uppstår till följd av eller som orsakar inlärning och minnesbildning. Som ett exempel, det protokoll som här visar värdet av detta verktyg i dechiffrera modulering av MB utdata neuroner under lukt associativt lärande genom att rikta uttrycket av kalcium sensorn endast postsynapsen. Genom att övervaka, inom en individuell fluga, lukt-framkallat aktivitet före och efter luktsinnet konditionering en direkt jämförelse kan dras mellan en naiv lukt svar och en lärd lukt svar. Medan fast i samma bild kammaren, flugor utsätts för ett urval av lukter. Sedan får de en aversiva associativa Conditioning Protocol där en av dessa lukter är ihopkopplad med elektriska stötar (blir cs+) och en annan lukt presenteras utan förstärkning (blir cs–). Slutligen är flugorna återigen utsätts för samma lukt som i det första steget. Kalciumdynamik observeras med hjälp av två-Photon mikroskopi.
Dissektion av neurala kretsar underliggande inlärning och minne är ett framträdande mål inom neurovetenskap. Den genetiska tillgängligheten av Drosophila och bredden och enkelheten i beteendemässiga tester gör detta till ett idealiskt verktyg för att undersöka sådana fenomen. Här är en metod som presenteras med vilken det är möjligt att visualisera, inom enskilda flugor, modulering som sker på en subcellulär nivå som en följd av luktsinnet konditionering. Genom att utföra både pre-utbildning …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av det tyska forskningsrådet genom samverkande Research Center SFB 889 “mekanismer för sensorisk bearbetning” och forskningsenheten för 2705 “dissektion av en hjärn krets: struktur, plasticitet och beteendemässiga funktion av Drosophila svamp kropp “.
1-Octen-3-ol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | O5284 | Chemical used as odorant |
3-Octanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 218405 | Chemical used as odorant |
4-Methylcyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 153095 | Chemical used as odorant |
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | ||
Clear adhesive tape | Tesa SE, Norderstedt, Germany | Standard claer adhesive tape | |
Concave-convex jaws | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 10053-09 | Blade Holders with concave-convex jaws |
Fine forceps | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 11412-11 | Forceps with tip 0.1 x 0.06mm |
Hypodermic needle | Sterican – B. Braun, Melsungenk, Germany | 4665120 | 1.20x40mm |
Insect Minutien pins | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 26002-10 | Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm |
Kentoflow | Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK | 953683 | Blue light-curing glue |
Microscope slide | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0656.1 | Standard objective slide 76 x 26 mm |
Mineral oil | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M8410 | Used as diluent for odorants |
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | Tunable infrared femtosecond laser | |
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices. | |
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | 421452-9900-000 | Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm |
Ringer's solution | n.a. | n.a. | 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4 |
Stab knife | Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA | 72-1551 | 5.0mm Straight restricted blade depth |
Surgical scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0303 | Product No. 11 |
Surgical scalpel handle | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0907 | Product No. 7S/S |
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope. |
Custom-written and available upon request | n.a. | n.a. |