Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Oligomerisierungsdynamik von Zelloberflächenrezeptoren in lebenden Zellen durch totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie kombiniert mit Zahlen- und Helligkeitsanalyse

Published: November 6, 2019 doi: 10.3791/60398
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1,2
1Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain, 2Centro di Imaging Sperimentale, Ospedale San Raffaele, Milan, Italy, 3Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy

Summary

Wir beschreiben einen bildgebenden Ansatz zur Bestimmung des durchschnittlichen oligomeren Zustands von mEGFP-getaggten Rezeptor-Oligomeren, die durch Ligandenbindung in der Plasmamembran lebender Zellen induziert werden. Das Protokoll basiert auf der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie in Kombination mit der Number and Brightness (N&B)-Analyse.

Abstract

Trotz der Bedeutung und Allgegenwart der Rezeptor-Oligomerisierung sind nur wenige Methoden zum Erkennen von Clustering-Ereignissen und zur Messung des Clustering-Grades anwendbar. Hier beschreiben wir einen bildgebenden Ansatz zur Bestimmung des durchschnittlichen oligomeren Zustands von mEGFP-getaggten Rezeptor-Homokomplexen in der Membran lebender Zellen. Das Protokoll basiert auf der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie in Kombination mit der Number and Brightness (N&B)-Analyse. N&B ist eine Methode ähnlich der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) und dem Photonenzählhistogramm (PCH), die auf der statistischen Analyse der Schwankungen der Fluoreszenzintensität von Fluorophoren basieren, die in und aus einer Beleuchtung diffundieren. Volumen während einer Beobachtungszeit. Insbesondere ist N&B eine Vereinfachung von PCH, um Informationen über die durchschnittliche Anzahl von Proteinen in oligomeren Mischungen zu erhalten. Die Intensitätsschwankungsamplituden werden durch die molekulare Helligkeit des Fluorophors und die durchschnittliche Anzahl von Fluorophoren innerhalb des Beleuchtungsvolumens beschrieben. N&B berücksichtigt daher nur den ersten und zweiten Moment der Amplitudenverteilung, nämlich die mittlere Intensität und die Varianz. Dies ist gleichzeitig die Stärke und schwächelinde Methode. Da nur zwei Momente berücksichtigt werden, kann N&B den molaren Anteil unbekannter Oligomere in einer Mischung nicht bestimmen, sondern schätzt nur den durchschnittlichen Oligomerisierungszustand der Mischung. Dennoch kann es auf relativ kleine Zeitreihen (im Vergleich zu anderen Momentmethoden) von Bildern von lebenden Zellen pixelweise angewendet werden, einfach durch die Überwachung der Zeitschwankungen der Fluoreszenzintensität. Es reduziert die effektive Zeit pro Pixel auf wenige Mikrosekunden, wodurch die Erfassung im Zeitbereich von Sekunden bis Millisekunden möglich ist, was für eine schnelle Oligomerisierungskinetik erforderlich ist. Schließlich können große Zellbereiche sowie subzelluläre Kompartimente erkundet werden.

Introduction

Wir beschreiben einen Bildansatz der totalen inneren Reflexionfluoreszenz-Anzahl und Helligkeit (TIRF-N&B) zur Bestimmung des durchschnittlichen oligomeren Zustands von Rezeptormolekülen an der Plasmamembran lebender Zellen mit dem Ziel, die Rezeptor-Baugruppe zu verknüpfen. Dynamik zur biologischen Funktion der Proteine (Abbildung 1).

Bei extrazellulärer Ligandenbindung initiieren Rezeptoren die intrazelluläre Signaltransduktion in Abhängigkeit von ihrer Konformation, Oligomerisierung, potenziellen Co-Rezeptoren und Membranzusammensetzung. Trotz der Bedeutung und Allgegenwart der Rezeptor-Oligomerisierung, anerkannt als schlüsseleines Ereignis in der zellulären Signalisierung1,2,3,4,5,6, 7können nur wenige Methoden Clustering-Ereignisse erkennen und den Grad des Clusterings experimentell messen8,9. Das konfokale Volumen (x,y bei 300 nm, z x 900 nm) ist für den Nachweis der molekularen Interaktion und Stoichiometrie nicht ausreichend aufgelöst, auch nach der Optimierung durch Bildwiederherstellungsalgorithmen10. Die Untereinheitszusammensetzung von Proteinoligomeren kann nicht auch nur durch Superauflösungsmethoden bei einer Auflösung von 20-70 nm wie PALM11, STORM12und STED13rein räumlich gelöst werden. Darüber hinaus kann ihre zeitliche Auflösung (in der Reihenfolge von Minuten pro Bild) der Kinetik im Sekundenbereich nicht folgen. Einzelne Molekül-Stepbleichung löst die Stoichiometrie von Protein-Oligomeren nur, wenn sie unbeweglich sind14.

Eine der vielseitigsten Methoden zur Messung der Dichte und Oligomerisierung fluoreszierender Proteine in Einzelbildern ist die räumliche Intensitätsverteilungsanalyse (SpIDA), die auf räumlicher Probenahme beruht. Es ist sowohl auf chemisch fixierte als auch auf lebende Zellen anwendbar und ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Interessenbereiche der Zelle mit Standardfluoreszenzmikroskopie15. Alternativ eignen sich Momentmethoden wie Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS)16, Photonenzählhistogramm (PCH)17und Zahl und Helligkeit (N&B)18,19, für quantitative oligomere Messungen. Diese Methoden analysieren die Fluoreszenzintensitätsschwankungen, die in der Zeit beobachtet werden können, wenn die Fluorophore in und aus einem Beleuchtungsvolumen diffundieren. Die Amplituden der Intensitätsschwankungen können eindeutig durch die molekulare Helligkeit des Fluorophors () und die durchschnittliche Anzahl der Fluorophore (n) innerhalb des Beleuchtungsvolumens17 (Abbildung 2) beschrieben werden. Typischerweise können der Diffusionskoeffizient der Fluorophore und die durchschnittliche Anzahl der Moleküle (umgekehrt bezogen auf den G(0)-Wert) innerhalb des Beleuchtungsvolumens durch FCS20ermittelt werden. Da die Diffusionszeit jedoch nur mit der kubischen Wurzel der Masse skaliert, ist FCS nicht empfindlich genug, um Veränderungen in der Molekularmasse21zu erkennen. In der Praxis kann einfarbiges FCS die Dimerisierung von Membranrezeptoren nicht erkennen. PCH löst Mischungen verschiedener Oligomere genau auf. Mit mehr als zwei Momenten der Amplitudenverteilung erkennt es Moleküle unterschiedlicher Helligkeit, die das gleiche Beleuchtungsvolumen belegen. Scannen von FCS22 und Entwicklungen, wie z. B. der interessante Paarkorrelationsansatz der molekularen Helligkeit (pCOMB)23, eingeführt, um den Alikatbereich der Anwendbarkeit von Fluoreszenzkorrelationsmethoden in biologischen Systemen zu erweitern24 bleiben Einzelpunktmethoden, denen die Fähigkeit zu schnellen Messungen in einem großen Zellbereich fehlt, was viele aufeinander folgende Beobachtungen an jedem Pixel und die Datenerfassung in der Reihenfolge von Sekunden erfordert.

N&B ist eine vereinfachte Version von PCH, die nur den ersten und zweiten Moment der Amplitude der Fluoreszenzverteilung berücksichtigt, nämlich die mittlere Intensität, , und die Varianz,2 (Abbildung 2)18,19 und aus diesem Grund kann sie den mollaren Anteil unbekannter Oligomere in einer Mischung nicht bestimmen, sondern schätzt nur den durchschnittlichen Oligomerisierungszustand der Mischung. Dennoch hat N&B den Vorteil, mit relativ kleineren Zeitreihen von Bildern von Lebendenzellen als PCH pixelweise zu arbeiten, indem einfach die Zeitlichen schwankungen der Fluoreszenzintensität überwacht werden. Da N&B die Zeit pro Pixel auf wenige Mikrosekunden reduziert, kann es einer schnellen Oligomerisierungskinetik über große Zellbereiche folgen und eine Bildaufnahme auf einer Zeitskala von Sekunden in der Raster-Scanmikroskopie (z. B. konfokale, 2-photon) und Millisekunden ermöglichen. in der kamerabasierten Mikroskopie (z.B. TIRFM).

Mehrere Berichte haben die Fähigkeit von N&B gezeigt, die Anzahl der Untereinheiten in Proteinclustern zu quantifizieren, indem erweiterte Zellregionen geabbildungen. Paxillin-EGFP-Cluster wurden an den Haftstellen in den CHO-K1-Zellen25nachgewiesen und die intrazelluläre Aggregation des pathogenen Httex1p-Peptids in COS-7-Zellen26beschrieben. N&B wurde nach der Liganden-gesteuerten Oligomerisierung des ErbB-Rezeptors27und der Wirkung des Liganden FGF21 auf Klothob (KLB) und FGFR1c in den HeLa-Zellen28angewendet. Die Kombination von TIRF-Bildgebung und N&B-Analyse wurde verwendet, um zu zeigen, dass Dynamin-2 in erster Linie tetramerisch in der gesamten Zellmembran29ist. Wir haben N&B sowohl auf Raster-Scanning als auch auf TIRF-Bilder angewendet, um die Liganden-gesteuerte Dimerisierung von uPAR- und FGFR1-Zellmembranrezeptoren30,31zu beweisen.

Fluoreszenzkorrelationsmethoden wie N&B, FCS und PCH basieren auf der Vorstellung, dass in einem offenen Volumen die Besatzungszahl der Teilchen einer Poisson-Verteilung folgt. Da nur die Photonen, die die Fluorophore emittieren, erkannt werden können, ist der Mittelwert für eine gemessene Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Zeit in einem Pixel des Bildes, das Produkt der durchschnittlichen Anzahl von Fluorophoren im Beleuchtungsvolumen, n, und molekulare Helligkeit, Nr.17:

wobei die Anzahl der Photonen, die pro Zeiteinheit (konventionell pro Sekunde) pro Molekül emittiert werden, wenn sich das Molekül im Zentrum des Beleuchtungsvolumens befindet.

Helligkeit ist eine Eigenschaft jedes Fluorophors in einer bestimmten Anschaffung eingerichtet, während Intensität ist die Summe aller Beiträge aus allen Fluorophoren. In biologischen Wettbewerben wird die Helligkeit mit der Zunahme der Anzahl der Fluorophore, die zusammen schwanken, zunehmen, was Informationen über den Oligomerisierungszustand des fluoreszierend getaggten Proteins gibt. Die Fluktuationsamplituden an einem bestimmten Pixel werden anhand der Varianz des Fluoreszenzsignals gemessen,2:

Wobei der Mittelwert des Quadrats der Intensität , und das Quadrat des Mittelwerts der Intensität , aus den individuellen Intensitätswerten in jedem Pixel jedes Frames berechnet werden:

wobei K die Anzahl der Gesamtframes in der Zeitreihe ist. Experimentell ist es notwendig, für die gesamte Bildreihe die Varianz zu berechnen, die die Streuung der einzelnen Intensitätswerte an jedem Pixel eines einzelnen Bildes um den mittleren Intensitätswert beschreibt. Die Varianz umfasst alle Schwankungen unterschiedlicher Herkunft. In einer ersten Annäherung kann die Varianz durch die diffundierenden Partikel im Beleuchtungsvolumen,20, durch das Detektor-Schussrauschen von der Varianz getrennt werden,2d. Die beiden Varianzen sind unabhängig; somit wird die Gesamtabweichung durch ihre Summe angegeben:

Die Varianz aufgrund molekularer Schwankungen im und aus dem Nachweisvolumen ist linear abhängig von der molekularen Helligkeit und Intensität:

Neuanordnung eq. 6 nach 1q. 1:

Nach dem typischen Konzept der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie besagt Gleichung 7, dass die Varianz aufgrund der Anzahl der Schwankungen vom Quadrat der Partikelhelligkeit abhängt.

Dann ist die Varianz aufgrund von Detektorschwankungen eine lineare Funktion der erfassten Intensität, unter der Annahme, dass der Detektor unterhalb seiner Sättigungsgrenze19betrieben wird:

Bei Photonenzähldetektoren a=1 und c=0 entspricht die Detektorvarianz also der durchschnittlichen Intensität:

Um diese Konzepte auf reale Messungen in lebenden Zellen anzuwenden, definieren Gratton und Kollegen18 die scheinbare Helligkeit B für jedes Pixel als Verhältnis der Varianz zur durchschnittlichen Intensität:

B ist der Parameter, der experimentell gemessen wird. In dieser Arbeit werden Zeitreihenbilder von FGFR1-Rezeptoren an der Plasmamembran von HeLa-Zellen durch die TIRF-Mikroskopie erfasst und die durchschnittliche scheinbare Helligkeit B wird durch die N&B-Analyse bestimmt. Dann, nach Zugabe von FGF2, werden aufeinander folgende Zeitreihen erfasst, um die Veränderungen in der Selbstmontage der Rezeptormoleküle in der Membranoberfläche nach der Stimulation des Rezeptors mit dem kanonischen Liganden zu verfolgen.

Da es sich bei dem Detektor des TIRF-Mikroskops jedoch um eine EMVD-Kamera handelt, muss der Ausdruck für die scheinbare Helligkeit als19geändert werden:

wobei der Offset der Intensitätsausgleich der Erkennungselektronik ist, der ein Merkmal der Detektoreinstellungen ist. Die Varianz und die durchschnittliche Intensität eines analogen Detektors werden jeweils angegeben durch:

wobei G die analoge Verstärkung in digitalen Pegeln (DL/Photonen), S, die digitalen Pegel pro Photon19, durch die Steigung eines Intensitäts-Gegen-Varianzdiagramms für eine Lichtquelle mit konstanter Intensität (keine zeitlichen Schwankungen) angegeben wird. Der Faktor ist mit der Form des Pixelerkennungsvolumens verknüpft. Nach Hassler et al.32beträgt der Faktor 0,3 für die TIRF-Bildgebung, die mit der maximalen Verstärkung der Detektionskamera19arbeitet. Die Offset-, S- und G-Parameter sind Merkmale der Kamera und des Mikroskops. Die scheinbare Helligkeit B wird durch Neuanordnung von 11 nach 12 und 13 erreicht:

Experimentell ist die s eine komplexe Funktion der Laserintensität und der Detektionseffizienz des Systems. Da B/S jedoch linear von der Abhängigkeit von - abhängig ist, ist es nur wichtig, den relativen Wert von . für einen bestimmten Erkennungsmodus zu bestimmen:

wobei das S' proportional zu . Dennoch wird eine Kalibrierung mit einem internen Verweis durchgeführt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Probenvorbereitung

  1. Tag 1. Saat-HeLa-Zellen in vollständiger Medium mit einer Konzentration von 100.000-200.000 Zelle/ml in Glasbodenschalen. Samen 6-8 replizieren Gerichte.
    HINWEIS: In diesem Beispiel wird das Medium durch 10% hitzeinaktiviertes Fetal Bovine Serum (FBS), 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/100 g Penicillin/Streptomycin ergänzt. Mehrere nachgebildete Gerichte werden zubereitet.
  2. Tag 2-3. Wenn Zellen in Subkonfluenz sind, transfezieren Sie die Hälfte der Gerichte mit dem Proteinplasmid und die zweite Hälfte mit Referenzplasmiden (Monomer und Dimer), in serumfreiem Medium.
    HINWEIS: Transfektion erfolgt in serumfreiem Medium, ergänzt mit Antibiotika, 0,1% Rinderserum Albumin und 25 mM HEPES Puffer, ohne Phenol Red.
  3. Tag 3-4. Überprüfen Sie, ob die transfizierten Zellen an der Unterseite des Geschirrs haften und die Zellmembran fluoreszierend ist. Entsorgen Sie Gerichte mit überwucherten Zellen oder mit sehr geringer Fluoreszenz.
    HINWEIS: Lassen Sie Zellen nicht überwachsen. Die Zellen müssen gut verteilt sein und an der Glasfläche der Schale haften (Abbildung 1A). Vorbeschichtete Glasbodenschalen können zur Begünstigung der Zellhaftung verwendet werden. Die Zellkultur wird vor jedem Experiment auf Mykoplasmenkontamination getestet. In diesem Beispiel werden Zellen mit einem (A207K)mEGFP-FGFR1-Plasmid transfiziert und die Referenzzellen mit einem GPI-(A207K)mEGFP und einem GPI-(A207K)mEGFP-(A207K)mEGFP-plasmids unter Verwendung von Standardprotokollen transfiziert. Für die Live-Zellmikroskopie wird ein indikatorfreies Medium empfohlen; 25 mM HEPES Puffer wird hinzugefügt, um pH-Änderungen während der Bildgebung zu verhindern.

2. TIRF Imaging — Ausrichtung der Laserlinie und Optimierung der TIRF-Beleuchtung

  1. Aktivieren Sie vier Stunden vor dem Experiment den Temperaturinkubator des Mikroskops bei 37 °C.
  2. Schalten Sie das Mikroskop, Computer und Kameras ein und warten Sie, bis die Kameras die richtige Arbeitstemperatur erreichen.
    HINWEIS: Die Arbeitstemperatur der in dieser Studie verwendeten Kamera beträgt -75 °C.
  3. Legen Sie einen kleinen Tropfen Öl auf das Ziel. Legen Sie eine Probeschale an Ort und Stelle. Schließen Sie die Türen des Inkubators und lassen Sie die Temperatur der Schale ausdemadien (ca. 10 min).
  4. Schalten Sie die Epifluoreszenzlampe und den 488 nm-Laser ein.
  5. Wählen Sie den Epifluoreszenzkontrastmodus aus, um die Probe zu untersuchen, und suchen Sie eine Zelle, um sie vom Okular aus zu fokussieren.
    HINWEIS: Die Verwendung einer Leuchtstofflampe zur Suche nach Zellen durch das Okular ist nicht obligatorisch. Stattdessen kann eine geeignete Laserlinie verwendet werden.
  6. Wählen Sie den richtigen Filter für die Erfassung der grünen Emission durch die Mikroskopkamera (Band Pass Ex 490/20 (500) Band Pass Em 525/50, oder ähnlich.
  7. Wechseln Sie im Epifluoreszenzmodus vom Okular zum Kameraanschluss (Kamera-#1 in Abbildung 1),verfeinern Sie den Fokus und wechseln Sie in den TIRF-Modus. Epifluoreszenz- und TIRF-Modi können je nach Marke des Mikroskops mit einer anderen Nomenklatur benannt werden.
    HINWEIS: Es kann Probleme beim Fokussieren oder Ausrichten des Lasers geben, wenn sich an der Deckblattschnittstelle keine Fluoreszenzmarker befinden. Um den Laser richtig auszurichten (wichtig für eine gute TIRF), konzentrieren Sie sich auf den Deckel. Es ist oft sehr schwierig festzustellen, ob der Coverslip im Fokus steht. Konzentrieren Sie sich als Vorschlag auf die Ränder der Zellen.
  8. Aktivieren Sie die automatische Ausrichtung gemäß den Anweisungen des TIRF-Mikroskops.
    HINWEIS: Kurz gesagt, für Schritte von 2.4 bis 2.8, zuerst finden Sie die Zellen durch das Okular und fokussieren Sie sich auf sie, dann senden Sie die Emission an den Kameraanschluss des TIRF-Mikroskops, fokussieren Sie die Zellen auf dem Mikroskopcomputerbildschirm neu und aktivieren Sie das Verfahren für die Laserausrichtung. Die Ausrichtung besteht darin, den kritischen Winkel zu finden, in dem die Beleuchtung verzweiumst wird (Abbildung 3). Kommerzielle Mikroskope können leicht unterschiedliche Ausrichtungsprotokolle aufweisen und auch voll automatisiert sein; andere verfügen möglicherweise über eine kleine Kamera, um die Visualisierung der kritischen Winkelbedingungen zu erleichtern.
  9. Wählen Sie eine geeignete Beleuchtungstiefe und optimieren Sie die Richtung des Evaneszenzfeldes (Abbildung 3).
    HINWEIS: Die Eindringtiefe wird für alle Kontrollen und Proben konstant gehalten.

3. TIRF Imaging: Erfassung der Zeitreihen

  1. Definieren Sie einen Bereich von Interesse (ROI) von mindestens 256 x 256 Pixeln.
    HINWEIS: In dieser Einrichtung erfolgt die Aufnahme mit #2 unter Software, die nur die Kamera direkt steuert (siehe Abbildung 1 Legende).
  2. Stellen Sie die Belichtungsposition auf 1 ms und die EM-Verstärkung auf 1.000 (dies ist der G-Faktor in 12 und 13). Bei einer solchen Geschwindigkeit kann es notwendig sein, die Laserleistung anzupassen oder zu erhöhen. Hier beträgt die Laserleistung 0,5 mW.
    HINWEIS: Je nach Art der Kamera und den Grenzwerten, die durch den Diffusionskoeffizienten des Proteins, die Fluoreszenzintensität und den Hintergrund auferlegt werden, bestehen die allgemeinen Kriterien für die Einstellung der Laserleistung nicht darin, den Detektor zu sättigen, photobleichen zu minimieren und schnell wie möglich bei einem vernünftigen S/N. Die EM-Verstärkung wird immer auf das Maximum der Kamera eingestellt (siehe Einleitung).
  3. Führen Sie eine erste Testsequenz unter anfangsbedingungen aus und schätzen Sie den S/N-Wert grob. Die Bedingungen sind bei S/N = 2-3 oder höher akzeptabel, gemessen im ersten Frame der ersten Zeitreihe.
  4. Verwenden Sie den Schieberegler des Emissionsspaltsystems, das die Kamera #2 zum Mikroskop verbindet, um eine Seite des Bildes zu maskieren (Abbildung 1B, Abbildung 4A-B)
    HINWEIS: In diesem Aufbau wird ein Mehrkanal-Bildverbinder auf der Kamera installiert #2 um die Gleichzeitige Erfassung von zwei räumlich identischen Bildern zu ermöglichen. Das System ist mit Dias für die Montage verschiedener Emissionsfilter ausgestattet. Einer der Schieberegler montiert eine schwarze Maske, um eine Seite des Bildes zu bedecken. Der maskierte Bereich dient zur internen Kalibrierung jeder Zeitreihe, um die Kameraparameter (12 und 13) zu bestimmen. Auf diese Weise ist kein unabhängiger Kalibrierschritt erforderlich und, was wichtig ist, die Kalibrierung erfolgt parallel zur Erfassung jeder Zeitreihe. In Ermangelung dieses Systems kann die Kamera unter Anwendung der veröffentlichten Protokolle33kalibriert werden.
  5. Wählen Sie die Option zum automatischen Speichern der Kameradatei aus.
  6. Starten Sie die Erfassung der Bildserie. Erwerben Sie mindestens 700 Frames bei einem s/N-Verhältnis von 2.
    HINWEIS: Die Anzahl der für die Analyse erforderlichen Rahmen hängt von der Probenstabilität bis zum Photobleichmittel und der Streuung der Daten ab. Daher wird die Qualität jeder Zeitreihe während der N&B-Analyse bewertet.
  7. Ohne die Schale aus dem Mikroskop zu nehmen, fügen Sie den Liganden hinzu.
  8. Wählen Sie eine Zelle mit einer hellen Fluoreszenzmembran aus und starten Sie schnell die erste Zeitreihe des kinetischen Laufs.
    HINWEIS: Wenn die Zugabe des Ligands schnell erfolgt, legt diese erste Aufnahme den Punkt = 0 Zeit der Ligandenkinetik fest. Die Software registriert den genauen Zeitpunkt der Erfassung.
  9. Suchen Sie eine zweite Zelle und erfassen Sie den zweiten Zeitpunkt der Kinetik.
    HINWEIS: Point-Visiting-Routinen sind in einigen Mikroskopen mit x,y,z motorisierten Stufen ausgestattet. Diese ermöglichen das Auswendiglernen mehrerer Positionen auf der Zellschale und können dazu beitragen, ein konstanteres Zeitintervall zwischen Bildreihen auf verschiedenen Zellen zu halten.
  10. Erfassen Sie eine neue Zelle für jeden Zeitpunkt des kinetischen Laufs.
    HINWEIS: Nach der Aufnahme wird eine Zelle teilweise photobleached und kann nicht neu abgebildet werden. Aus diesem Grund wird die Kinetik durch die Kombination von Zeitreihen vieler Zellen erhalten, die jeweils zu einem anderen Zeitpunkt erfasst werden.
  11. Wiederholen Sie für jedes neue Gericht das Protokoll von Schritt 2.3 bis 3.9.
    HINWEIS: Für Referenzgerichte, fügen Sie ein Volumen des Fahrzeugs (PBS ergänzt mit 0,01% Rinderserumalbumin) entsprechend dem für den Liganden verwendeten.

4. Anzahl & Helligkeit (N&B): Qualitätsprüfung der Zeitreihen

  1. Konvertieren und speichern sie als . TIFF die Dateien mit der Kamera-Software (.sif Dateien in diesem Beispiel) erworben.
  2. Importieren. TIFF-Dateien in der Analysesoftware-Routine durch Aktivierung der N&B grafische benutzeroberfläche (GUI) MATLAB.
    HINWEIS: Hier wird eine angepasste ausführbare Matlab-N&B-Routine verwendet (N&B-Analyse bei https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). Durch Öffnen einer importierten . TIFF-Datei, erzeugt die Routine das durchschnittliche Intensitätsbild, das durchschnittliche Intensitätsprofil und ermöglicht die Überprüfung der Serie Frame-by-Frame (Ergänzende Abbildung 1). Für die N&B-Analyse (z.B. SimFCS-Software) stehen weitere Software zur Verfügung.
  3. Discard-Serien, bei denen das durchschnittliche Intensitätsprofil mehr als 10% Photobleaching zeigt, und Reihen, in denen es während der Erfassung eine offensichtliche Zellmembranverzerrung oder -übersetzung gegeben hat.
  4. Zuschneiden von Rahmen, die offensichtlich nicht im Fokus stehen.
    HINWEIS: Ein Zuschneidewerkzeug wird in der Routine implementiert, um einzelne oder mehrere Frames innerhalb der Bildreihe zu verwerfen. Dieser Vorgang ist zulässig, da die Frame-to-Frame-Zeit nicht entscheidend ist, während die Pixelverweilzeit (Belichtungszeit) (siehe Diskussion) ist.
  5. Halten Sie für die Analyse nur Serie mit mindestens 500 Zeitrahmen.

5. Anzahl & Helligkeit (N&B): Bestimmung der Kameraparameter (Offset, B und S)

  1. Aktivieren Sie die Routine Calibrate Camera.
  2. Wählen Sie einen Bereich von mindestens 20 x 50 Pixeln im Geräuschbereich des Detektors aus (Abbildung 4).
    HINWEIS: Die Routine stammt aus einem Histogramm der Werte (auch definiert digital Level, DL) und gibt ein Logarithmusdiagramm der Frequenz im Vergleich zu digitalen Ebenen zurück.
  3. Bewegen Sie im Diagramm "Log-Frequenz- und Digitalebene" den linearen roten Cursor, um den Gaußschen und den linearen Teil der Kurve abzugrenzen.
    HINWEIS: Der rote Cursor teilt die beiden Abschnitte der Kurve und aktiviert die Routine, die den Offset zurückgibt, der die Mitte der Gaußschen Funktion der Kameraantwort, das - der Gaußschen Passung und den S-Faktor ist, der die Steigung des linearen Teils der Kamera respons ist. e (Abbildung 4C-D).

6. Anzahl & Helligkeit (N&B): Berechnung der B-Werte in der ausgewählten Interessenregion (ROI)

  1. Aktivieren Sie die B-Taste.
    HINWEIS: Diese Aktion generiert das durchschnittliche Intensitätsbild(Abbildung 5, erste Spalte) und das B-Bild, in dem jeder einzelne B-Wert dem zugehörigen Pixel im Bild zugeordnet ist (Zusätzliche Abbildung 1).
  2. Wenden Sie eine Mindestbinning (2 2) an, um die Streuung der Daten zu reduzieren und das B-I-Histogramm zu generieren(Abbildung 5, zweite Spalte).
    HINWEIS: Das B-I-Histogramm stellt die Verteilung der B-Werte aller Pixel des Bildes im Vergleich zur Pixelintensität dar. Y = B/S; X = ( - Offset)/S (Ergänzende Abbildung 1 und 11 und 15).
  3. Überprüfen Sie das B-I-Histogramm mit dem interaktiven quadratischen Cursor.
  4. Wählen Sie einen quadratischen ROI für die Analyse aus(Abbildung 5, dritte Spalte).
    HINWEIS: Der Cursor synchronisiert eine mobile Maske auf dem durchschnittlichen Intensitätsbild und hebt die Pixel hervor, die innerhalb des quadratischen Cursorbereichs ausgewählt sind (Ergänzende Abbildung 1). Durch diese Inspektion ist es möglich, den Hintergrund und Bereiche mit sehr geringer Intensität aus der Analyse auszuschließen.
  5. Generieren Sie die B-Karte des ausgewählten ROI(Abbildung 5, vierte Spalte).
  6. Speichern Sie die ASCII-Datei der B-Werte, die der Auswahl zugeordnet sind.
  7. Importieren Sie die ASCII-Datei in eine Grafiksoftware, um die Frequenzverteilung der Daten zu berechnen und den durchschnittlichen B-Wert s.E zu erhalten (Abbildung 5, fünfte Spalte).
    HINWEIS: Wenn die Daten homogen sind, nähert sich die Frequenzverteilung der B-Werte einer Gaußschen Verteilung an.
  8. Wenden Sie 15 an, um die durchschnittliche Helligkeit = - 1 [(Zählungen/Molekül) pro Verweilzeit] für jede Zelle zu jedem Zeitpunkt des kinetischen Laufs abzuleiten. Normalisieren Sie die Daten nach:

    wobei der durchschnittliche B-Wert zum Zeitpunkt "t" nach Ligandzugabe gemessen wird, und der durchschnittliche B-Wert, der zum Zeitpunkt t=0 (10-20 s nach Ligandenzugabe) gemessen wird.
    HINWEIS: Die Normalisierung der Ergebnisse ermöglicht den direkten Vergleich von Experimenten, die an verschiedenen Tagen durchgeführt werden. Es kompensiert Unterschiede in der gemessenen Helligkeit durch Laserleistung und technische Schwankungen.
  9. Zeichnen Sie die normalisierte durchschnittliche Helligkeit im Vergleich zur Erfassungszeit, um den kinetischen Lauf zu erstellen (Abbildung 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Die Ergebnisse für zwei repräsentative HeLa-mEGFP-FGFR1-Zellen, die in derselben Kulturschale gesät sind, sind in Abbildung 5 und Ergänzender Tabelle 1dargestellt. Die beiden Zellen wurden zum Zeitpunkt 0 min(Abbildung 5A, oben) und 7 min (Abbildung 5A, unten) nach Zugabe des FGF2-Ligands erfasst.

Abbildung 5 zeigt auch die Ergebnisse zweier repräsentativer HeLa-Zellen, die entweder das reine Monomer GPI-mEGFP (Abbildung 5B, oben) oder das kovalent verknüpfte dimerische Fluorophor, GPI-mEGFP-mEGFP (Abbildung 5B, ), die an der Zellmembran ausgesetzt und unter den gleichen experimentellen Bedingungen erfasst werden.

Die durchschnittliche scheinbare Helligkeit, B, in den HeLa-mEGFP-FGFR1-Zellen steigt von 1.070 x 0,001 S.E. auf 1,141 x 0,001 S.E., während die Referenzmonomere (Abbildung 5B, oben) und dimer (Abbildung 5B, unten) Proben B zurückgeben Werte von 1,070 x 0,001 S.E. bzw. 1,141 bis 0,001 S.E. So ist der FGFR1-Rezeptor anfangs vor allem in monomerer Form an der Zellmembranoberfläche vorhanden, entwickelt sich aber bei der Stimulation mit seinem kanonischen Liganden FGF2 in einen vorherrschenden dimerischen Zustand. Im Durchschnitt ist der vorherrschende Zustand der FGFR1-Moleküle in den beiden repräsentativen Zellen dann deutlich unterschiedlich.

Durch die Anwendung der Analyse auf mehrere Zellen in der gleichen Schale, die jeweils zu einem anderen Zeitpunkt erfasst werden, wird die durchschnittliche Helligkeit als Funktion der Zeit ermittelt (Abbildung 6A). Der kinetische Lauf in Abbildung 6A beschreibt einen langsamen Dimerisierungsprozess, der mehrere Minuten an der Zelloberfläche anhält. Die FGF2-induzierte FGFR1-Dimerisierung und anschließende Internalisierung des Rezeptors ist ein bekannter Mechanismus34; Daher stimmen die Ergebnisse voll und ganz mit dem vorliegenden Begriff zur FGFR1-Signaltransduktion überein und bestätigen die Potenzialität des TIRF-N&B-Ansatzes zur Untersuchung der Oligomerisierung von Zellmembranproteinen bis zur Bestimmung subtiler Monomer-Dimer-Dynamik.

Die normalisierte durchschnittliche Helligkeitsanalyse der Ergebnisse ist ein geeignetes Werkzeug, um die Wirkung verschiedener Liganden auf denselben Rezeptor zu vergleichen. Ein Beispiel ist In Abbildung 6Bdargestellt. Das Protokoll wurde mit den gleichen Standards wiederholt und stimulierte die Zellen mit einem nicht-kanonischen FGFR1 Ligand, NCAM-Fc (50 g/ml). In diesem Fall zeigt das kinetische Profil schnelle und zyklische Übergänge des Rezeptors in oligomeren Mischungen, die auch Helligkeitswerte über denen des Dimers erreichen. Ein normalisierter Durchschnittswert von 3 wird wiederholt beobachtet. Die Begrenzung der N&B-Analyse (nur zwei Momente der Intensitätsschwankung im Vergleich zur Zeit werden berücksichtigt) erlaubt es jedoch nicht, zweifellos die Bildung einer trimerischen Form nachzuweisen. Die gleiche normalisierte durchschnittliche Helligkeit könnte das Ergebnis verschiedener Kombinationen von größeren Oligomeren und Monomeren des Rezeptors sein. Dennoch zeigen die Ergebnisse deutlich die räumlich zeitlichen Unterschiede der Wirkung der beiden Liganden auf denselben Rezeptor.

Figure 1
Abbildung 1: Übersicht über das experimentelle Protokoll. (A) Zellen werden auf Glasbodenschalen plattiert und mit dem fluoreszierend markierten Rezeptor transfiziert. (B) Zeitreihenbilder werden auf einem kommerziellen TIRF-Mikroskop mit einer TIRF 100x 1,46 Ölobjektiv- und Inkubatorkammer aufgenommen. In diesem kommerziellen Setup erlaubt die Software nicht, dass die integrierte EMCCD-Kamera #1 zu sehr kurzen Belichtungszeiten arbeiten kann, die für den Erwerb von N&B-Zeitreihen erforderlich sind. Dies ist ein wichtiger Punkt, da die Belichtungszeit den Bereich der molekularen Diffusionen begrenzt, die erfasst werden können. Je kürzer die Belichtungszeit, desto schneller kann die molekulare Diffusion analysiert werden. Expositionen von 0,5 bis 1 ms sind ausreichend schnell für die Membranproteindiffusion. Daher wird eine zweite EMCCD-Kamera (#2) zu einem zusätzlichen Port des Mikroskops hinzugefügt, um direkt unter der Kamerasoftware zu arbeiten und die Mikroskopsoftware zu umgehen. In dieser angepassten Konfiguration werden die Mikroskopsoftware und die Kamera-#1 nur für die TIRF-Ausrichtung verwendet. TIRF-Zeitreihen werden dann mit einer Kamera #2 erfasst, die bei sehr kurzen Belichtungszeiten wie 1 ms und bei maximaler EM-Verstärkung läuft. Kamera #2 hat auch eine Pixelgröße von 124 nm, die Übersampling und Binning der Bilder ermöglicht (siehe Protokoll Abschnitt 6.2). Andere Konfigurationen zur Bildgeschwindigkeit sind möglich, abhängig von den Eigenschaften der verschiedenen TIRF-Mikroskope, während die Verwendung von sCMOS-Kameras nicht ratsam ist, da Rauschen im Bild35nicht zufällig ist. (C) Nach der Erfassung werden Zeitreihen als Qualitätskontrolle geprüft. Serien werden verworfen, wenn die Photobleichung höher als 10 % ist, da sie durch Plotten der durchschnittlichen Frameintensität im Vergleich zur Framezahl bestimmt werden kann. Serien werden auch verworfen, wenn während des Erfassungs eine offensichtliche Verzerrung der Zellmembran oder der Übersetzung der Zelle aufgetreten ist. (D) Die durchschnittliche Intensität in jedem Pixel wird gespeichert. (E) Ein B-I Histogramm, das die scheinbare Helligkeit B in jedem Pixel des Bildes darstellt, wird generiert. (F) Das B-I Histogramm wird verwendet, um einen ROI auszuwählen, der über dem Hintergrund liegt. (G) Die Frequenzverteilung der B-Werte wird analysiert, um den durchschnittlichen B-Wert s.E. zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: N&B-Prinzip. N&B quantifiziert den durchschnittlichen Oligomerisierungszustand von Fluorophoren, indem die Fluoreszenzschwankungen gemessen werden, die auftreten, wenn sie sich beim Ein- und Ausziehen des Beleuchtungsvolumens während der Erfassung einer Zeitstapelreihe von "K"-Bildern bewegen. Die Amplitude der Schwankungen wird statistisch durch die Berechnung des Verhältnisses zwischen derVarianz des schwankenden Signals, 2 , und dem mittleren Intensitätswert, charakterisiert. Im einfachsten Szenario (A), wenn das Beleuchtungsvolumen leer ist (d. h. keine Fluorophore), beschreibt das Verhältnis Das Geräterauschen. Wenn das Fluoreszenzsignal aufgrund mobiler Fluorophore schwankt (B,C), ist die "extra" Varianz direkt proportional zur molekularen Helligkeit , (erkannte Photonzahl pro Molekül und pro Sekunde), der diffundierenden Moleküle. In (B) gibt es 8 monomere diffundierende Fluorophore und in (C), die gleichen Fluorophore diffundieren wie 2 tetramere Oligomere. In diesen beiden Fällen ist die durchschnittliche Intensität gleich, aber die Standardabweichung und Helligkeit sind unterschiedlich (1, 4", da die Amplituden der Schwankungen unterschiedlich sind. • = 0, wenn Fluorophore unbeweglich oder abwesend sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: TIRF-Mikroskopie. Obwohl N&B mit Rastermikroskopen, die mit Multiphotonen, kontinuierlichen Wellen- oder gepulsten Einzelphotonenlasern und analogen oder Photonenzähldetektoren ausgestattet sind, gleich gut läuft, ist die TIRF-Mikroskopie ideal für die schnelle zeitliche Bildgebung molekulardynamischer Ereignisse, die an oder in der Nähe der Zelloberfläche mit Geschwindigkeiten, Auflösung und Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) auftreten, die mit anderen bildgebenden Verfahren nicht erreicht werden können. (A) Die TIRF-Mikroskopie verwendet das Prinzip der totalen inneren Reflexion, bei der ein abgewinkeltes Anregungslaserlicht nur Fluorophore anregt, die sich direkt unter einer Glas-Wasser-Schnittstelle des Deckels befinden. Der Laser bestrahlt die Probe in einem Einfallswinkel, der größer oder gleich dem kritischen Brechungswinkel ist, während das Anregungslaserlicht vollständig reflektiert wird. Die Reflexion erzeugt ein sehr dünnes elektromagnetisches Feld in der Probe, die evanescent wave genannt wird. Das resultierende Fluoreszenzlicht, das von dem winzigen beleuchteten Abschnitt der Probe emittiert wird, wird durch ein Mikroskopobjektiv gesammelt, das senkrecht unterhalb des Dias platziert wird. (B) Das Panel zeigt ein repräsentatives Beispiel bei einer gegebenen Wellenlänge der relativen Intensität eines evaneszenten Feldes im Vergleich zur Tiefe, die exponentiell mit zunehmendem Abstand zur Oberfläche abnimmt und eine hohe axiale Fluoreszenz bietet. Bilder. Die seitliche Auflösung wird durch die numerische Blende und Vergrößerung des Objektivs und durch die Pixelgröße der Erkennungskamera festgelegt. Das Zellinnere ist nicht beleuchtet und trägt nicht zum Signal mit intrazellulärer Autofluoreszenz bei. Mehrwinkel-TIRF-Mikroskope ermöglichen die Auswahl verschiedener Eindringtiefen. Sie bieten eine Skala, die von der Anregungswellenlänge abhängt und in der Regel von 70 nm bis 250 nm Tiefe für einfarbiges TIRF-Bild geht. Die für dieses Protokoll gewählte evaneszenzierte Beleuchtungstiefe beträgt 110 nm, und sie ist das Ergebnis eines Kompromisses zwischen der Notwendigkeit, eine niedrige Laserleistung zu verwenden, und der Intensität des Fluoreszenzsignals, das mit der Abnahme der Eindringtiefe stark abnimmt. Es ist wichtig, übermäßig große evaneszierende Felder zu vermeiden, die viele intrazelluläre Vesikel und intrazelluläre Population von Fluorophoren beleuchten können. Daher sollten je nach Art der Probe mehrere Eindringtiefen untersucht werden, die nach der besten Kombination suchen: hohes Signal-Rausch-Verhältnis, geringe Anregungsleistung, kurze Belichtungszeit, kurze Eindringtiefe. Sobald diese Optimierung abgeschlossen ist, wird die Eindringtiefe für alle Steuerelemente und Proben konstant gehalten. (C) Repräsentative Epifluoreszenz- und TIRF-Bilder einer HeLa-GPI-mEGFP-Zelle nach softwaregeführter Optimierung der Tiefe und Richtung des evaneszenzenten Feldes. Multiwinkel-TIRF-Mikroskope ermöglichen auch die Optimierung der Richtung des evaneszenten Feldes. Dieser Schritt wird zur Minimierung der Streuung (d. h. eine starke Erhöhung der Intensität und weniger gestochen scharfes Bild) empfohlen und kann gemäß den Anweisungen des verwendeten Mikroskops durchgeführt werden. In diesem Protokoll beinhaltet die Mikroskop-Software eine automatische Optimierung der Richtung des Evaneszenzfeldes. Die manuelle Optimierung finden Sie in den veröffentlichten Protokollen36,37. (D) Repräsentative Zelle, die das mEGFP-FGFR1-Konstrukt in Epifluoreszenz und nach Optimierung der TIRF-Beleuchtung ausdrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Erfassung der Zeitreihe und Kalibrierung der Kamerareaktion auf einzelne Photonen. (A) Beispiel für den ersten Frame aus 700-Frame-Zeitreihen, die auf einer HeLa-mEGFP-FGFR1-Zelle im Schnittsensormodus erfasst wurden. Der Kamerachip wird teilweise maskiert (rote Rechtecke) mit dem Dual-View-Anschluss, der am TIRF-Mikroskop installiert ist (Abbildung 1B). Die internen Kalibrierbereiche werden im durchschnittlichen Intensitätsbild (B) erkannt und verarbeitet (C) zur Schätzung der Kameraparameter durch Plotten der Log-Frequenz im Vergleich zu Digitalen Pegeln (D). Ein analoges Erkennungssystem, z. B. eine EMCCD-Kamera, erkennt Pulse von Photostrom statt Photonenanzahl, und die Photonenpulshöhenverteilung ist quasi exponentiell. Der erste Teil der Verteilung ist durch den Verstärker und analog-digital-Wandler zurückzuführen und es steuert ein Gauß-Auslesegeräusch (die durch die Signalaufzeichnung eingeführte Varianz) bei. Der am häufigsten besiedelte Kanal (d. h. der häufigste Wert) der Verteilung ist der Offset (13). Mit einem vertikalen Cursor in einem Protokolldiagramm wird der erste Teil der Verteilung vom exponentiellen zweiten Teil über 250 DL getrennt, der die durchschnittliche Kameraantwort auf ein einzelnes Photon darstellt (die Neigung ist der S-Faktor in 12). Die Messung dieser Parameter ermöglicht die Schätzung der Dichte von Photonen, die während der Erfassung aufgezeichnet werden. Die Anzahl (DL) ist in Pseudo-Farbskala. Pixelgröße = 124 nm; Bildformat = 256x256 Pixel, Eindringtiefe des evaneszenten Feldes bei 110 nm; Kalibrierung SROI #1 = 19x256 Pixel; Kalibrierung SROI #2 = 5x256 Pixel. DL = digitale Ebenen. Exposition = 1 ms und EMGain (der G-Faktor in 12, 13 und 14) = 1000. Beachten Sie, dass Kameras, die im Photonenzählmodus mit Hintergrund arbeiten, analogen Detektoren mit S = 1 (äq. 12) und mit2d und Offset (äq. 13) entsprechen, die auf die gleiche Weise gemessen werden wie bei einem analogen System18. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: N&B-Analyse der FGFR1-Oligomerisierung. (A) Vertreter ergibt sich aus zwei HeLa-Zellen in derselben Schale, die mEGFP-FGFR1 exdrücken und zum Zeitpunkt 0 min (oben) und 7 min (unten) nach Zugabe von 20 ng/mL FGF2 und (B) zwei HeLa-Zellen, die die Referenzkonstrukte GPI-mEGFP (oben) exdrücken, erfasst. und GPI-mEGFP-mEGFP (unten). Die gesamte Analysesequenz zeigt (von links nach rechts): Durchschnittliche Intensität der Zeitreihe; Darstellung aller B-Werte in Abhängigkeit von der Fluoreszenzintensität, bei der der Farbcode die Anzahl der Pixel mit demselben B-Wert im Bild darstellt und die rechteckigen Cursor den Interessenbereich (ROI), den Hintergrund (BG) und Regionen mit sehr niedrigen Intensität (LI). Beachten Sie, dass immobile Fluorophore B-Wert = 1 ergeben, da in Ermangelung von Schwankungen - = 0; B-Karte des gewählten ROI und des zugehörigen B-Verteilungshistogramms. Die B-Wertverteilung ist mit einer Gaußschen Funktion (gestrichelte rote Linie) ausgestattet, um die durchschnittliche scheinbare Helligkeit, B (vollständige rote Linie) und die Verteilungsstatistiken (Zusatztabelle 1) B-Wert = B' = B/S (1q. 15) zu berechnen; Intensität = ( - Offset)/S; M = Monomer; D = Dimer; Skalenstäbe = 10 Mikrometer. Rohdaten Zeitreihen in Supplemental Movie 1, Supplemental Movie 2, Supplemental Movie 3, und Supplemental Movie 4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Kinetik der FGFR1-Oligomerisierung, die durch Ligandenaktivierung induziert wird. Repräsentative kinetische Läufe, die durch die normalisierte Durchschnittshelligkeit (16) der HeLa-mEGFP-FGFR1-Zellen nach Stimulation mit 20 ng/mL FGF2 (A) oder 50 g/mL NCAM-Fc (B) beschrieben werden. Zellen in der gleichen Schale wurden zu zunehmenden Zeitpunkten erfasst und die scheinbare durchschnittliche Helligkeit, B S.E., wurde aus den B-Verteilungshistogrammen berechnet. Die Figur wird mit Genehmigung von Zamai et al. Journal of Cell Science (2019)31angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Schnelle Kinetik und Dateninterpretation. Streudiagramm aller normalisierten Durchschnittshelligkeitswerte, die aus replizierenden kinetischen Durchläufen gewonnen wurden, in denen HeLa-mEGFP-FGFR1-Zellen entweder mit NCAM-Fc (50 g/ml) oder FGF2 (20 ng/mL) stimuliert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplemental Figure 1
Ergänzende Abbildung 1: Bildschirmmomentaufnahme der Analyseroutine in MatLab. Screenshot der GUI-ROUTINE (GUI) der grafischen N&B-Benutzeroberfläche, die die ersten Analyseschritte anzeigt: Zeitreihen hochladen; Berechnung des durchschnittlichen Intensitätsbildes, des Computeintensitätsprofils, der Berechnung der B-Karte und des B-I-Histogramms. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Parameter GPI-mEGFP GPI-mEGFP-mEGFP mEGFP-FGFR1 (Zeit = 0') mEGFP-FGFR1 (Zeit = 10')
Gaußischer Mittelwert B-Wert 1.070 1.141 1.070 1.141
S.E. über den mittleren B-Wert 0.001 0.001 0.001 0.001
S.D. der B-vaue-Verteilung 0.059 0.067 0.077 0.075
95% Konfidenzintervall des mittleren B-Wertes 1.069 bis 1.071 1,139 bis 1,143 1.069 bis 1.072 1,139 bis 1,143
S.D. des 95%-Konfidenzintervalls des B-Wertes 0,058 bis 0,060 0,065 bis 0,069 0,075 bis 0,079 0,073 bis 0,078
Fitting-Beschränkung S.D. > 0 S.D. > 0 S.D. > 0 S.D. > 0
S.E. Standardfehler; S.D. Standardabweichung

Ergänzende Tabelle 1: Scheinbare Helligkeitsanalyse. In Abbildung 5 wurden statistische und gauschsche Anpassungsparameter der B-Verteilungen durchgeführt. Die am wenigsten quadratischen Gaußschen Passungen wurden unter der Einschränkung der Standardabweichung > 0 mit dem automatisch gewählten X-Bereich und maximalen Iterationen = 1000 erhalten. R-Quadrat: mEGFP-FGFR1 Monomer = 0,9957, mEGFP-FGFR1 Dimer 0,9940; GPI-mEGFP = 0,9985; GPI-mEGFP-mEGFP = 0,9970.

Supplemental Movie 1
Ergänzender Film 1: Zeitreihen einer HeLa-mEGFP-FGFR1-Zelle zur Zeit = 0 Minuten nach FGF2-Stimulation (20 ng/ml in PBS, ergänzt mit 0,01% BSA) in Abbildung 5dargestellt. Die Serie von 800 Frames wird unkomprimiert bei 7 fps reproduziert. Bildformat = 256 x 256 Pixel; Pixelgröße = 124 nm; Der interne Kalibrierbereich wird als dunkle slaterale Bänder identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen (Rechtsklick zum Download).

Supplemental Movie 2
Ergänzender Film 2: Zeitreihen, die in Abbildung 5 einer HeLa-mEGFP-FGFR1-Zelle zur Zeit = 7 Minuten nach FGF2-Stimulation dargestellt sind (20 ng/ml in PBS, ergänzt mit 0,01% BSA) Die Serie von 800 Rahmen wird unkomprimiert bei 7 fps reproduziert. Bildformat = 256 x 256 Pixel; Pixelgröße = 124 nm; Der interne Kalibrierbereich wird als dunkle slaterale Bänder identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen (Rechtsklick zum Download).

Supplemental Movie 3
Ergänzender Film 3: Zeitreihen, die in Abbildung 5 einer HeLa-GPI-mEGFP-Zelle nach Zugabe des Fahrzeugs dargestellt sind (PBS ergänzt durch 0,01% BSA). Die Serie von 1.000 Frames wird unkomprimiert bei 7 fps reproduziert. Bildformat = 256 x 256 Pixel; Pixelgröße = 124 nm; Der interne Kalibrierbereich wird als dunkle slaterale Bänder identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen (Rechtsklick zum Download).

Supplemental Movie 4
Ergänzender Film 4: Zeitreihen, die in Abbildung 5 einer HeLa-GPI-mEGFP-mEGFP-Zelle nach Zugabe des Fahrzeugs dargestellt sind (PBS ergänzt durch 0,01% BSA). Die Serie von 1.000 Frames wird unkomprimiert bei 7 fps reproduziert. Bildformat = 256 x 256 Pixel; Pixelgröße = 124 nm; Der interne Kalibrierbereich wird als dunkle slaterale Bänder identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen (Rechtsklick zum Download).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

N&B erfordert mehrere Vorsichtsmaßnahmen bei der Wahl des Zellmodells und der Kennzeichnungsstrategie. Sie kann nur auf lebende Zellen angewendet werden, die während der Bildaufnahmezeit stabil haften bleiben. Zusätzliche Schwankungen durch die gesamte Zelle starre Verschiebung kann mit entsprechenden Bildwiederherstellungsansätzen38behandelt werden. Wenn sich jedoch eine Zelle bewegt, verformt sich die Zellmembran ebenfalls, und die Strukturverformung führt zu einer erheblichen zusätzlichen Varianz, die eine ernsthafte Einschränkung der Analyse von Membranproteinen mit sich bringt. In dieser Arbeit wird das fluoreszierende Konstrukt in der HeLa-Zelllinie ausgedrückt, da der konstitutive FGFR1 vernachlässigbar ist. Das Vorhandensein des konstitutiven Proteins ist eine Bedingung zu vermeiden, sonst gemischte Populationen von fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Rezeptor-Oligomeren würden wahrscheinlich bilden. Folglich würde die N&B-Analyse, die nur auf der Helligkeit der fluoreszierend markierten Proteinpopulation basiert, eine unzuverlässige Schätzung des durchschnittlichen oligomeren Zustands zurückgeben. Dieser Aspekt ist besonders wichtig bei der Anwendung von N&B zur Erkennung von Rezeptor-Dimerisierungsereignissen, bei denen die Helligkeit nur um den Faktor 2 zunimmt, wie die FGFR1-Dimerisierung in Gegenwart des FGF2-Ligands. In einem solchen Fall kann das Vorhandensein von gemischten Dimeren die von N&B nachweisbaren Dimerisierungsereignisse vollständig verbergen. Die Kontamination fluoreszierender Oligomere mit nicht fluoreszierenden konstitutiven Formen ist eine der potenziellen Fallstricke eines jeden Ansatzes, der auf dem Nachweis von Fluoreszenz basiert, es sei denn, das markierte Protein ist weitgehend überexprimiert. Oligomerisierungsstudien unter Bedingungen der Proteinüberexpression geben jedoch Anlass zur Sorge über ihre funktionelle Bedeutung. Transient transfizierte Zellen haben wahrscheinlich einen variablen Fluoreszenzspiegel (d. h. proteinkonzentration) und sind nützlich, um die Unabhängigkeit der durchschnittlichen Helligkeit der Proteinkonzentration zu testen, da N&B auf eine Vielzahl von unter der Bedingung des linearen Ansprechens des Detektors (siehe Definition der Helligkeit, 1).

Eine weitere Einschränkung ist die stoichiometrische Kennzeichnung des Rezeptors mit einem stabilen Fluorophor in lebenden Zellen. Halo-Tags, fluoreszierende Proteine (FP) oder andere kovalente Fluoreszenz-Tags sind geeignete Etiketten, um eine genaue Anzahl gebundener Fluorophore pro Proteinmolekül in der Zelle zu erhalten. Um die Komplexität der N&B-Analyse zu reduzieren, verwenden wir entweder fluoreszierende Proteine oder Halo-Tags, die eine 1-zu-1-Fluorophor-zu-Protein-Kennzeichnung ergeben. Das FP der Wahl muss in der reifen Form monomer sein und eine vernachlässigbare Selbstassoziationstendenz haben, die andernfalls eine künstliche Oligomerisierung der FP-getaggten Rezeptoren auslösen könnte. In diesem Protokoll verwenden wir das (A207K)mEGFP, da diese Einzelpunktmutation die mEGFP-Selbstaggregationstendenz abschafft, wie zuvor gezeigt31,39,40. Unabhängig von der Etikettierungsstrategie sollte das fluoreszierend markierte Protein auf die Retention der biologischen Aktivität im gewählten Zellmodell überprüft werden, da die Funktionalität der markierten Moleküle für die Verknüpfung von Oligomerisierungsereignissen mit Rezeptor-Signalisierung. In unserem Modell haben wir die Autophosphorylierung des fluoreszierenden (A207K)mEGFP-FGFR1 nach der Stimulierung der transfizierten Zellen mit dem RezeptorLiganden FGF231nachgewiesen.

N&B basiert auf der Diffusion von Molekülen im Beleuchtungsvolumen. Bei der Digitalkamera-Erkennung muss die Belichtungszeit (d.h. die Pixelverweilzeit in analoger Erkennung, T-Verweil)so kurz sein, dass nur eine und nur eine Konfiguration von Partikeln im Brennvolumen erfasst wird. Dies bedeutet, dass die Wahrscheinlichkeit, dass ein Fluorophor während der Belichtungszeit in das beleuchtete Volumen ein- oder aussteigt, sehr gering ist. Die Belichtungszeit muss kürzer sein als die Fluorophor-Verweilzeit (D), d. h. die durchschnittliche Zeit, die ein Fluorophor im beleuchteten Volumen verbringt. Daher ist es vor Beginn eines N&B-Experiments notwendig, eine Vorstellung von der Verweilzeit (oder dem Diffusionskoeffizienten) des Zielproteins zu haben, das in einer ersten Annäherung von subzellulärer Lokalisierung und molekularer Masse abhängt. Die Bildrate ist die Umkehrung der Zeit, die die Kamera benötigt, um ein Bild zu erfassen und dann vollständig auszulesen, und es wird oft ungefähr aus der Gesamtzahl der Pixel und der Ausleserate in Kombination mit der Belichtungszeit berechnet. Auch wenn die Bildrate nicht schnell sein muss, kann sich die Zykluszeit (t-Zyklus), die die Summe der Bildrate und die Zeit für die Vorbereitung der Erfassung des nächsten Frames darstellt, auf die Analyse auswirken. Diese Einschränkungen können verallgemeinert werden wie: t-Zyklus >> -D >> tdwell. Wenn die Zykluszeit zu schnell ist, werden sich die Moleküle in dieser Zeit nicht merklich von einem Rahmen zum nächsten bewegt haben und als unbeweglich erscheinen (B = 1). Da jedoch Hunderte von Frames für die Analyse benötigt werden, wird das Radfahren so schnell wie möglich eingestellt (Erhöhung oder Verringerung des Bildformats in der Anzahl der Pixel), um Zellverschiebungen und Verzerrungen der Zellmembran zu vermeiden, die große zusätzliche Varianz verursachen würden. während der Serienerfassung. Im Beispiel dieses Protokolls beträgt die langsamste Zykluszeit 22 ms, so dass 500 Frames in 11 s erfasst werden können.

Molekulare Helligkeit ist keine absolute Menge; Es hängt von den molekularen Eigenschaften des Fluorophors (Querschnitt und Quantenausbeute), vom Versuchsaufbau (Detektor und Optik) sowie von den Anregungsbedingungen wie der Laserleistung ab. So ergibt der TIRF-N&B-Ansatz eine scheinbare Helligkeit und ist daher von grundlegender Bedeutung, ein "Referenzzellmodell" einzurichten, das ein Referenzkonstrukt mit univocal-oligomerischem Zustand ausdrückt. Das Referenzkonstrukt trägt das gleiche Fluorophor-Tag des untersuchten Proteins [hier das (A207K)mEGFP] und lokalisiert es im selben subzellulären Fach (hier die Plasmamembran). In dieser Arbeit verwenden wir ein Glykosylphosphatidylinositol (GPI) verankert-(A207K)mEGFP Konstrukt, dass wir wiederholt gezeigt haben, dass ein zuverlässiger monomerer Helligkeitsstandard für Zelloberflächenrezeptoren mit dem gleichen Fluorophor30gekennzeichnetsind, 31.

Ein großer Nachteil ist das Auftreten von Fluorophor-Photobleichungen, die sehr wahrscheinlich auftreten, wenn dieselbe Zelle während eines kinetischen Laufs wiederholt dem Licht ausgesetzt wird, und zu einer Unterschätzung des Oligomerisierungszustands führt. Um dies zu verhindern, wird die Helligkeitskinetik durch Die Kombination der durchschnittlichen Helligkeit verschiedener Zellen, die jeweils zu einem anderen Zeitpunkt erfasst werden (Abbildung 6), erreicht. Dies bedeutet, dass in einer Petrischale jede Zelle ein anderer Zeitpunkt der Kinetik ist und eine Petrischale einen ganzen kinetischen Lauf darstellt.

Wenn die Oligomerisierungsdynamik schnell und komplex ist, wie die FGFR1-Oligomerisierung, die durch einen nicht-kanonischen Liganden, NCAM31induziert wird, kann das Profil der normalisierten durchschnittlichen Helligkeit im Vergleich zur Zeit variabel und instabil sein(Abbildung 6B ). In einem solchen Fall kann die Reproduzierbarkeit nicht durch das Lesen von Replizierungsgerichten von Zellen zu genauen Zeitpunkten bestimmt werden, da jedes Mal eine neue Zelle bewegt und fokussiert werden muss, wählen Sie einen ROI aus, erfassen und untersuchen/entsorgen. So kann die Reproduzierbarkeit in Bezug auf die kinetische Profilähnlichkeit und Amplitude der Helligkeitsänderungen bewertet werden.

Eine Übersicht über die Ergebnisse ist in Abbildung 7dargestellt. Das Streudiagramm zeigt nur die durchschnittliche Helligkeit, die in Zellen derselben Schale gemessen wird, und vernachlässigt die Zeit jeder Erfassung. In diesem Diagramm bleibt der Hauptunterschied, der durch die beiden Liganden auf den Oligomerisierungszustand des Rezeptors induziert wird, offensichtlich, obwohl alle kinetischen Informationen entfernt werden. Bei beiden Experimenten (FGF2- versus NCAM-induzierte Oligomerisierung) würde der konventionelle Ansatz zur Bestimmung des Mittelwerts s.D. jedes Durchlaufs in Abbildung 7 jedoch zu irreführenden Schlussfolgerungen führen, da die durch FGF2 stimulierten FGFR1-Moleküle eindeutig Transit in zwei gut definierte Zustände, während NCAM instabile und zyklische oligomere FGFR1-Gemische induziert, die nicht gut durch einen mittleren S.D.-Wert dargestellt würden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass N&B aus experimenteller Sicht nur Zugang zu einem Mikroskop benötigt, das mit einem schnellen Erfassungsmodul und einer dedizierten Software ausgestattet ist. Das protein of interest kann mit einer Vielzahl von monomeren fluoreszierenden Proteinen oder organischen Fluorophoren markiert werden, aber quantitative Messungen erfordern mehrere Bedingungen zu erfüllen: stoichiometrische Kennzeichnung, Referenzhelligkeitstandard, Detektor Kalibrierung und keine Photobleichung. In diesem Zusammenhang ist der N&B-Ansatz ein leistungsfähiges Werkzeug, um die raumzeitliche Oligomerisierung von Proteinen in lebenden Zellen zu entschlüsseln. Darüber hinaus werden die jüngsten Fortschritte bei der Neustichprobe von Rohdaten zur Lösung der statistischen Gewichtung41 und die Kombination von Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie mit KreuzkorrelationN-N&B42 verfeinert und die Anwendbarkeit des N verbessert. &B-Ansatz für Protein-Oligomerisierung und Interaktionsstudien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die CNIC wird vom Ministerium für Ciencia, Innovacion y Universidades und der Pro CNIC Foundation unterstützt und ist ein Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Wir werden auch vom Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (FEDER) "Una manera de hacer Europa" unterstützt. Die UC würdigt die Unterstützung der Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, der Association for International Cancer Research (heute als Worldwide Cancer Research bekannt) und des italienischen Gesundheitsministeriums. A.T. würdigt die "Fondazione Banca del Monte di Lombardia" für die teilweise Unterstützung seiner Arbeit mit dem PV-Stipendium "Progetto Professionalit" Ivano Becchi" 2011-2012.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 21063029 Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10566-016 Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Biowest, Nuaillé, France X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2 TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10270106 10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishes MatTek, Ashland, MA, USA P35G-0.170-14-C uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA LONZA 17-602E supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2 PeproTech EC, Ltd., London, UK Ligand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO ThermoFisher Scientific 11360070 1 mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent MirusBio LLC, Madison, WI, USA MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 25200056
Type F Immersion liquid 10 mL Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific AM2618 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
  2. Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
  3. Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. Muscarinic receptor oligomerization. Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).
  4. Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
  5. Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
  6. Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
  7. Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
  8. Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
  9. Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
  10. Trussell, H. J., et al. Academic Press Library in Signal Processing. Trussell, J., et al. 4, Elsevier. 3-9 (2014).
  11. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  12. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  13. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
  14. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  15. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  16. Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
  17. Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
  18. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  19. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  20. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  21. Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
  22. Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
  23. Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047 (2016).
  24. Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
  25. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  26. Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
  27. Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
  28. Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
  29. Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
  30. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  31. Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
  32. Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
  33. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).
  34. Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
  35. Joubert, J., Sharma, D. Light microscopy digital imaging. Current Protocols in Cytometry. , (2011).
  36. Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
  37. Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).
  38. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  39. Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
  40. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
  41. Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
  42. Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).

Tags

Biologie Ausgabe 153 Rezeptorcluster N&B Anzahl und Helligkeit Momentanalyse Proteinoligomere Zellmembran TIRF-Mikroskopie
Oligomerisierungsdynamik von Zelloberflächenrezeptoren in lebenden Zellen durch totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie kombiniert mit Zahlen- und Helligkeitsanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zamai, M., Trullo, A., Arza, E.,… More

Zamai, M., Trullo, A., Arza, E., Cavallaro, U., Caiolfa, V. R. Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60398, doi:10.3791/60398 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter