Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dinámica de oligomerización de receptores de superficie celular en células vivas mediante la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total combinada con análisis de número y brillo

Published: November 6, 2019 doi: 10.3791/60398
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1,2
1Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain, 2Centro di Imaging Sperimentale, Ospedale San Raffaele, Milan, Italy, 3Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy

Summary

Describimos un enfoque de imagen para la determinación del estado oligomérico promedio de los oligómeros receptores etiquetados con mEGFP inducidos por la unión de ligandos en la membrana plasmática de las células vivas. El protocolo se basa en la microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total (TIRF) combinada con el análisis Número y Brillo (N&B).

Abstract

A pesar de la importancia y la ubicuidad de la oligomerización de receptores, pocos métodos son aplicables para detectar eventos de agrupación en clústeres y medir el grado de agrupación en clústeres. Aquí, describimos un enfoque de imagen para determinar el estado oligomérico promedio de los homocomplejos de receptores etiquetados con mEGFP en la membrana de las células vivas. El protocolo se basa en la microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total (TIRF) combinada con el análisis Número y Brillo (N&B). N&B es un método similar a la espectroscopia de fluorescencia-correlación (FCS) y el histograma de recuento de fotones (PCH), que se basan en el análisis estadístico de las fluctuaciones de la intensidad de fluorescencia de los fluoróforos que se difunden dentro y fuera de una iluminación volumen durante un tiempo de observación. En particular, N&B es una simplificación de PCH para obtener información sobre el número medio de proteínas en mezclas oligoméricas. Las amplitudes de fluctuación de intensidad se describen por el brillo molecular del fluoróforo y el número medio de fluoróforos dentro del volumen de iluminación. Por lo tanto, N&B considera sólo el primer y segundo momento de la distribución de amplitud, a saber, la intensidad media y la varianza. Esta es, al mismo tiempo, la fuerza y la debilidad del método. Debido a que sólo se consideran dos momentos, N&B no puede determinar la fracción molar de los oligómeros desconocidos en una mezcla, pero sólo estima el estado medio de oligomerización de la mezcla. Sin embargo, se puede aplicar a series temporales relativamente pequeñas (en comparación con otros métodos de momento) de imágenes de células en vivo píxel por píxel, simplemente monitoreando las fluctuaciones de tiempo de la intensidad de la fluorescencia. Reduce el tiempo efectivo por píxel a unos pocos microsegundos, lo que permite la adquisición en el intervalo de tiempo de segundos a milisegundos, lo que es necesario para la cinética de oligomerización rápida. Por último, se pueden explorar grandes áreas celulares, así como compartimentos subcelulares.

Introduction

Describimos un enfoque de imagen de Fluorescencia-Número de Fluorescencia Y Brillo de Reflexión Interna Total (TIRF-N&B) para determinar el estado oligomérico promedio de las moléculas receptoras en la membrana plasmática de las células vivas, con el objetivo de vincular el conjunto del receptor dinámica a la función biológica de las proteínas (Figura 1).

Tras la unión de ligandoextra extracelular, los receptores inician la transducción de la señal intracelular dependiendo de su conformación, oligomerización, posibles coreceptores y composición de la membrana. A pesar de la importancia y ubicuidad de la oligomerización de receptores, reconocido como un evento clave en la señalización celular1,2,3,4,5,6, 7, pocos métodos pueden detectar eventos de agrupación en clústeres y medir el grado de agrupación en clústeres experimentalmente8,9. El volumen confocal (x,y a 300 nm, z a 900 nm) no está suficientemente resuelto para probar la interacción molecular y la estequiometría, incluso después de la optimización por algoritmos de restauración de imágenes10. La composición de la subunidad de los oligómeros proteicos no puede resolverse sobre una base puramente espacial incluso mediante métodos de superresolución a resolución x,y de 20-70 nm como PALM11,STORM12y STED13. Además, su resolución temporal (en el orden de minutos por imagen) no puede seguir la cinética en el rango de segundos. El blanqueamiento escalonado de una sola molécula resuelve la estequiometría de los oligómeros proteicos sólo si están inmóviles14.

Uno de los métodos más versátiles para medir la densidad y el oligomerización de proteínas etiquetadas fluorescentes dentro de imágenes individuales es el análisis de distribución de intensidad espacial (SpIDA), que se basa en el muestreo espacial. Es aplicable tanto a células químicamente fijas como vivas, y permite el análisis de varias regiones de interés de la célula simultáneamente utilizando la microscopía de fluorescencia estándar15. Alternativamente, los métodos de momento, tales como espectroscopia de fluorescencia-correlación (FCS)16, histograma de recuento de fotones (PCH)17,y Número y brillo (N&B)18,19, son adecuados para el oligomer cuantitativo Medidas. Estos métodos analizan las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia que se pueden observar en el tiempo cuando los fluoróforos se difunden dentro y fuera de un volumen de iluminación. Las amplitudes de las fluctuaciones de intensidad pueden describirse de forma única por el brillo molecular del fluoróforo y el número medio de fluoróforos (n) dentro del volumen de iluminación17 (Figura 2). Típicamente, el coeficiente de difusión de los fluoróforos y el número medio de moléculas (inversamente relacionadas con el valor G(0)) dentro del volumen de iluminación se pueden obtener por FCS20. Sin embargo, dado que el tiempo de difusión sólo se escala con la raíz cúbica de la masa, el FCS no es lo suficientemente sensible para detectar cambios en la masa molecular21. En la práctica, fcS de un solo color no puede detectar la dimerización de los receptores de membrana. PCH resuelve mezclas de diferentes oligómeros con precisión. Utilizando más de dos momentos de la distribución de amplitud, detecta moléculas de diferente brillo que ocupan el mismo volumen de iluminación. Escaneando FCS22 y desarrollos, como la interesante correlación par del enfoque23del brillo molecular (pCOMB), introducido para ampliar el rango de aplicabilidad de los métodos de correlación de fluorescencia en los sistemas biológicos24 , siguen siendo métodos de un solo punto que carecen de la capacidad de mediciones rápidas en un área grande de una celda, lo que requiere muchas observaciones consecutivas en cada píxel y la adquisición de datos en el orden de segundos.

N&B es una versión simplificada de PCH que considera sólo el primer y segundo momento de la amplitud de la distribución de la fluorescencia, a saber, la intensidad media, , y la varianza, n.o2 (Figura 2)18,19 y, debido a eso, no puede determinar la fracción molar de los oligómeros desconocidos en una mezcla, pero sólo estima el estado medio de oligomerización de la mezcla. Sin embargo, N&B tiene la ventaja de trabajar con series temporales relativamente más pequeñas de imágenes de células en vivo que PCH en una base de píxel a píxel, simplemente monitoreando las fluctuaciones en el tiempo de la intensidad de la fluorescencia. Debido a que N&B reduce el tiempo por píxel a unos pocos microsegundos, puede seguir la cinética de oligomerización rápida en áreas de celdas grandes, lo que permite la adquisición de imágenes en una escala de tiempo de segundos en microscopía de escaneo ráster (por ejemplo, confocal, 2 fotones) y milisegundos de milisegundos microscopía basada en cámara (por ejemplo, TIRFM).

Varios informes han demostrado la capacidad de N&B para cuantificar el número de subunidades en los grupos de proteínas mediante imágenes de regiones celulares extendidas. Se detectaron grupos de Paxillin-EGFP en los sitios de adhesión en las células CHO-K125,y la agregación intracelular del péptido patógeno Httex1p se describió en las células COS-726. N&B se aplicó para seguir la oligomerización impulsada por ligando sorda del receptor ErbB27, y el efecto del ligando FGF21 en Klothob (KLB) y FGFR1c en las células De LaLa28. La combinación de imágenes TIRF y análisis N&B se utilizó para mostrar que el dinamina-2 es principalmente tetramírico en toda la membrana celular29. Aplicamos N&B tanto a las imágenes de escaneo ráster como a las imágenes TIRF para probar la dimerización impulsada por ligando sin efecto de los receptores de membrana celular uPAR y FGFR130,31.

Los métodos de correlación de fluorescencia, como N&B, FCS y PCH, se basan en la noción de que en un volumen abierto el número de ocupación de partículas sigue una distribución de Poisson. Debido a que sólo se pueden detectar los fotones que emiten los fluoróforos, el valor medio de una intensidad de fluorescencia medida frente al tiempo en un píxel de la imagen, , es el producto del número medio de fluoróforos en el volumen de iluminación, n, y su brillo molecular,17:

donde se expresa como el número de fotones emitidos por unidad de tiempo (convencionalmente por segundo) por molécula cuando la molécula está en el centro del volumen de iluminación.

El brillo es una propiedad de cada fluoróforo en una adquisición determinada establecida, mientras que la intensidad es la suma de todas las contribuciones de todos los fluoróforos. En los concursos biológicos, el brillo aumentará con el aumento del número de fluoróforos que fluctúan juntos, dando información sobre el estado de oligomerización de la proteína etiquetada fluorescentemente. Las amplitudes de fluctuación en un píxel dado se miden a partir de la varianza de la señal de fluorescencia,n.o 2:

Donde la media del cuadrado de intensidad, , y el cuadrado de la media de intensidad, , se calculan a partir de los valores de intensidad individuales en cada píxel de cada fotograma:

donde K es el número total de fotogramas de la serie temporal. Experimentalmente, es necesario calcular para toda la serie de imágenes la varianza que describe la dispersión de los valores de intensidad individuales en cada píxel de una sola imagen alrededor del valor de intensidad media. La varianza incluye todas las fluctuaciones de diferentes orígenes. En una primera aproximación, la varianza debida a las partículas difusoras en el volumen de iluminación,20, se puede separar de la varianza debido al ruido de disparo del detector,2d. Las dos varianzas son independientes; por lo tanto, la desviación total se da por su suma:

La varianza, debido a las fluctuaciones moleculares dentro y fuera del volumen de detección, depende linealmente del brillo molecular y la intensidad:

Reorganización eq. 6 según eq. 1:

Según el concepto típico en espectroscopía de correlación de fluorescencia, la ecuación 7 establece que la varianza debida al número de fluctuaciones depende del cuadrado del brillo de las partículas.

Entonces, la varianza debida a las fluctuaciones del detector es una función lineal de la intensidad detectada, bajo el supuesto de que el detector se opera por debajo de su límite de saturación19:

En el caso de los detectores de recuento de fotones a unnúmero 1 y ca 0, por lo tanto, la varianza del detector es igual a la intensidad media:

Para aplicar estos conceptos a mediciones reales en celdas vivas, Gratton y sus colegas18 definen el brillo aparente, B, para cada píxel como la proporción de la varianza sobre la intensidad media:

B es el parámetro que se mide experimentalmente. En este trabajo, las imágenes de series temporales de receptores FGFR1 en la membrana plasmática de las células HeLa son capturadas por la microscopía TIRF y el brillo aparente promedio, B, está determinado por el análisis N&B. Luego, después de la adición de FGF2, series temporales consecutivas se capturan para seguir los cambios en el autoensamblaje de las moléculas receptoras en la superficie de la membrana después de la estimulación del receptor con el ligando canónico.

Sin embargo, dado que el detector del microscopio TIRF es una cámara EMCCD, la expresión para el brillo aparente debe modificarse como19:

donde el desplazamiento es el desplazamiento de intensidad de la electrónica de detección que es una característica de la configuración del detector. La varianza y la intensidad media de un detector analógico se dan respectivamente por:

donde G es la ganancia analógica en niveles digitales (DL/fotones), S, los niveles digitales por foton19,se da por la pendiente de una intensidad frente a la varianza de la gráfica para una fuente de luz con intensidad constante (sin fluctuaciones temporales). El factor de la unidad está relacionado con la forma del volumen de detección de píxeles. Según Hassler et al.32, el factor de á es igual a 0,3 para las imágenes TIRF que funcionan con la ganancia máxima de la cámara de detección19. Los parámetros offset, S y G son características de la cámara y del microscopio. El brillo aparente, B, se obtiene reorganizando eq. 11 según eq. 12 y 13:

Experimentalmente, es una función compleja de la intensidad del láser y la eficiencia de detección del sistema. Sin embargo, puesto que B/S depende linealmente de la variable, sólo es importante determinar el valor relativo de la opción para un modo de detección determinado:

donde es proporcional a . Aún así, una calibración se realiza utilizando una referencia interna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparación de muestras

  1. Día 1. Células HeLa de semillaen en medio completo a una concentración de 100,000-200,000 células / ml en platos con fondo de vidrio. Semilla 6-8 replicar platos.
    NOTA: En este ejemplo, el medio se complementa con 10% de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor, piruvato sódico de 1 mM, 100 U/100 g de penicilina/estreptomicina. Se preparan varios platos replicados.
  2. Día 2-3. Cuando las células están en subconfluencia, transfectar la mitad de los platos con el plásmido proteico y la segunda mitad con plásmidos de referencia (monómero y dimer), en medio libre de suero.
    NOTA: La transfección se realiza en medio libre de suero complementado con antibióticos, 0,1% de albúmina sérica bovina y tampón HEPES de 25 mM, sin color rojo fenol.
  3. Día 3-4. Compruebe que las células transtrósperas son adherentes a la parte inferior de los platos y que la membrana celular es fluorescente. Deseche los platos con células cubiertas o con muy baja fluorescencia.
    NOTA: No deje que las células crezcan en exceso. Las células deben estar bien distribuidas y adherirse al área de vidrio del plato(Figura 1A). Los platos de fondo de vidrio precoatados se pueden utilizar para favorecer la adhesión celular. El cultivo celular se prueba para detectar la contaminación por micoplasma antes de cualquier experimento. En este ejemplo, las células están infectadas con un plásmido (A207K)mEGFP-FGFR1 y las células de referencia están infectadas con un GPI-(A207K)mEGFP y un GPI-(A207K)mEGFP-(A207K)mEGFP plásmidos utilizando protocolos estándar. Para la microscopía de células vivas, se recomienda un medio libre de indicadores; Se añade un tampón HEPES de 25 mM para evitar cambios de pH durante la toma de imágenes.

2. TIRF Imaging — Alineación de la línea láser y optimización de la iluminación TIRF

  1. Cuatro horas antes del experimento, active la incubadora de temperatura del microscopio a 37oC.
  2. Encienda el microscopio, las computadoras y las cámaras y espere a que las cámaras alcancen la temperatura de trabajo adecuada.
    NOTA: La temperatura de trabajo de la cámara utilizada en este estudio es de -75 oC.
  3. Coloque una gota de aceite en el objetivo. Ponga un plato de muestra en su lugar. Cierre las puertas de la incubadora y deje que la temperatura del plato se equilibre (10 min).
  4. Encienda la lámpara de epifluorescencia y el láser de 488 nm.
  5. Seleccione el modo de contraste de epifluorescencia para explorar la muestra, buscando una célula para enfocar desde el ocular.
    NOTA: El uso de una lámpara fluorescente para buscar células a través del ocular no es obligatorio. En su lugar, se puede utilizar una línea láser adecuada.
  6. Seleccione el filtro adecuado para recoger la emisión verde a través de la cámara del microscopio (Band Pass Ex 490/20 (500) Band Pass Em 525/50, o similar.
  7. Cambie del puerto ocular al puerto de la cámara (#1 de cámara en la Figura 1)en modo de epifluorescencia, refinar el enfoque y cambiar al modo TIRF. Los modos de epifluorescencia y TIRF pueden ser nombrados con una nomenclatura diferente dependiendo de la marca del microscopio.
    NOTA: Puede haber problemas para enfocar o alinear el láser si no hay marcadores fluorescentes en la interfaz de cubreobjetos. Para alinear el láser correctamente (esencial para un buen TIRF), concéntrese en la cubierta. A menudo es muy difícil determinar si el cubreobjetos está enfocado. Como sugerencia, concéntrese en los bordes de las celdas.
  8. Active la alineación automática siguiendo las instrucciones del microscopio TIRF.
    NOTA: Brevemente, para los pasos de 2.4 a 2.8, primero encuentre las células a través del ocular y concéntrese en ellas, luego envíe la emisión al puerto de la cámara del microscopio TIRF, vuelva a enfocar las células en la pantalla del ordenador del microscopio y active el procedimiento para la alineación láser. La alineación consiste en encontrar el ángulo crítico en el que la iluminación se convierte en evanescente(Figura 3). Los microscopios comerciales pueden tener protocolos de alineación ligeramente diferentes y también estar totalmente automatizados; otros podrían tener una pequeña cámara para facilitar la visualización de las condiciones de ángulo crítico.
  9. Elija una profundidad de iluminación adecuada y optimice la dirección del campo evanescente(Figura 3).
    NOTA: La profundidad de penetración se mantiene constante para todos los controles y muestras.

3. TIRF Imaging: Captura de la serie temporal

  1. Defina una región de interés (ROI) de al menos 256 x 256 píxeles.
    NOTA: En esta configuración, la captura se realiza con la cámara #2 bajo software que controla directamente sólo la cámara (vea la leyenda de la figura 1).
  2. Establezca la exposición a 1 ms y la ganancia EM en 1.000 (este es el factor G en eq. 12 y 13). A tal velocidad, podría ser necesario ajustar o aumentar la potencia del láser. Aquí la potencia del láser es de 0,5 mW.
    NOTA: Dependiendo del tipo de cámara y de los límites impuestos por el coeficiente de difusión de la proteína, la intensidad de la fluorescencia y el fondo, los criterios generales para ajustar la potencia del láser son no saturar el detector, minimizar el fotoblanqueo y capturar como lo más rápido posible en un S/N razonable. La ganancia EM siempre se establece en el máximo de la cámara (consulte Introducción).
  3. Ejecute una primera secuencia de prueba en condiciones iniciales y calcule aproximadamente el valor S/N. Las condiciones son aceptables en S/N a 2-3 o superior, medida en el primer fotograma de la primera serie temporal.
  4. Utilice el control deslizante del sistema de división de emisiones que conecta la cámara #2 al microscopio para enmascarar un lado de la imagen(Figura 1B, Figura 4A-B)
    NOTA: En esta configuración se instala un conector de imágenes multicanal en la cámara #2 para permitir la adquisición simultánea de dos imágenes espacialmente idénticas. El sistema está equipado con portaobjetos para el montaje de diferentes filtros de emisión. Uno de los controles deslizantes monta una máscara negra para cubrir un lado de la imagen. El área enmascarada se utiliza para la calibración interna de cada serie temporal, para determinar los parámetros de la cámara (eq. 12 y eq. 13). De esta manera no hay necesidad de un paso de calibración independiente y, lo que es más importante, la calibración se realiza en paralelo a la captura de cada serie temporal. En ausencia de este sistema, la cámara se puede calibrar aplicando los protocolos publicados33.
  5. Seleccione la opción de guardado automático del archivo de cámara.
  6. Inicie la adquisición de la serie de imágenes. Adquiera un mínimo de 700 cuadros con una relación S/N mínima de 2.
    NOTA: El número de fotogramas necesarios para el análisis depende de la estabilidad de la muestra para el fotoblanqueo y de la dispersión de los datos. Por lo tanto, la calidad de cada serie temporal se evalúa durante el análisis de N&B.
  7. Sin sacar el plato del microscopio, agregue el ligando.
  8. Seleccione una célula con una membrana de fluorescencia brillante e inicie rápidamente la primera serie temporal de la carrera cinética.
    NOTA: Si la adición del ligando se realiza rápidamente, esta primera captura establece el punto 0 tiempo de la cinética de ligando. El software registra la hora exacta de la captura.
  9. Busque una segunda célula y adquiera el segundo punto de tiempo de la cinética.
    NOTA: Las rutinas de visitas puntuales están disponibles en algunos microscopios equipados con etapas motorizadas x,y,z. Estos permiten la memorización de múltiples posiciones en la placa de la celda, y pueden ayudar a mantener un intervalo de tiempo más constante entre las series de imágenes en diferentes celdas.
  10. Captura una nueva celda para cada punto de tiempo de la ejecución cinética.
    NOTA: Después de capturar, una celda se fotoblanquea parcialmente y no se puede volver a crear una imagen. Debido a eso, la cinética se obtiene mediante la combinación de series temporales de muchas células, cada una capturada en un punto de tiempo diferente.
  11. Para cada plato nuevo, repita el protocolo del paso 2.3 al 3.9.
    NOTA: Para platos de referencia, añadir un volumen del vehículo (PBS complementado con 0.01% albúmina sérica bovina) equivalente al utilizado para el ligando.

4. Número y brillo (N&B): Comprobación de calidad de la serie temporal

  1. Convertir y guardar como . TIFF los archivos adquiridos con el software de la cámara (archivos .sif en este ejemplo).
  2. Importación. TIFF en la rutina de software de análisis mediante la activación de la interfaz gráfica de usuario N&B (GUI) MATLAB.
    NOTA: Aquí se utiliza una rutina de N&B ejecutable de Matlab personalizada (análisis De N&B en https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). Al abrir un archivo . TIFF, la rutina genera la imagen de intensidad media, el perfil de intensidad media y permite inspeccionar la serie fotograma a fotograma(Figura suplementaria 1). Otros programas están disponibles para el análisis de N&B (por ejemplo, el software SimFCS).
  3. Descartar series para las que el perfil de intensidad media muestra más del 10% de fotoblanqueo, y series en las que ha habido una distorsión o traducción evidente de la membrana celular durante la adquisición.
  4. Recortar marcos que evidentemente están desenfocados.
    NOTA: Una herramienta de recorte se implementa en la rutina para descartar uno o varios fotogramas dentro de la serie de imágenes. Esta operación se permite porque el tiempo de fotograma a fotograma no es crítico, mientras que el tiempo de permanencia del píxel (tiempo de exposición) es (consulte Discusión).
  5. Conservar para el análisis solo series con al menos 500 marcos de tiempo.

5. Número y brillo (N&B): Determinación de los parámetros de la cámara (Desplazamiento, s y S)

  1. Active la rutina Calibrar cámara.
  2. Seleccione un área de al menos 20 x 50 píxeles en la región de ruido del detector(Figura 4).
    NOTA: La rutina origina un histograma de los valores (también definido Digital Level, DL) y devuelve una gráfica de ritmo del Frequency versus Digital Levels.
  3. En el gráfico Log Frequency versus Digital level, mueva el cursor rojo lineal para delimitar la parte gaussiana y la parte lineal de la curva.
    NOTA: El cursor rojo divide las dos secciones de la curva y activa la rutina que devuelve el desplazamiento, que es el centro de la función gaussiana de la respuesta de la cámara, el ajuste de la unidad gaussiana y el factor S, que es la pendiente de la parte lineal de los responses de la cámara e (Figura 4C-D).

6. Número y brillo (N&B): Cálculo de los valores B en la región de interés seleccionada (ROI)

  1. Active la tecla B.
    NOTA: Esta acción genera la imagen de intensidad media(Figura 5, primera columna) y la imagen B en la que cada valor B individual está asociado al píxel relacionado en la imagen(Figura suplementaria 1).
  2. Aplique un binning mínimo (2 2) para reducir la dispersión de los datos y para generar el histograma B-I(Figura 5,segunda columna).
    NOTA: El histograma B-I representa la distribución de los valores B de todos los píxeles de la imagen frente a la intensidad del píxel. Y - B/S; X á ( - offset)/S(Figura suplementaria 1 y eq. 11 y 15).
  3. Inspeccione el histograma B-I utilizando el cursor cuadrado interactivo.
  4. Seleccione un ROI cuadrado para el análisis(Figura 5,tercera columna).
    NOTA: El cursor sincroniza una máscara móvil en la imagen de intensidad media, resaltando los píxeles seleccionados dentro del área del cursor cuadrado(Figura suplementaria 1). Mediante esta inspección, es posible excluir del análisis el fondo y las áreas con muy baja intensidad.
  5. Genere el mapa B del ROI seleccionado(Figura 5, cuarta columna).
  6. Guarde el archivo ASCII de los valores B asociados a la selección.
  7. Importe el archivo ASCII en un software gráfico para calcular la distribución de frecuencia de los datos y obtener el valor B medio : S.E(Figura 5,quinta columna).
    NOTA: Si los datos son homogéneos, la distribución de frecuencia de los valores B se aproxima a una distribución gaussiana.
  8. Aplique eq. 15 para derivar el brillo promedio - 1 [(cuentas/molécula) por tiempo de permanencia] para cada célula en cada punto de tiempo de la ejecución cinética. Normalizar los datos según:

    donde se mide el valor B promedio en el momento "t" después de la adición de ligando, y es el valor B promedio medido en el momento t-0 (10-20 s después de la adición de ligando).
    NOTA: La normalización de los resultados permite la comparación directa de experimentos que se llevan a cabo en diferentes días. Compensa las diferencias en el brillo medido debido a la potencia del láser y las fluctuaciones técnicas.
  9. Trazar el brillo medio normalizado frente al tiempo de adquisición para construir la ejecución cinética(Figura 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Los resultados de dos células representativas de HeLa-mEGFP-FGFR1 sembradas en el mismo plato de cultivo se muestran en la Figura 5 y en la Tabla Suplementaria 1. Las dos celdas fueron capturadas en el tiempo 0 min(Figura 5A, superior) y 7 min(Figura 5A,inferior) después de la adición del ligando FGF2.

La Figura 5 también muestra los resultados de dos células representativas de HeLa que expresan el monómero puro, GPI-mEGFP(Figura 5B, parte superior), o el fluoróforo diérico covalentemente vinculado, GPI-mEGFP-mEGFP(Figura 5B, ), expuestos en la membrana celular y capturados en las mismas condiciones experimentales.

El brillo aparente promedio, B, en las células HeLa-mEGFP-FGFR1 aumenta de 1.070 a 0.001 S.E. a 1.141 a 0.001 S.E., mientras que la referencia monomérica(Figura 5B, superior) y diminórica(Figura 5B, muestras inferiores) regresan B valores de 1.070 a 0.001 S.E. y 1.141 a 0.001 S.E respectivamente. Por lo tanto, en comparación, el receptor FGFR1 está presente principalmente en la forma monomérica en la superficie de la membrana celular al principio, pero progresa hacia un estado dimerico predominante tras la estimulación con su ligando canónico FGF2. En promedio entonces, el estado prevalente de las moléculas FGFR1 en las dos células representativas es claramente diferente.

Aplicando el análisis a varias células en el mismo plato, cada una capturada en un punto de tiempo diferente, se obtiene el brillo promedio en función del tiempo(Figura 6A). La ejecución cinética de la Figura 6A describe un lento proceso de dimerización que persiste durante varios minutos en la superficie celular. La dimerización FGFR1 inducida por FGF2 y la posterior internalización del receptor es un mecanismo bien conocido34; por lo tanto, los resultados están en pleno acuerdo con la noción actual sobre la transducción de la señal FGFR1, y confirman la potencialidad del enfoque TIRF-N&B para estudiar la oligomerización de las proteínas de la membrana celular hasta la determinación de sutiles dinámica monómero-dimer.

El análisis de brillo medio normalizado de los resultados es una herramienta adecuada para comparar el efecto de diferentes ligandos en el mismo receptor. Un ejemplo se da en la Figura 6B. El protocolo se repitió utilizando los mismos estándares y estimulando las células con un ligando FGFR1 no canónico, NCAM-Fc (50 g/mL). En este caso, el perfil cinético revela transiciones rápidas y cíclicas del receptor en mezclas oligoméricas, que también alcanza valores de brillo por encima de los del dimer. Se observa repetidamente un valor medio normalizado de 3. Sin embargo, la limitación del análisis N&B (sólo se consideran dos momentos de la fluctuación de intensidad frente al tiempo) no permite demostrar sin duda la formación de una forma trimérica. El mismo brillo promedio normalizado podría ser el resultado de varias combinaciones de oligómeros y monómeros más grandes del receptor. Sin embargo, los resultados demuestran claramente las diferencias espaciotemporales del efecto de los dos ligandos en el mismo receptor.

Figure 1
Figura 1: Visión general del protocolo experimental. (A) Las células se chapan en platos de fondo de vidrio y se transinfectan con el receptor fluorescentemente etiquetado. (B) Las imágenes de serie temporal se capturan en un microscopio TIRF comercial equipado con un objetivo de aceite TIRF 100x 1.46 y una cámara de incubadora. En esta configuración comercial, el software no permite que la cámara EMCCD integrada #1 funcione en tiempos de exposición muy cortos necesarios para adquirir series temporales N&B. Este es un punto importante ya que el tiempo de exposición limita el rango de difusión molecular que se puede capturar. Cuanto menor sea el tiempo de exposición, más rápida será la difusión molecular que se puede analizar. Las exposiciones que van de 0,5 a 1 ms son lo suficientemente rápidas para la difusión de proteínas de membrana. Por lo tanto, una segunda cámara EMCCD (#2) se agrega a un puerto adicional del microscopio para trabajar directamente bajo el software de la cámara, evitando el software del microscopio. En esta configuración adaptada, el software del microscopio y la #1 de la cámara se utilizan sólo para la alineación TIRF. Las series temporales TIRF se adquieren utilizando #2 de cámara que se ejecuta en tiempos de exposición muy cortos, como 1 ms y con la ganancia máxima de EM. La cámara #2 también tiene un tamaño de píxel de 124 nm que permite el sobremuestreo y el binning de las imágenes (ver sección 6.2 del protocolo). Otras configuraciones para ganar velocidad de imagen son posibles, dependiendo de las características de los diferentes microscopios TIRF, mientras que el uso de cámaras sCMOS no es aconsejable, porque el ruido no es aleatorio en la imagen35. (C) Después de la captura, las series temporales se inspeccionan como una comprobación de calidad. Las series se descartan si el fotoblanqueo es superior al 10%, ya que se puede determinar trazando la intensidad media del fotograma frente al número de fotograma. Las series también se descartan si ha habido una distorsión evidente de la membrana celular o la traducción de la célula durante la adquisición. (D) Se guarda la intensidad media de cada píxel. (E) Se genera un histograma B-I que representa el brillo aparente, B, en cada píxel de la imagen. (F) El histograma B-I se utiliza para seleccionar un ROI que esté por encima del fondo. (G) La distribución de frecuencia de los valores B se analiza para determinar el valor B medio - S.E. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figure 2
Figura 2: Principio de N&B. N&B cuantifica el estado medio de oligomerización de los fluoróforos midiendo las fluctuaciones de fluorescencia que se producen cuando se mueven dentro y fuera del volumen de iluminación durante la adquisición de una serie de pilas de tiempo de imágenes "K". La amplitud de las fluctuaciones se caracteriza estadísticamente por calcular larelación entre la varianza de la señal fluctuante, 2 , y el valor de intensidad media, . En el escenario más simple (A), cuando el volumen de iluminación está vacío (es decir, sin fluoróforos), la relación describe el ruido del instrumento. Si la señal de fluorescencia fluctúa debido a los fluoróforos móviles (B,C), la varianza "extra" es directamente proporcional al brillo molecular, (recuentos de fotones detectados por molécula y por segundo), de las moléculas difusoras. En (B), hay 8 fluoróforos difusores monoméricos y en (C), los mismos fluoróforos difusos que 2 oligómeros tetranvías. En estos dos casos, la intensidad media es la misma, pero la desviación estándar y el brillo son diferentes (1o, 4o), ya que las amplitudes de las fluctuaciones son diferentes. 0 cuando los fluoróforos están inmóviles o ausentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Microscopía TIRF. Aunque N&B funciona igual de bien con microscopios de escaneo ráster equipados con láseres de fotón simple de onda continua o pulsada y detectores de recuento analógicos o fotónicos, la microscopía TIRF es ideal para imágenes temporales rápidas de dinámica molecular eventos que ocurren en o cerca de la superficie celular con velocidades, resolución y relación señal/ruido (S/N) que no son posibles de lograr con otras técnicas de imagen. (A) La microscopía TIRF emplea el principio de reflexión interna total mediante el cual una luz láser de excitación en ángulo excita sólo los fluoróforos que están justo debajo de una interfaz de agua de vidrio del cubreobjetos. El láser irradia la muestra en un ángulo de incidencia mayor o igual que el ángulo crítico de refracción, mientras que la luz láser de excitación se refleja totalmente. La reflexión genera un campo electromagnético muy delgado en la muestra llamada onda evanescente. La luz fluorescente resultante emitida por la pequeña sección iluminada de la muestra se recoge a través de un objetivo del microscopio colocado perpendicularmente debajo de la diapositiva. (B) El panel muestra un ejemplo representativo en una longitud de onda dada de la intensidad relativa de un campo evanescente frente a la profundidad, que disminuye exponencialmente con el aumento de la distancia de la superficie, proporcionando fluorescencia de alta resolución axial Imágenes. La resolución lateral se establece por la apertura numérica y la ampliación del objetivo y por el tamaño de píxel de la cámara de detección. El interior de la célula no está iluminado y no contribuye a la señal con autofluorescencia intracelular. Los microscopios TIRF multiángulo permiten seleccionar varias profundidades de penetración. Proporcionan una escala que depende de la longitud de onda de excitación y generalmente va desde 70 nm hasta 250 nm de profundidad para la imagen TIRF de un solo color. La profundidad de iluminación evanescente elegida para este protocolo es de 110 nm, y es el resultado de un compromiso entre la necesidad de utilizar baja potencia láser y la intensidad de la señal de fluorescencia que disminuye bruscamente con la disminución de la profundidad de penetración. Es importante evitar campos evanescentes demasiado grandes que puedan iluminar muchas vesículas intracelulares y la población intracelular de fluoróforos. Por lo tanto, dependiendo del tipo de muestra, se deben explorar varias profundidades de penetración, buscando la mejor combinación: alta relación señal-ruido, baja potencia de excitación, corto tiempo de exposición, profundidad de penetración corta. Una vez realizada esta optimización, la profundidad de penetración se mantiene constante para todos los controles y muestras. (C) Epifluorescencia representativa e imágenes TIRF de una célula HeLa-GPI-mEGFP después de la optimización guiada por software de la profundidad y dirección del campo evanescente. Los microscopios TIRF multiángulo también permiten optimizar la dirección del campo evanescente. Este paso se recomienda para minimizar la dispersión (es decir, un fuerte aumento de la intensidad y una imagen menos nítida), y se puede llevar a cabo de acuerdo con las instrucciones del microscopio específico utilizado. En este protocolo el software del microscopio incluye una optimización automática de la dirección del campo evanescente. Para la optimización manual, consulte los protocolos publicados36,37. (D) Célula representativa que expresa la construcción mEGFP-FGFR1 en epifluorescencia y después de la optimización de la iluminación TIRF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Captura de la serie temporal y calibración de la respuesta de la cámara a fotones individuales. (A) Ejemplo de la primera trama de la serie temporal de 700 fotogramas capturada en una celda HeLa-mEGFP-FGFR1 en el modo de sensor recortado. El chip de la cámara está parcialmente enmascarado (rectángulos rojos) utilizando el conector de vista dual instalado en el microscopio TIRF(Figura 1B). Las regiones de calibración internas se reconocen en la imagen de intensidad media (B) y se procesan (C) para estimar los parámetros de la cámara trazando la frecuencia de registro frente a los niveles digitales (D). Un sistema de detección analógica, como una cámara EMCCD, detecta pulsos de fotocorriente en lugar de recuentos de fotones, y la distribución de la altura del pulso de fotón es casi exponencial. La primera parte de la distribución se debe al amplificador y al convertidor de analógico a digital y aporta un ruido de lectura gaussiano (la varianza introducida por la grabación de señal). El canal más poblado (es decir, el valor más frecuente) de la distribución es el desplazamiento (eq. 13). Utilizando un cursor vertical en una gráfica de registro, la primera parte de la distribución se separa de la segunda parte exponencial, por encima de 250 DL, que representa la respuesta media de la cámara a un solo fotón (la pendiente es el factor S en eq. 12). La medición de estos parámetros permite estimar la densidad de fotones que se registran durante la adquisición. Los recuentos (DL) están en pseudoescala de colores. Tamaño de píxel a 124 nm; Formato de imagen: 256x256 píxeles, profundidad de penetración del campo evanescente a 110 nm; Roi de #1 de calibración: 19x256 píxeles; ROI de calibración #2 de 5x256 píxeles. NIVELES digitales de DL. Exposición: 1 ms y EMGain (factor G en eq. 12, 13 y 14) a 1000. Tenga en cuenta que las cámaras que trabajan en modo de recuento de fotones con fondo son equivalentes a los detectores analógicos con S a 1 (eq. 12) y con el valorde 2d y el desplazamiento (eq. 13) medidos de la misma manera que para un sistema analógico18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Análisis N&B de la oligomerización FGFR1. (A) Representante resulta de dos células HeLa en el mismo plato que expresan mEGFP-FGFR1 y se capturan en el tiempo 0 min (arriba) y 7 min (abajo) después de la adición de 20 ng/mL FGF2, y (B) dos células HeLa que expresan las construcciones de referencia GPI-mEGFP (arriba) y GPI-mEGFP-mEGFP (abajo). Toda la secuencia de análisis muestra (de izquierda a derecha): Intensidad media de la serie temporal; Trazado de todos los valores B en función de la intensidad de la fluorescencia en la que el código de color representa el número de píxeles que tienen el mismo valor B en la imagen y los cursores rectangulares delimitan la región de interés (ROI), el fondo (BG) y las regiones de muy bajo valor (LI). Tenga en cuenta que los fluoróforos inmóviles darán el valor B 1 ya que en ausencia de fluctuaciones- 0; Mapa B del ROI elegido y del histograma de distribución B asociado. La distribución del valor B está equipada con una función gaussiana (línea roja discontinua) para calcular el brillo aparente medio, B (línea roja completa) y las estadísticas de distribución (Tabla suplementaria 1) Valor B - B' - B/S (eq. 15); Intensidad ( - desplazamiento)/S; M - monómero; D - dimer; barras de escala de 10 micras. Serie de tiempo de datos sin procesar en Película suplementaria 1, Película suplementaria 2, Película suplementaria 3y Película suplementaria 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Cinética de oligomerización FGFR1 inducida por activación de ligandos. Corridas cinéticas representativas descritas por el Brillo Promedio Normalizado (eq. 16) de las células HeLa-mEGFP-FGFR1 después de la estimulación con 20 ng/mL FGF2 (A) o 50 g/mL NCAM-Fc (B). Las células en el mismo plato fueron capturadas en los puntos de tiempo crecientes y el brillo promedio aparente, B - S.E., se calculó a partir de los histogramas de distribución B. La figura está adaptada con permiso de Zamai et al. Journal of Cell Science (2019)31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Rápida cinética e interpretación de datos. Gráfico de dispersión de todos los valores de Brillo Promedio Normalizado obtenidos a partir de corridas cinéticas replicadas en las que las células HeLa-mEGFP-FGFR1 se estimularon con NCAM-Fc (50 g/mL) o FGF2 (20 ng/mL). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplemental Figure 1
Figura suplementaria 1: Instantánea de pantalla de la rutina de análisis en MatLab. Instantánea de pantalla de la rutina MATLAB de la interfaz gráfica de usuario (GUI) de N&B que muestra los pasos de análisis iniciales: series temporales de carga; calcular la imagen de intensidad media, el perfil de intensidad de proceso, el mapa B de computación y el histograma B-I. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Parámetro GPI-mEGFP GPI-mEGFP-mEGFP mEGFP-FGFR1 (tiempo 0') mEGFP-FGFR1 (tiempo 10')
Valor B medio gaussiano 1.070 1.141 1.070 1.141
S.E. sobre el valor B medio 0.001 0.001 0.001 0.001
S.D. de la distribución B-vaue 0.059 0.067 0.077 0.075
95% Intervalo de confianza del valor B medio 1.069 a 1.071 1.139 a 1.143 1.069 a 1.072 1.139 a 1.143
S.D. del intervalo de confianza del 95% del valor B 0.058 a 0.060 0.065 a 0.069 0.075 a 0.079 0.073 a 0.078
Restricción de montaje S.D. > 0 S.D. > 0 S.D. > 0 S.D. > 0
Error estándar s.E.; Desviación estándar de S.D.

Tabla suplementaria 1: Análisis de brillo aparente. Se llevaron a cabo estadísticas y parámetros de ajuste gaussianos de las distribuciones B de la Figura 5. Los ajustes gaussianos menos cuadrados se obtuvieron bajo la restricción de la desviación estándar > 0 con el rango X elegido automáticamente y las iteraciones máximas 1000. R cuadrado: monómero mEGFP-FGFR1 a 0,9957, dímero mEGFP-FGFR1 0,9940; GPI-mEGFP a 0,9985; GPI-mEGFP-mEGFP a 0,9970.

Supplemental Movie 1
Película suplementaria 1: Serie temporal de una célula HeLa-mEGFP-FGFR1 en el momento 0 minutos después de la estimulación FGF2 (20 ng/ml en PBS complementado con 0,01% De BSA) que se muestra en la Figura 5. La serie de 800 fotogramas se reproduce sin comprimir a 7 fps. Formato de imagen: 256 x 256 píxeles; tamaño de píxel a 124 nm; El área de calibración interna se identifica como bandas laterales oscuras. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Supplemental Movie 2
Película suplementaria 2: Serie temporal que se muestra en la Figura 5 de una célula HeLa-mEGFP-FGFR1 en el momento de 7 minutos después de la estimulación FGF2 (20 ng/mL en PBS complementado con 0.01% BSA) La serie de 800 fotogramas se reproduce sin comprimir a 7 fps. Formato de imagen: 256 x 256 píxeles; tamaño de píxel a 124 nm; El área de calibración interna se identifica como bandas laterales oscuras. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Supplemental Movie 3
Película suplementaria 3: Serie temporal mostrada en la Figura 5 de una célula HeLa-GPI-mEGFP después de agregar el vehículo (PBS complementado con 0.01% BSA). La serie de 1.000 fotogramas se reproduce sin comprimir a 7 fps. Formato de imagen: 256 x 256 píxeles; tamaño de píxel a 124 nm; El área de calibración interna se identifica como bandas laterales oscuras. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Supplemental Movie 4
Película suplementaria 4: Serie temporal mostrada en la Figura 5 de una célula HeLa-GPI-mEGFP-mEGFP después de agregar el vehículo (PBS complementado con 0.01% BSA). La serie de 1.000 fotogramas se reproduce sin comprimir a 7 fps. Formato de imagen: 256 x 256 píxeles; tamaño de píxel a 124 nm; El área de calibración interna se identifica como bandas laterales oscuras. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

N&B requiere varias precauciones en la elección del modelo celular y la estrategia de etiquetado. Solo se puede aplicar a las celdas vivas que permanecen establemente adheridas durante el tiempo de captura de imágenes. Las fluctuaciones adicionales debidas al desplazamiento rígido de toda la celda podrían manejarse con los enfoques adecuados de restauración de imágenes38. Sin embargo, generalmente cuando una célula se mueve, la membrana celular también se deforma, y la deformación de la estructura, produciendo una gran varianza adicional, introduce una limitación grave en el análisis de las proteínas de membrana. En este trabajo, la construcción fluorescente se expresa en la línea celular HeLa porque la constitutiva FGFR1 es insignificante. La presencia de la proteína constitutiva es una condición para evitar, de lo contrario probablemente se formarían poblaciones mixtas de oligómeros fluorescentes y no fluorescentes. En consecuencia, el análisis N&B, que se basa únicamente en el brillo de la población de proteínas etiquetadas fluorescentes, devolvería una estimación poco fiable del estado oligomérico promedio. Este aspecto es particularmente importante cuando se aplica N&B para detectar eventos de dimerización de receptores en los que el brillo sólo aumenta en un factor de 2, como la dimerización FGFR1 en presencia del ligando FGF2. En tal caso, la presencia de dimers mixtos puede ocultar completamente los eventos de dimerización detectables por N&B. La contaminación de los oligómeros fluorescentes con formas constitutivas no fluorescentes es uno de los posibles escollos de cualquier enfoque basado en la detección de fluorescencia, a menos que la proteína etiquetada esté en gran medida sobreexpresada. Sin embargo, los estudios de oligomerización en condiciones de sobreexpresión de proteínas plantean preocupaciones sobre su significado funcional. Las células transtrinfectadas transitoriamente probablemente tendrán niveles variables de fluorescencia (es decir, concentración de proteínas) y son útiles para probar la independencia del brillo medio en la concentración de proteínas, ya que N&B se puede aplicar a una amplia gama de concentraciones, bajo la condición de respuesta lineal del detector (véase la definición del brillo, eq. 1).

Otra restricción es el etiquetado estequiométrico del receptor utilizando un fluoróforo estable en células vivas. Las etiquetas Halo, las proteínas fluorescentes (FP) u otras etiquetas fluorescentes covalentes son etiquetas adecuadas para obtener un número exacto de fluoróforos enlazados por molécula de proteína en la célula. Para reducir la complejidad del análisis de N&B, utilizamos proteínas fluorescentes o etiquetas de halo que producen un etiquetado de 1 a 1 de fluoróforo a proteína. El FP de elección debe ser monomérico en la forma madura, teniendo una tendencia insignificante de autoasociación que, de lo contrario, podría inducir la oligomerización artificial de los receptores etiquetados con FP. En este protocolo, utilizamos el (A207K)mEGFP porque esta mutación de un solo punto suprime la tendencia autoagregatating mEGFP como se ha mostrado anteriormente31,39,40. Independientemente de la estrategia de etiquetado, la proteína etiquetada fluorescentemente debe comprobarse para la retención de la actividad biológica en el modelo celular elegido, ya que la funcionalidad de las moléculas etiquetadas es esencial para vincular eventos de oligomerización a señalización del receptor. En nuestro modelo, probamos la autofosforilación del fluorescente (A207K)mEGFP-FGFR1 después de estimular las células transinfectadas con el ligando del receptor FGF231.

N&B se basa en la difusión de moléculas en el volumen de iluminación. En la detección de cámara digital, el tiempo de exposición (es decir, el tiempo de permanencia del píxel en la detección analógica, tdwell)debe ser lo suficientemente corto como para que se capture una sola configuración de partículas en el volumen focal. Esto quiere decir que la probabilidad de que un fluoróforo entre o salga del volumen iluminado durante el tiempo de exposición es muy pequeña. El tiempo de exposición debe ser más corto que el tiempo de residencia del fluoróforo (D), que es el tiempo medio que un fluoróforo pasa en el volumen iluminado. Por lo tanto, antes de iniciar un experimento N&B, es necesario tener alguna noción sobre el tiempo de residencia (o el coeficiente de difusión) de la proteína diana, que en una primera aproximación, depende de la localización subcelular y la masa molecular. La velocidad de fotogramas es la inversa del tiempo necesario para que la cámara adquiera una imagen y luego lea completamente esa imagen, y a menudo se calcula aproximadamente a partir del número total de píxeles y la tasa de lectura, combinado con el tiempo de exposición. Aunque la velocidad de fotogramas no necesita ser rápida, el tiempo de ciclo(ciclot),que es la suma de la velocidad de fotogramas y el tiempo para preparar la captura de la siguiente trama, podría afectar al análisis. Estas restricciones se pueden generalizar como: ciclo t >> D >> tdwell. Si el tiempo de ciclo es demasiado rápido, las moléculas no se habrán movido sensiblemente de un fotograma al siguiente en ese tiempo, y aparecerán como inmóviles (B a 1). Sin embargo, debido a que se necesitan cientos de fotogramas para el análisis, el ciclismo se establece lo más rápido posible (aumentando o disminuyendo el formato de la imagen en número de píxeles) para evitar desplazamientos celulares y distorsión de la membrana celular que añadiría una gran varianza adicional durante la adquisición de la serie. En el ejemplo de este protocolo, el tiempo de ciclo más lento es 22 ms, de modo que 500 tramas se pueden adquirir en 11 s.

El brillo molecular no es una cantidad absoluta; Depende de las propiedades moleculares del fluoróforo (sección transversal y rendimiento cuántico), de la configuración experimental (detector y óptica) así como de las condiciones de excitación como la potencia láser. Por lo tanto, el enfoque TIRF-N&B produce un brillo aparente y debido a eso es fundamental establecer un "modelo de celda de referencia" que exprese una construcción de referencia con estado oligomérico unívoca. La construcción de referencia lleva la misma etiqueta de fluoróforo de la proteína en estudio [aquí, el (A207K)mEGFP] y se localiza en el mismo compartimento subcelular (aquí, la membrana plasmática). En este trabajo utilizamos una construcción glycosylphosphatidylinositol (GPI) anclado-(A207K)mEGFP que hemos demostrado repetidamente que es un estándar de brillo monomérico fiable para los receptores de superficie celular etiquetados con el mismo fluoróforo30, 31.

Un inconveniente importante es la ocurrencia de fotoblanqueo de fluoróforo que muy probablemente ocurre cuando la misma célula se expone repetidamente a la luz durante una carrera cinética, y conduce a una subestimación del estado de oligomerización. Para evitarlo, la cinética de brillo se obtiene combinando el brillo medio de las diferentes células capturadas en un punto de tiempo diferente(Figura 6). Esto quiere decir que en un plato de Petri cada célula es un punto de tiempo diferente de la cinética y una placa petri representa toda una carrera cinética.

Cuando la dinámica de oligomerización es rápida y compleja, como la oligomerización FGFR1 inducida por un ligando no canónico, NCAM31, el perfil del brillo medio normalizado frente al tiempo puede ser variable e inestable(Figura 6B ). En tal caso, la reproducibilidad no se puede determinar leyendo los platos de réplica de células en puntos de tiempo precisos, debido a la necesidad de moverse y centrarse en una nueva celda cada vez, seleccionar un ROI, capturar y inspeccionar/descartar series de tiempo. Por lo tanto, la reproducibilidad se puede evaluar en términos de similitud de perfil cinético y amplitud de los cambios de brillo.

En la Figura 7se presenta una descripción general de los resultados. La gráfica de dispersión ilustra solo el brillo medio medido en las celdas del mismo plato, descuidando el tiempo de cada captura. En esta trama la principal diferencia inducida por los dos ligandos sobre el estado de oligomerización del receptor siguen siendo evidentes, aunque toda la información cinética se elimina. Sin embargo, para ambos conjuntos de experimentos (oligomerización inducida por FGF2- frente a NCAM), el enfoque convencional de determinar la media de S.D. de cada ejecución en la Figura 7 conduciría a conclusiones engañosas ya que las moléculas FGFR1 estimuladas por FGF2 claramente tránsito a dos estados bien definidos, mientras que NCAM induce mezclas oligoméricas inestables y cíclicas FGFR1 que no estarían bien representadas por un valor medio de S.D.

En resumen, desde un punto de vista experimental, N&B sólo requiere acceso a un microscopio equipado con un módulo de adquisición rápida y un software dedicado. La proteína de interés se puede etiquetar con una variedad de proteínas fluorescentes monoméricas o fluoróforos orgánicos, pero las mediciones cuantitativas requieren que se cumplan varias condiciones: etiquetado estequiométrico, estándar de brillo de referencia, detector calibración y sin fotoblanqueo. En este contexto, el enfoque N&B es una poderosa herramienta para descifrar la oligomerización espaciotemporal de proteínas en células vivas. Además, los recientes avances en el remuestreo de datos en bruto para resolver la ponderación estadística41 y la combinación de espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia con correlación cruzada N&B42 están refinando y mejorando la aplicabilidad de la N &B enfoque para la oligomerización de proteínas y estudios de interacción.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El CNIC cuenta con el apoyo del Ministerio de Ciencia, Innovacion y Universidades y la Fundación Pro CNIC, y es un Centro de Excelencia Severo Ochoa (SEV-2015-0505). También contamos con el apoyo del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) "Una manera de hacer Europa". La UC reconoce el apoyo de la Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, la Asociación para la Investigación Internacional del Cáncer (ahora conocida como Worldwide Cancer Research) y el Ministerio de Salud italiano. A.T. reconoce a la "Fondazione Banca del Monte di Lombardia" por apoyar parcialmente su trabajo con la Beca FOTO "Progetto Profesionalitá Ivano Becchi" 2011-2012.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 21063029 Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10566-016 Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Biowest, Nuaillé, France X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2 TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10270106 10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishes MatTek, Ashland, MA, USA P35G-0.170-14-C uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA LONZA 17-602E supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2 PeproTech EC, Ltd., London, UK Ligand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO ThermoFisher Scientific 11360070 1 mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent MirusBio LLC, Madison, WI, USA MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 25200056
Type F Immersion liquid 10 mL Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific AM2618 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
  2. Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
  3. Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. Muscarinic receptor oligomerization. Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).
  4. Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
  5. Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
  6. Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
  7. Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
  8. Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
  9. Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
  10. Trussell, H. J., et al. Academic Press Library in Signal Processing. Trussell, J., et al. 4, Elsevier. 3-9 (2014).
  11. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  12. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  13. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
  14. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  15. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  16. Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
  17. Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
  18. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  19. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  20. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  21. Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
  22. Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
  23. Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047 (2016).
  24. Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
  25. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  26. Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
  27. Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
  28. Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
  29. Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
  30. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  31. Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
  32. Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
  33. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).
  34. Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
  35. Joubert, J., Sharma, D. Light microscopy digital imaging. Current Protocols in Cytometry. , (2011).
  36. Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
  37. Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).
  38. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  39. Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
  40. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
  41. Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
  42. Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).

Tags

Biología Número 153 Clústeres de receptores N&B Número y brillo análisis de momentos oligómeros proteicos membrana celular microscopía TIRF
Dinámica de oligomerización de receptores de superficie celular en células vivas mediante la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total combinada con análisis de número y brillo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zamai, M., Trullo, A., Arza, E.,… More

Zamai, M., Trullo, A., Arza, E., Cavallaro, U., Caiolfa, V. R. Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60398, doi:10.3791/60398 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter