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Dinamica di oligomerizzazione dei recettori delle superfici cellulari nelle cellule viventi mediante microscopia a fluorescenza totale di riflessione interna combinata con l'analisi del numero e della luminosità

Published: November 6, 2019 doi: 10.3791/60398
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1,2
1Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain, 2Centro di Imaging Sperimentale, Ospedale San Raffaele, Milan, Italy, 3Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy

Summary

Descriviamo un approccio di imaging per la determinazione dello stato oligomerico oligomerico medio degli oligomeri mEGFP-tagged-receptor indotti dal legame del ligando nella membrana plasmatica delle cellule viventi. Il protocollo si basa sulla microscopia TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) combinata con l'analisi di Number and Brightness (N&B).

Abstract

Nonostante l'importanza e l'ubiquità dell'oligomerizzazione del recettore, pochi metodi sono applicabili per rilevare gli eventi di clustering e misurare il grado di clustering. Qui, descriviamo un approccio imaging per determinare lo stato oligomerico medio degli omocomplessi del recettore mEGFP nella membrana delle cellule viventi. Il protocollo si basa sulla microscopia TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) combinata con l'analisi di Number and Brightness (N&B). N&B è un metodo simile alla spettroscopia fluorescenza-correlazione (FCS) e all'istogramma di conteggio dei fotoni (PCH), che si basano sull'analisi statistica delle fluttuazioni dell'intensità della fluorescenza dei fluorofori che si diffondono dentro e fuori da un'illuminazione volume durante un periodo di osservazione. In particolare, N&B è una semplificazione del PCH per ottenere informazioni sul numero medio di proteine nelle miscele oligomeriche. Le ampiezze di fluttuazione dell'intensità sono descritte dalla luminosità molecolare del fluoroforo e dal numero medio di fluorofori all'interno del volume di illuminazione. Pertanto, N&B considera solo il primo e il secondo momento della distribuzione dell'ampiezza, vale a dire l'intensità media e la varianza. Questo è, allo stesso tempo, la forza e la debolezza del metodo. Poiché vengono considerati solo due momenti, N&B non è in grado di determinare la frazione molare degli oligomeri sconosciuti in una miscela, ma stima solo lo stato medio di oligomerizzazione della miscela. Tuttavia, può essere applicato a serie temporali relativamente piccole (rispetto ad altri metodi di momento) di immagini di cellule vive su base pixel per pixel, semplicemente monitorando le fluttuazioni temporali dell'intensità della fluorescenza. Riduce il tempo effettivo per pixel a pochi microsecondi, consentendo l'acquisizione nell'intervallo di tempo di secondi a millisecondi, che è necessario per l'oligomerizzazione rapida cinetica. Infine, è possibile esplorare grandi aree cellulari e compartimenti subcellulari.

Introduction

Descriviamo un approccio di imaging TIRF-N&B (Total Internal Reflection Fluorescence-Number and Brightness) per determinare lo stato oligomerico medio delle molecole recettoriali alla membrana plasmatica delle cellule vive, con l'obiettivo di collegare l'assemblaggio del recettore funzione biologica delle proteine (Figura 1).

Al momento del legame del ligando extracellulare, i recettori avviano la trasduzione del segnale intracellulare a seconda della loro conformazione, oligomerizzazione, potenziali co-recettori e composizione della membrana. Nonostante l'importanza e l'ubiquità dell'oligomerizzazione del recettore, riconosciuto come un evento chiave nella segnalazione cellulare1,2,3,4,5,6, 7, pochi metodi possono rilevare gli eventi di clustering e misurare il grado di clustering sperimentalmente8,9. Il volume confocale (x,y : 300 nm, z ) non è sufficientemente risolto per dimostrare l'interazione molecolare e la stoichiometria, anche dopo l'ottimizzazione da parte degli algoritmi di ripristino delle immagini10. La composizione di sottounità di oligomeri proteici non può essere risolta su base puramente spaziale anche con metodi di super-risoluzione a risoluzione x,y di 20-70 nm come PALM11, STORM12e STED13. Inoltre, la loro risoluzione temporale (nell'ordine dei minuti per immagine) non può seguire la cinetica nell'intervallo di secondi. Lo sbiancamento a passo di singola molecola risolve la stoichiometria degli oligomeri proteici solo se sono immobili14.

Uno dei metodi più versatili per misurare la densità e l'oligomerizzazione delle proteine fluorescenti all'interno di singole immagini è l'analisi della distribuzione dell'intensità spaziale (SpIDA), che si basa sul campionamento spaziale. È applicabile sia alle cellule chimicamente fisse che vive e consente l'analisi di diverse regioni di interesse della cellula contemporaneamente utilizzando la microscopia a fluorescenza standard15. In alternativa, i metodi del momento, come la spettroscopia fluorescenza-correlazione (FCS)16, l'istogramma di conteggio fotone (PCH)17e il numero e la luminosità (N&B)18,19, sono adatti per oligomeri quantitativi Misure. Questi metodi analizzano le fluttuazioni di intensità della fluorescenza che possono essere osservate nel tempo in cui i fluorofori si diffondono dentro e fuori da un volume di illuminazione. Le ampiezze delle fluttuazioni di intensità possono essere descritte in modo univoco dalla luminosità molecolare del fluoroforo e dal numero medio di fluorofori (n) all'interno del volume di illuminazione17 (Figura 2). Tipicamente, il coefficiente di diffusione dei fluorofori e il numero medio di molecole (inversamente correlate al valore G(0) all'interno del volume di illuminazione possono essere ottenuti da FCS20. Tuttavia, poiché il tempo di diffusione si adatta solo alla radice cubica della massa, la FCS non è sufficientemente sensibile per rilevare i cambiamenti nella massa molecolare21. In pratica, fcS monocolore non è in grado di rilevare la dimerizzazione dei recettori della membrana. PCH risolve con precisione le miscele di diversi oligomeri. Utilizzando più di due momenti della distribuzione dell'ampiezza, rileva molecole di luminosità diversa che occupano lo stesso volume di illuminazione. Scansione FCS22 e sviluppi, come l'interessante coppia-correlazione di luminosità molecolare (pCOMB) approccio23, introdotto per estendere la gamma di applicabilità dei metodi di correlazione della fluorescenza nei sistemi biologici24 , rimangono metodi a punto singolo privi della capacità di misurazioni veloci in un'ampia area di una cella, richiedendo molte osservazioni consecutive ad ogni pixel e l'acquisizione di dati nell'ordine di secondi.

N&B è una versione semplificata di PCH che considera solo il primo e il secondo momento dell'ampiezza della distribuzione della fluorescenza, vale a dire l'intensità media, , e la varianza,2 (Figura 2)18,19 e, per questo motivo, non può determinare la frazione molare di oligomeri sconosciuti in una miscela, ma stima solo lo stato medio di oligomerizzazione della miscela. Tuttavia, N&B ha il vantaggio di lavorare con serie temporali relativamente più piccole di immagini di cellule vive rispetto al PCH su base pixel per pixel, semplicemente monitorando le fluttuazioni al momento dell'intensità di fluorescenza. Poiché N&B riduce il tempo per pixel a pochi microsecondi, può seguire cinetiche di oligomerizzazione veloce su grandi aree cellulari, consentendo l'acquisizione di immagini su una scala temporale di secondi nella microscopia a scansione raster (ad esempio, confocale, 2 fotone) e millisecondi microscopia basata su fotocamera (ad es. TIRFM).

Diversi rapporti hanno dimostrato la capacità di N&B di quantificare il numero di sottounità nei cluster proteici mediante l'imaging di regioni cellulari estese. Gli ammassi di Paxillin-EGFP sono stati rilevati nei siti di adesione nelle cellule CHO-K125e l'aggregazione intracellulare del peptide patogeno Httex1p è stata descritta nelle cellule COS-726. N&B è stato richiesto per seguire l'oligomerizzazione guidata dal ligando del recettore ErbB27e l'effetto del ligand FGF21 su Klothob (KLB) e FGFR1c nelle celle HeLa28. La combinazione di imaging TIRF e analisi N&B è stata utilizzata per dimostrare che la dinamina-2 è principalmente tetramerica in tutta la membrana cellulare29. Abbiamo applicato N&B sia alla scansione raster che alle immagini TIRF per dimostrare la dimerizzazione guidata dal ligando dei recettori della membrana cellulare uPAR e FGFR130,31.

I metodi di correlazione della fluorescenza, come N&B, FCS e PCH, si basano sull'idea che in un volume aperto il numero di occupazione delle particelle segua una distribuzione di Poisson. Poiché possono essere rilevati solo i fotoni emettiti dai fluorofori, il valore medio per un'intensità di fluorescenza misurata rispetto al tempo in un pixel dell'immagine, è il prodotto del numero medio di fluorofori nel volume di illuminazione, n, e la loro luminosità molecolare,17:

dove il numero di fotoni emessi per unità di tempo (convenzionalmente al secondo) per molecola quando la molecola è al centro del volume di illuminazione.

La luminosità è una proprietà di ogni fluoroforo in una data acquisizione impostata, mentre l'intensità è la somma di tutti i contributi di tutti i fluorofori. Nei concorsi biologici, la luminosità aumenterà con l'aumento del numero di fluorofori che fluttuano insieme, fornendo informazioni sullo stato di oligomerizzazione della proteina fluorescente. Le ampiezze di fluttuazione in un determinato pixel vengono misuratedalla varianza del segnale di fluorescenza,

Dove la media del quadrato di intensità, , e il quadrato della media di intensità, , vengono calcolati dai singoli valori di intensità in ogni pixel di ogni fotogramma:

dove K è il numero di fotogrammi totali nella serie temporale. Sperimentalmente, è necessario calcolare per l'intera serie di immagini la varianza che descrive la dispersione dei singoli valori di intensità in ogni pixel di una singola immagine intorno al valore di intensità media. La varianza include tutte le fluttuazioni di origini diverse. In una prima approssimazione, la varianza dovuta alla diffazione delle particelle di fusione nel volume di illuminazione,20, può essere separata dalla varianza a causa del rumore del rivelatore,2d. Le due varianze sono indipendenti; pertanto, la varianza totale è data dalla loro somma:

La varianza, dovuta alle fluttuazioni molecolari all'esterno e all'esterno del volume di rilevamento, dipende linearmente dalla luminosità e dall'intensità molecolari:

Riorganizzazione di eq. 6 in base a eq. 1:

Secondo il concetto tipico nella spettroscopia di correlazione a fluorescenza, l'equazione 7 afferma che la varianza dovuta al numero di fluttuazioni dipende dal quadrato della luminosità della particella.

Quindi, la varianza dovuta alle fluttuazioni del rivelatore è una funzione lineare dell'intensità rilevata, partendo dal presupposto che il rivelatore sia azionato al di sotto del suo limite di saturazione19:

Nel caso dei rilevatori di conteggio dei fotoni unvalore 1 e c.0, quindi la varianza del rivelatore è uguale all'intensità media:

Per applicare questi concetti alle misurazioni reali nelle cellule vive, Gratton e colleghi18 definiscono la luminosità apparente, B, per ogni pixel come rapporto della varianza rispetto all'intensità media:

B è il parametro misurato sperimentalmente. In questo lavoro, le immagini di serie temporali dei recettori FGFR1 nella membrana plasmatica delle cellule HeLa vengono catturate dalla microscopia TIRF e la luminosità media apparente, B, è determinata dall'analisi N&B. Quindi, dopo l'aggiunta di FGF2, serie temporali consecutive vengono catturate per seguire i cambiamenti nell'auto-assemblaggio delle molecole recettoriali nella superficie della membrana dopo la stimolazione del recettore con il ligando canonico.

Tuttavia, poiché il rilevatore del microscopio TIRF è una telecamera EMCCD, l'espressione per la luminosità apparente deve essere modificata come19:

dove offset è l'offset di intensità dell'elettronica di rilevamento che è una caratteristica delle impostazioni del rivelatore. La varianza e l'intensità media per un rilevatore analogico sono date rispettivamente da:

dove G è il guadagno analogico nei livelli digitali (DL/fotoni), S, i livelli digitali per fotone19, è dato dalla pendenza di un'intensità rispetto al grafico di varianza per una fonte di luce con intensità costante (senza fluttuazioni temporali). Il fattore z è correlato alla forma del volume di rilevamento dei pixel. Secondo Hassler et al.32, il fattore z è pari a 0,3 per l'imaging TIRF che lavora al massimo guadagno della telecamera di rilevamento19. I parametri offset, S e G sono caratteristiche della fotocamera e del microscopio. La luminosità apparente, B, si ottiene riorganizzando eq. 11 secondo eq. 12 e 13:

Dal punto di torto dal punto di toesa dal punto di tordo, è una funzione complessa dell'intensità del laser e dell'efficienza di rilevamento del sistema. Tuttavia, dal momento che B/S dipende linearmente da , è importante solo determinare il valore relativo di , per una determinata modalità di rilevamento:

dove è proporzionale a " s" . Tuttavia, una calibrazione viene eseguita utilizzando un riferimento interno.

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Protocol

1. Preparazione del campione

  1. Primo giorno. Cellule di semi HeLa in mezzo completo ad una concentrazione di 100.000-200,000 cellule / mL in piatti in vetro-fondo. Seme 6-8 replicare piatti.
    NOT: In questo esempio, il mezzo è integrato con il 10% di calore inattivato Siero Fetale Bovino (FBS), 1 mM di pirata di sodio, 100 U/100 g di penicillina/streptomicina. Diversi piatti replicare sono preparati.
  2. Giorno 2-3. Quando le cellule sono a sub-confluenza, trasfect metà dei piatti con il plasmide proteico e la seconda metà con plasmidi di riferimento (monomero e dimero), in mezzo senza siero.
    NOT: La trasfezione è fatta in mezzo senza siero integrato con antibiotici, 0.1% Bovine Serum Albumin e 25 mM HEPES tampone, senza Phenol Red.
  3. Giorno 3-4. Verificare che le cellule trasfette siano aderenti al fondo dei piatti e che la membrana cellulare sia fluorescente. Scartare i piatti con cellule incolte o con fluorescenza molto bassa.
    NOT: Non lasciare che le cellule crescano troppo. Le celle devono essere ben distribuite ed essere aderenti all'area di vetro del piatto (Figura 1A). I piatti di fondo in vetro prerivestito possono essere utilizzati per favorire l'adesione cellulare. La coltura cellulare viene testata per la contaminazione da micoplasma prima di qualsiasi esperimento. In questo esempio, le cellule vengono trafettate con un plasmid (A207K)mEGFP-FGFR1 e le celle di riferimento vengono transinfettate con un ploto GPI-(A207K)mEGFP e gpI-(A207K)mEGFP-(A207K)mEGFP utilizzando protocolli standard. Per la microscopia a cellule vive, si consiglia un mezzo privo di indicatori; Viene aggiunto il buffer HEPES da 25 mM per evitare cambiamenti di pH durante l'imaging.

2. TIRF Imaging - Allineamento della linea laser e ottimizzazione dell'illuminazione TIRF

  1. Quattro ore prima dell'esperimento, attivare l'incubatrice di temperatura del microscopio a 37 gradi centigradi.
  2. Accendere il microscopio, computer e telecamere e attendere che le telecamere raggiungano la temperatura di lavoro corretta.
    NOT: La temperatura di lavoro della telecamera utilizzata in questo studio è -75 gradi centigradi.
  3. Mettere una piccola goccia di olio sull'obiettivo. Mettere in atto un piatto campione. Chiudete le porte dell'incubatrice e lasciate che la temperatura del piatto sia equilibrata (10 min).
  4. Accendere la lampada a epifluorescenza e il laser da 488 nm.
  5. Selezionare la modalità contrasto dell'epiorescenza per esplorare il campione, cercando una cella per mettere a fuoco l'oculare.
    NOT: L'uso di una lampada fluorescente per la ricerca di cellule attraverso l'oculare non è obbligatorio. Al suo posto è possibile utilizzare una linea laser adatta.
  6. Selezionare il filtro appropriato per la raccolta dell'emissione verde attraverso la telecamera al microscopio (Band Pass Ex 490/20 (500) Band Pass Em 525/50, o simili.
  7. Passare dalla porta oculare alla porta della fotocamera (#1 della telecamera nella Figura 1) in modalità epifluorescenza, perfezionare la messa a fuoco e passare alla modalità TIRF. Le modalità di epifluorescenza e TIRF potrebbero essere denominate con una nomenclatura diversa a seconda della marca del microscopio.
    NOT: Ci possono essere problemi di messa a fuoco o allineamento del laser se non ci sono marcatori fluorescenti all'interfaccia coverslip. Per allineare correttamente il laser (essenziale per un buon TIRF), concentrarsi sul coperchio. Spesso è molto difficile determinare se il coverslip è a fuoco. Come suggerimento, concentrati sui bordi delle celle.
  8. Attivare l'allineamento automatico seguendo le istruzioni del microscopio TIRF.
    NOT: In breve, per i passi da 2.4 a 2.8, prima trova le cellule attraverso l'oculare e concentrati su di esse, quindi invia l'emissione alla porta della telecamera del microscopio TIRF, rifocalici le cellule sullo schermo del computer al microscopio e attiva la procedura per l'allineamento laser. L'allineamento consiste nel trovare l'angolo critico in cui l'illuminazione diventa evanescente (Figura 3). I microscopi commerciali potrebbero avere protocolli di allineamento leggermente diversi e anche essere completamente automatizzati; altri potrebbero avere una piccola fotocamera per facilitare la visualizzazione delle condizioni critiche dell'angolo.
  9. Scegliere una profondità di illuminazione adatta e ottimizzare la direzione del campo evanescente (Figura 3).
    NOT: La profondità di penetrazione è mantenuta costante per tutti i controlli e campioni.

3. TIRF Imaging: Cattura della serie temporale

  1. Definire un'area di interesse (ROI) di almeno 256 x 256 pixel.
    NOT: In questa configurazione, l'acquisizione viene eseguita con la fotocamera #2 sotto un software che controlla direttamente solo la fotocamera (vedere La legenda della Figura 1).
  2. Impostare l'esposizione a 1 ms e il guadagno EM a 1.000 (questo è il fattore G in eq. 12 e 13). A tale velocità, potrebbe essere necessario regolare o aumentare la potenza del laser. Qui la potenza del laser è di 0,5 mW.
    NOT: A seconda del tipo di fotocamera e dei limiti imposti dal coefficiente di diffusione della proteina, dall'intensità della fluorescenza e dallo sfondo, i criteri generali per impostare la potenza laser non sono di saturare il rivelatore, ridurre al minimo il fotosbleaching e veloce possibile ad un ragionevole S/N. Il guadagno EM è sempre impostato al massimo della fotocamera (vedi Introduzione).
  3. Eseguire una prima sequenza di prova nelle condizioni iniziali e stimare approssimativamente il valore S/N. Le condizioni sono accettabili a S/N : 2-3 o superiore, come misurato nel primo fotogramma della prima serie temporale.
  4. Utilizzare il dispositivo di scorrimento del sistema di divisione delle emissioni che collega la telecamera #2 al microscopio per mascherare un lato dell'immagine (Figura 1B, Figura 4A-B)
    NOT: In questa configurazione viene installato un connettore di imaging multicanale sulla fotocamera #2 per consentire l'acquisizione simultanea di due immagini identiche spazialmente. Il sistema è dotato di vetrini per il montaggio di diversi filtri di emissione. Uno dei cursori monta una maschera nera per coprire un lato dell'immagine. L'area mascherata viene utilizzata per la calibrazione interna di ogni serie temporale, per determinare i parametri della telecamera (eq. 12 e 13). In questo modo non è necessaria una fase di calibrazione indipendente e, soprattutto, la calibrazione viene eseguita in parallelo all'acquisizione di ogni serie temporale. In assenza di questo sistema, la telecamera può essere calibrata applicando i protocolli pubblicati33.
  5. Selezionare l'opzione di salvataggio automatico del file della fotocamera.
  6. Avviare l'acquisizione della serie di immagini. Acquisire un minimo di 700 fotogrammi ad un rapporto S/N minimo di 2.
    NOT: Il numero di fotogrammi necessari per l'analisi dipende dalla stabilità del campione al fotosbiancamento e dalla dispersione dei dati. Pertanto, la qualità di ogni serie temporale viene valutata durante l'analisi N&B.
  7. Senza togliere il piatto dal microscopio, aggiungere il ligando.
  8. Selezionare una cella con una membrana a fluorescenza luminosa e iniziare rapidamente la prima serie temporale della corsa cinetica.
    NOT: Se l'aggiunta del ligando viene eseguita rapidamente, questa prima cattura imposta il punto - 0 tempo della cinetica ligando. Il software registra l'ora esatta dell'acquisizione.
  9. Cerca una seconda cella e acquisisci il secondo punto temporale della cinetica.
    NOT: Routine di osservazione dei punti sono disponibili in alcuni microscopi dotati di stadi motorizzati x,y,z. Questi consentono la memorizzazione di più posizioni sulla parabola cellulare, e possono aiutare a mantenere un intervallo di tempo più costante tra la serie di immagini su celle diverse.
  10. Cattura una nuova cella per ogni punto temporale della corsa cinetica.
    NOT: Dopo l'acquisizione, una cella viene parzialmente fotosbiancata e non può essere riesaminata. Per questo scopo, la cinetica si ottiene combinando serie temporali di molte celle, ognuna catturata in un punto temporale diverso.
  11. Per ogni nuovo piatto, ripetere il protocollo dal punto 2.3 al 3.9.
    NOT: Per i piatti di riferimento, aggiungere un volume del veicolo (PBS integrato con 0.01% di semastro bovino albumin) equivalente a quello utilizzato per il ligando.

4. Numero & Luminosità (N&B): Controllo qualità della serie temporale

  1. Convertire e salvare come . TIFF i file acquisiti con il software della fotocamera (file .sif in questo esempio).
  2. Importazione. FILE TIFF nella routine del software di analisi attivando il N&B graphical user interface (GUI) MATLAB.
    NOT: Qui viene utilizzata una routine N&B eseguibile Matlab personalizzata (analisi N&B presso https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). Aprendo un file . TIFF, la routine genera l'immagine di intensità media, il profilo di intensità media e consente di ispezionare la serie fotogramma per fotogramma (Figura supplementare 1). Altri software sono disponibili per l'analisi N&B (ad esempio, il software SimFCS).
  3. Eliminare le serie per le quali il profilo di intensità media mostra più del 10% di fotosbiancamento, e serie in cui c'è stata un'evidente distorsione della membrana cellulare o traduzione durante l'acquisizione.
  4. Ritagliare le cornici evidentemente sfocate.
    NOT: Uno strumento di ritaglio viene implementato nella routine per eliminare singoli o più fotogrammi all'interno della serie di immagini. Questa operazione è consentita perché il tempo da fotogramma a fotogramma non è critico, mentre il tempo di perlatura in pixel (tempo di esposizione) è (vedere Discussione).
  5. Conservare solo per l'analisi serie con almeno 500 intervalli di tempo.

5. Numero e luminosità (N&B): Determinazione dei parametri della fotocamera (Offset,

  1. Attivare la fotocamera Calibratedi routine .
  2. Selezionate un'area di almeno 20 x 50 pixel nella regione di disturbo del rivelatore (Figura 4).
    NOT: La routine origina un istogramma dei valori (definito anche Digital Level, DL) e restituisce un grafico logaritmo della frequenza rispetto ai livelli digitali.
  3. Nel grafico Frequenza di registro rispetto a livello digitale, spostare il cursore rosso lineare per delimitare la parte gaussiana e la parte lineare della curva.
    NOT: Il cursore rosso divide le due sezioni della curva e attiva la routine di restituzione dell'offset, che è il centro della funzione gaussiana della risposta della fotocamera, la slittamento gaussiana e il fattore S, che è la pendenza della parte lineare dei respons della fotocamera e (Figura 4C-D).

6. Numero e luminosità (N&B): calcolo dei valori B in Regione di interesse (ROI) selezionata

  1. Attivare il tasto B.
    NOT: Questa azione genera l'immagine di intensità media (Figura 5, prima colonna) e l'immagine B in cui ogni singolo valore B è associato al pixel correlato nell'immagine (Figura supplementare 1).
  2. Applicare un raccoglimento minimo (2 2) per ridurre la dispersione dei dati e generare l'istogramma B-I(Figura 5, seconda colonna).
    NOT: L'istogramma B-I rappresenta la distribuzione dei valori B di tutti i pixel dell'immagine rispetto all'intensità dei pixel. Y - B/S; X (- offset)/S(Figura supplementare 1 ed eq. 11 e 15).
  3. Esaminare l'istogramma B-I utilizzando il cursore quadrato interattivo.
  4. Selezionare un ROI quadrato per l'analisi (Figura 5, terza colonna).
    NOT: Il cursore sincronizza una maschera mobile sull'immagine di intensità media, evidenziando i pixel selezionati all'interno dell'area del cursore quadrato (Figura supplementare 1). Con questa ispezione, è possibile escludere dall'analisi lo sfondo e le aree con intensità molto bassa.
  5. Generare la mappa B del ROI selezionato (Figura 5, quarta colonna).
  6. Salvare il file ASCII dei valori B associati alla selezione.
  7. Importare il file ASCII in un software grafico per calcolare la distribuzione della frequenza dei dati e ottenere il valore Medio B - S.E (Figura 5, quinta colonna).
    NOT: Se i dati sono omogenei, la distribuzione della frequenza dei valori B si avvicina a una distribuzione gaussiana.
  8. Applicare eq. 15 per derivare la luminosità media - - 1 [(conteggi/molecola) per tempo di abitare] per ogni cellula ad ogni punto temporale della corsa cinetica. Normalizzare i dati in base a:

    dove è il valore Medio B misurato al momento "t" dopo l'aggiunta del ligando, ed è il valore Medio B misurato al momento di t-0 (10-20 s dopo l'aggiunta del ligando).
    NOT: La normalizzazione dei risultati consente il confronto diretto degli esperimenti che vengono effettuati in giorni diversi. Compensa le differenze nella luminosità misurata a causa della potenza del laser e delle fluttuazioni tecniche.
  9. Tracciare la luminosità media normalizzata rispetto al tempo di acquisizione per costruire la corsa cinetica (Figura 6).

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Representative Results

I risultati per due celle HeLa-mEGFP-FGFR1 rappresentative seminato nello stesso piatto di coltura sono mostrati nella Figura 5 e nella Tabella supplementare 1. Le due celle sono state catturate al momento 0 min (Figura 5A, superiore) e 7 min (Figura 5A, fondo) dopo l'aggiunta del ligando FGF2.

La figura 5 mostra anche i risultati di due celle HeLa rappresentative che esprimono il monomero puro, GPI-mEGFP(Figura 5B, in alto), o il fluoroforo dimeric collegato in modo covalente, GPI-mEGFP-mEGFP(Figura 5B, fondo ), esposto alla membrana cellulare e catturato nelle stesse condizioni sperimentali.

La luminosità apparente media, B, nelle celle HeLa-mEGFP-FGFR1 aumenta da 1,070 - 0,001 S.E. a 1,141 - 0.001 S.E., mentre i campioni monnomici di riferimento (Figura 5B, superiore) e dimeric (Figura 5B, fondo) restituiscono B valori rispettivamente di 1.070 - 0.001 S.E. e 1.141 - 0.001 S.E. Così, in confronto, il recettore FGFR1 è presente principalmente nella forma monomerica alla superficie della membrana cellulare all'inizio, ma progredisce verso uno stato dimeric predominante dopo la stimolazione con il suo legamento canonico FGF2. In media, quindi, lo stato prevalente delle molecole FGFR1 nelle due cellule rappresentative è chiaramente diverso.

Applicando l'analisi a più celle nello stesso piatto, ognuna catturata in un punto di tempo diverso, si ottiene la luminosità media in funzione del tempo (Figura 6A). L'esecuzione cinetica in Figura 6A descrive un processo lento di dimerizzazione che persiste per diversi minuti sulla superficie della cella. La dimerizzazione FGFR1 indotta dalla FGF2 e la successiva internalizzazione del recettore è un meccanismo ben noto34; pertanto, i risultati sono pienamente in accordo con la nozione attuale sulla trasduzione del segnale FGFR1 e confermano la potenzialità dell'approccio TIRF-N&B per studiare l'oligomerizzazione delle proteine della membrana cellulare fino alla determinazione del sottile dinamiche monomer-dimer.

L'analisi della luminosità media normalizzata dei risultati è uno strumento adatto per confrontare l'effetto di diversi ligandi sullo stesso recettore. Un esempio è dato in Figura 6B. Il protocollo è stato ripetuto utilizzando gli stessi standard e stimolando le cellule con un ligando FGFR1 non canonico, NCAM-Fc (50 g/mL). In questo caso, il profilo cinetico rivela transizioni veloci e cicliche del recettore in miscele oligomeriche, che raggiunge anche i valori di luminosità superiori a quelli del dimero. Un valore medio normalizzato di 3 viene ripetutamente osservato. Tuttavia, la limitazione dell'analisi N&B (solo due momenti della fluttuazione dell'intensità rispetto al tempo sono considerati) non consente di dimostrare senza dubbio la formazione di una forma trimrica. La stessa luminosità media normalizzata potrebbe essere il risultato di varie combinazioni di oligomeri più grandi e monomeri del recettore. Tuttavia, i risultati dimostrano chiaramente le differenze spatiotemporali dell'effetto dei due ligandi sullo stesso recettore.

Figure 1
Figura 1: Panoramica del protocollo sperimentale. (A) Le cellule sono placcate su piatti di fondo in vetro e trascate con il recettore fluorescentmente etichettato. (B) Le immagini delle serie temporali vengono catturate in un microscopio TIRF commerciale dotato di un obiettivo petrolifero TIRF 100x 1.46 e di una camera di incubatrice. In questa configurazione commerciale, il software non consente alla fotocamera EMCCD integrata #1 di funzionare in tempi di esposizione molto brevi necessari per l'acquisizione di serie temporali N&B. Questo è un punto importante poiché il tempo di esposizione limita la gamma di diffusioni molecolari che possono essere catturate. Più breve è il tempo di esposizione, più veloce è la diffusione molecolare che può essere analizzata. Esposizioni che vanno da 0,5 a 1 ms sono sufficientemente veloci per la diffusione delle proteine della membrana. Pertanto, una seconda telecamera EMCCD (#2) viene aggiunta a una porta aggiuntiva del microscopio per lavorare direttamente sotto il software della fotocamera, bypassando il software del microscopio. In questa configurazione adattata, il software del microscopio e la fotocamera #1 vengono utilizzati solo per l'allineamento TIRF. Le serie temporali TIRF vengono quindi acquisite utilizzando #2 della telecamera che viene eseguito in tempi di esposizione molto brevi, ad esempio 1 ms e al massimo guadagno EM. La fotocamera #2 ha anche una dimensione in pixel di 124 nm che consente il sovracampionamento e il binning delle immagini (vedere la sezione protocollo 6.2). Altre configurazioni per ottenere la velocità di imaging sono possibili, a seconda delle caratteristiche dei diversi microscopi TIRF, mentre l'uso di telecamere sCMOS non è consigliabile, perché il rumore non è casuale nell'immagine35. (C) Dopo l'acquisizione, le serie temporali vengono ispezionate come un controllo di qualità. Le serie vengono eliminate se il fotosbleaching è superiore al 10%, in quanto è possibile determinarlo tracciando l'intensità media del fotogramma rispetto al numero di fotogramma. Le serie vengono eliminate anche se c'è stata un'evidente distorsione della membrana cellulare o la traduzione della cellula durante l'acquisizione. (D) L'intensità media di ogni pixel viene salvata. (E) Viene generato un istogramma B-I che rappresenta la luminosità apparente, B, in ogni pixel dell'immagine. (F) L'istogramma B-I viene utilizzato per selezionare un ROI che si trova sopra lo sfondo. (G) La distribuzione di frequenza dei valori B viene analizzata per determinare il valore Medio B - S.E. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa cifra.

Figure 2
Figura 2: Principio N&B. N&B quantifica lo stato medio di oligomerizzazione dei fluorofori misurando le fluttuazioni di fluorescenza che si verificano quando si muovono dentro e fuori il volume di illuminazione durante l'acquisizione di una serie di stack temporali di immagini "K". L'ampiezza delle fluttuazioni è caratterizzata statisticamente dal calcolo del rapportotra la varianza del segnale fluttuante, . Nello scenario più semplice (A), quando il volume di illuminazione è vuoto (cioè, nessun fluoroforo), il rapporto descrive il rumore dello strumento. Se il segnale di fluorescenza fluttua a causa di fluorofori mobili (B,C), la varianza "extra" è direttamente proporzionale alla luminosità molecolare, ovvero il numero di fotoni per molecola e al secondo, delle molecole di diffazione. In (B), ci sono 8 fluorofori monomerici che fingevano fluorofori e in (C), gli stessi fluorofori si diffondono come 2 oligomeri tetrameri. In questi due casi, l'intensità media è la stessa, ma la deviazione standard e la luminosità sono diverse (1 , 4 , 4 , perché le ampiezza delle fluttuazioni sono diverse. 0 quando i fluorofori sono immobili o assenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: microscopia TIRF. Sebbene N&B funzioni altrettanto bene con microscopi a scansione raster dotati di laser multifotone, laser a onde continue o pulsati a singolo fotone e rilevatori di conteggio analogici o fotoni, la microscopia TIRF è ideale per l'imaging temporale veloce della dinamica molecolare eventi che si verificano sulla superficie cellulare o vicino a quella della cella con velocità, risoluzione e rapporto segnale/rumore (S/N) che non sono possibili da altre tecniche di imaging. (A) La microscopia TIRF utilizza il principio della riflessione interna totale mediante il quale una luce laser ad eccitazione angolata eccita solo i fluorofori che si trovano appena sotto un'interfaccia vetro-acqua del coperchio. Il laser irradia il campione con un angolo di incidenza maggiore o uguale all'angolo critico di rifrazione, mentre la luce laser di eccitazione è totalmente riflessa. Il riflesso genera un campo elettromagnetico molto sottile nel campione chiamato onda evanescente. La luce fluorescente risultante emessa dalla minuscola sezione illuminata del campione viene raccolta attraverso un obiettivo al microscopio posto perpendicolarmente sotto il vetrino. (B) Il pannello mostra un esempio rappresentativo ad una data lunghezza d'onda dell'intensità relativa di un campo evanescente rispetto alla profondità, che diminuisce esponenzialmente con l'aumentare della distanza dalla superficie, fornendo una fluorescenza ad alta risoluzione assiale Immagini. La risoluzione laterale è impostata dall'apertura numerica e dall'ingrandimento dell'obiettivo e dalle dimensioni in pixel della telecamera di rilevamento. L'interno della cellula non è illuminato e non contribuisce al segnale con l'autofluorescenza intracellulare. I microscopi TIRF multi-angolo consentono di selezionare varie profondità di penetrazione. Forniscono una scala che dipende dalla lunghezza d'onda dell'eccitazione e di solito va da 70 nm fino a 250 nm di profondità per l'immagine TIRF a colore singolo. La profondità di illuminazione evanescente scelta per questo protocollo è di 110 nm, ed è il risultato di un compromesso tra la necessità di utilizzare una bassa potenza laser e l'intensità del segnale di fluorescenza che diminuisce bruscamente con la diminuzione della profondità di penetrazione. È importante evitare campi evanescenti eccessivamente grandi che possono illuminare molte vesciche intracellulari e popolazione intracellulare di fluorofori. Pertanto, a seconda del tipo di campione, è necessario esplorare diverse profondità di penetrazione, alla ricerca della migliore combinazione: rapporto segnale-rumore elevato, bassa potenza di eccitazione, breve tempo di esposizione, breve profondità di penetrazione. Una volta completata questa ottimizzazione, la profondità di penetrazione viene mantenuta costante per tutti i controlli e i campioni. (C) Rappresentante dell'epiorescenza e delle immagini TIRF di una cella HeLa-GPI-mEGFP dopo l'ottimizzazione software-guidata della profondità e della direzione del campo evanescente. I microscopi TIRF multi-angolo consentono inoltre di ottimizzare la direzione del campo evanescente. Questo passaggio è consigliato per ridurre al minimo la dispersione (cioè un forte aumento dell'intensità e un'immagine meno nitida) e può essere eseguita secondo le istruzioni del microscopio specifico utilizzato. In questo protocollo il software del microscopio include un'ottimizzazione automatica della direzione del campo evanescente. Per l'ottimizzazione manuale, fare riferimento ai protocolli pubblicati36,37. (D) Cellula rappresentativa che esprime il costrutto mEGFP-FGFR1 in epifluorescenza e dopo l'ottimizzazione dell'illuminazione TIRF. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: acquisizione della serie temporale e calibrazione della risposta della fotocamera a singoli fotoni. (A) Esempio del primo fotogramma di serie temporali di 700 fotogrammi catturato su una cella HeLa-mEGFP-FGFR1 in modalità Sensore ritagliato. Il chip della fotocamera è parzialmente mascherato (rettangoli rossi) utilizzando il connettore a doppia vista installato al microscopio TIRF (Figura 1B). Le aree di calibrazione interne vengono riconosciute nell'immagine di intensità media (B) ed elaborate (C) per stimare i parametri della fotocamera tracciando la frequenza di registro rispetto ai livelli digitali (D). Un sistema di rilevamento analogico, ad esempio una telecamera EMCCD, rileva impulsi di fotocorrente anziché di conteggi di fotoni e la distribuzione dell'altezza dell'impulso fotonico è quasi esponenziale. La prima parte della distribuzione è dovuta all'amplificatore e al convertitore da analogico a digitale e contribuisce a un rumore di lettura gaussiana (la varianza introdotta dalla registrazione del segnale). Il canale più popolato (cioè il valore più frequente) della distribuzione è l'offset (eq. 13). Utilizzando un cursore verticale in un grafico di log, la prima parte della distribuzione è separata dalla seconda parte esponenziale, superiore a 250 DL, che rappresenta la risposta media della fotocamera a un singolo fotone (la pendenza è il fattore S in eq. 12). La misurazione di questi parametri consente di stimare la densità dei fotoni registrati durante l'acquisizione. I conteggi (DL) sono in scala di pseudo-colore. Dimensione in pixel: 124 nm; Formato dell'immagine: 256x256 pixel, profondità di penetrazione del campo evanescente : 110 nm; #1 del ROI di calibrazione - 19x256 pixel; #2 ROI di calibrazione - 5x256 pixel. DL - livelli digitali. Esposizione: 1 ms e EMGain (il fattore G in eq. 12, 13 e 14) - 1000. Si noti che le telecamere che lavorano in modalità di conteggio dei fotoni con sfondo sono equivalenti ai rilevatori analogici con S 1 (eq. 12) e con2d e scostamento (eq. 13) misurati nello stesso modo di un sistema analogico18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Analisi N&B dell'oligomerizzazione FGFR1. (A) Il rappresentante è il risultato di due cellule HeLa nello stesso piatto che esprimono mEGFP-FGFR1 e catturate al momento 0 min (in alto) e 7 min (in basso) dopo l'aggiunta di 20 ng/mL FGF2 e(B)due celle HeLa che esprimono i costrutti di riferimento GPI-mEGFP (in alto) e GPI-mEGFP-mEGFP (in basso). L'intera sequenza di analisi mostra (da sinistra a destra): Intensità media della serie temporale; Grafico di tutti i valori B in funzione dell'intensità della fluorescenza in cui il codice colore rappresenta il numero di pixel con lo stesso valore B nell'immagine e i cursori rettangolari delimitano l'area di interesse (ROI), lo sfondo (BG) e le regioni di intensità (LI). Si noti che i fluorofori immobile daranno valore B 1 dal momento che in assenza di fluttuazioni s 0; B-map del ROI scelto e dell'istogramma di distribuzione B associato. La distribuzione del valore B è dotata di una funzione gaussiana (linea rossa tratteggiata) per calcolare la luminosità apparente media, B (linea rossa completa) e le statistiche di distribuzione (Tabella supplementare 1) valore B - B' - B/S (eq. 15); Intensità: ( - scostamento)/S; M - monomero; D - dimero; barre della scala 10 micron. Serie di data time di dati non elaborati in Film supplementare 1, Film supplementare 2, Film supplementare 3e Film supplementare 4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Kinetics of FGFR1 oligomerization indotta dall'attivazione del ligando. Le tirature cinetiche rappresentative descritte dalla luminosità media normalizzata (eq. 16) delle cellule HeLa-mEGFP-FGFR1 dopo la stimolazione con 20 ng/mL FGF2 (A) o 50 G/mL NCAM-Fc (B). Le cellule dello stesso piatto sono state catturate a punti di tempo crescenti e la luminosità media apparente, B - S.E., è stata calcolata dagli istogrammi di distribuzione B. La figura è adattata con il permesso di .amai et al. Journal of Cell Science (2019)31. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Cinetica veloce e interpretazione dei dati. Il grafico a dispersione di tutti i valori di luminosità media normalizzata ottenuti da cicli cinetici di replica in cui le celle HeLa-mEGFP-FGFR1 sono state stimolate con NCAM-Fc (50 g/mL) o FGF2 (20 ng/mL). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplemental Figure 1
Figura supplementare 1: istantanea dello schermo della routine di analisi in MatLab. Istantanea dello schermo della routine MATLAB dell'interfaccia utente grafica N&B (GUI) che mostra i passaggi di analisi iniziali: serie temporali di caricamento; calcolare l'immagine di intensità media, il profilo di intensità di calcolo, calcolare la mappa B e l'istogramma B-I. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Parametro GPI-mEGFP GPI-mEGFP-mEGFP mEGFP-FGFR1 (tempo mEGFP-FGFR1 (tempo n. 10')
Valore B medio gaussiano 1.070 1.141 1.070 1.141
S.E. sul valore Medio B 0.001 0.001 0.001 0.001
S.D. della distribuzione B-vaue 0.059 0.067 0.077 0.075
95% Intervallo di confidenza del valore Medio B da 1.069 a 1.071 Da 1.139 a 1.143 da 1.069 a 1.072 Da 1.139 a 1.143
S.D. dell'intervallo di confidenza del 95% del valore B Da 0,058 a 0,060 Da 0,065 a 0,069 Da 0,075 a 0,079 Da 0,073 a 0,078
Vincolo di raccordo S.D. > 0 S.D. > 0 S.D. > 0 S.D. > 0
Errore standard S.E.; Deviazione standard S.D.

Tabella supplementare 1: Analisi della luminosità apparente. Sono state effettuate statistiche e i parametri di montaggio gaussiani delle distribuzioni B nella figura 5. Gli adattamenti gaussiani meno quadrati sono stati ottenuti sotto il vincolo della deviazione standard > 0 con l'intervallo X scelto automaticamente e le iterazioni massime : 1000. Quadrato R: mEGFP-FGFR1 monomer - 0,9957, mEGFP-FGFR1 dimer 0.9940; GPI-mEGFP - 0,9985; GPI-mEGFP-mEGFP - 0,9970.

Supplemental Movie 1
Filmato supplementare 1: Serie temporali di una cella HeLa-mEGFP-FGFR1 al momento : 0 minuti dopo la stimolazione FGF2 (20 ng/mL in PBS integrata con 0.01% BSA) mostrato Figura 5. La serie di 800 fotogrammi sono riprodotti non compressi a 7 fps. Formato dell'immagine: 256 x 256 pixel; dimensione in pixel: 124 nm; L'area di calibrazione interna è identificata come bande laterali scure. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Supplemental Movie 2
Filmato supplementare 2: Serie temporali mostrate nella Figura 5 di una cella HeLa-mEGFP-FGFR1 alla volta : 7 minuti dopo la stimolazione FGF2 (20 ng/mL in PBS integrata con 0.01% BSA) La serie di 800 fotogrammi sono riprodotti non compressi a 7 fps. Formato dell'immagine: 256 x 256 pixel; dimensione in pixel: 124 nm; L'area di calibrazione interna è identificata come bande laterali scure. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Supplemental Movie 3
Filmato supplementare 3: Serie temporali mostrate nella Figura 5 di una cella HeLa-GPI-mEGFP dopo l'aggiunta del veicolo (PBS integrato con 0.01% BSA). La serie di 1.000 fotogrammi viene riprodotta non compressa a 7 fps. Formato dell'immagine: 256 x 256 pixel; dimensione in pixel: 124 nm; L'area di calibrazione interna è identificata come bande laterali scure. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Supplemental Movie 4
Filmato supplementare 4: Serie temporali mostrate nella Figura 5 di una cella HeLa-GPI-mEGFP-mEGFP dopo l'aggiunta del veicolo (PBS integrato con 0.01% BSA). La serie di 1.000 fotogrammi viene riprodotta non compressa a 7 fps. Formato dell'immagine: 256 x 256 pixel; dimensione in pixel: 124 nm; L'area di calibrazione interna è identificata come bande laterali scure. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

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Discussion

N&B richiede diverse precauzioni nella scelta del modello di cella e della strategia di etichettatura. Può essere applicato solo alle cellule vive che rimangono aderenti stabilmente durante il tempo di acquisizione dell'immagine. Le fluttuazioni extra dovute allo spostamento rigido dell'intera cellula potrebbero essere gestite con approcci appropriati per il ripristino dell'immagine38. Tuttavia, generalmente quando una cellula si muove, anche la membrana cellulare si deforma e la deformazione della struttura, producendo una grande varianza extra, introduce gravi limitazioni all'analisi delle proteine della membrana. In questo lavoro, il costrutto fluorescente è espresso nella linea cellulare HeLa perché la fStitutive FGFR1 è trascurabile. La presenza della proteina costituiscive è una condizione da evitare, altrimenti si formerebbero popolazioni miste di oligomeri recettori fluorescenti e non fluorescenti. Di conseguenza, l'analisi N&B, che si basa solo sulla luminosità della popolazione proteica fluorescente, ritornerebbe una stima inaffidabile dello stato oligomerico medio. Questo aspetto è particolarmente importante quando si applica N&B per rilevare gli eventi di dimerizzazione del recettore in cui la luminosità aumenta solo di un fattore di 2, come la dimerizzazione FGFR1 in presenza del ligando FGF2. In tal caso, la presenza di dimeri misti può nascondere completamente gli eventi di dimerizzazione rilevabili da N&B. La contaminazione di oligomeri fluorescenti con forme di stitutive non fluorescenti è una delle potenziali insidie di qualsiasi approccio basato sulla rilevazione della fluorescenza, a meno che la proteina marcata non sia in gran parte sovraespressa. Tuttavia, gli studi di oligomerizzazione in condizioni di sovraespressione delle proteine sollevano preoccupazioni circa il loro significato funzionale. Le cellule transettate transitoriamente avranno probabilmente livelli variabili di fluorescenza (cioè la concentrazione proteica) e sono utili per testare l'indipendenza della luminosità media sulla concentrazione proteica, poiché l'N&B può essere applicato a un'ampia gamma di concentrazioni, sotto la condizione di risposta lineare del rivelatore (vedere la definizione della luminosità, eq. 1).

Un altro vincolo è l'etichettatura stoichiometrica del recettore utilizzando un fluoroforo stabile nelle cellule vive. Halotag, proteine fluorescenti (FP) o altri tag fluorescenti covalenti sono etichette adatte per ottenere un numero esatto di fluorofori legati per molecola di proteina nella cellula. Per ridurre la complessità dell'analisi N&B, utilizziamo proteine fluorescenti o alaiche che producono un'etichettatura fluoroforo-a-proteina 1 a 1. L'FP di scelta deve essere monomerico nella forma matura, con una trascurabile tendenza all'auto-associazione che, altrimenti, potrebbe indurre l'oligomerizzazione artificiale dei recettori con tag FP. In questo protocollo, usiamo il (A207K)mEGFP perché questa mutazione a punto singolo abolisce la tendenza di auto-aggregazionm mEGFP come precedentemente mostrato31,39,40. Indipendentemente dalla strategia di etichettatura, la proteina fluorescente etichettata dovrebbe essere controllata per la conservazione dell'attività biologica nel modello di cellula scelto, poiché la funzionalità delle molecole etichettate è essenziale per collegare gli eventi di oligomerizzazione la segnalazione del recettore. Nel nostro modello, abbiamo dimostrato l'autoforosforilazione del fluorescente (A207K)mEGFP-FGFR1 dopo aver stimolato le cellule trasfetate con il recettore ligand FGF231.

N&B si basa sulla diffusione delle molecole nel volume di illuminazione. Nel rilevamento della fotocamera digitale, il tempo di esposizione (cioè il tempo di permane dei pixel nel rilevamento analogico, td'abita) deve essere sufficientemente breve da catturare una sola configurazione di particelle nel volume focale. Ciò significa che la probabilità che un fluoroforo entri o esca dal volume illuminato durante il tempo di esposizione è molto piccola. Il tempo di esposizione deve essere inferiore al tempo di residenza del fluoroforo (D), che è il tempo medio che un fluoroforo trascorre nel volume illuminato. Pertanto, prima di iniziare un esperimento N&B, è necessario avere qualche nozione sul tempo di residenza (o sul coefficiente di diffusione) della proteina bersaglio, che in una prima approssimazione dipende dalla localizzazione subcellulare e dalla massa molecolare. La frequenza fotogrammi è l'inverso del tempo necessario alla fotocamera per acquisire un'immagine e quindi leggere completamente l'immagine, ed è spesso calcolata approssimativamente dal numero totale di pixel e dalla velocità di lettura, combinata con il tempo di esposizione. Anche se la frequenza fotogrammi non deve essere veloce, il tempo di ciclo (ciclo t), che è la somma della frequenza fotogrammi e il tempo necessario per preparare l'acquisizione del fotogramma successivo, potrebbe influire sull'analisi. Questi vincoli possono essere generalizzati come: ciclo t >> s >> tdimora. Se il tempo del ciclo è troppo veloce, le molecole non si saranno spostate sensibilmente da un fotogramma all'altro in quel tempo, e appariranno come immobili (B n. 1). Tuttavia, poiché sono necessari centinaia di fotogrammi per l'analisi, il ciclo viene impostato il più velocemente possibile (aumentando o diminuendo il formato dell'immagine in numero di pixel) per evitare spostamenti delle celle e distorsioni della membrana cellulare che aggiungerebbero una grande varianza in più durante l'acquisizione della serie. Nell'esempio di questo protocollo, il tempo di ciclo più lento è 22 ms, in modo che 500 frame possono essere acquisiti in 11 s.

La luminosità molecolare non è una quantità assoluta; Dipende dalle proprietà molecolari del fluoroforo (sezione trasversale e resa quantistica), dall'impostazione sperimentale (rivelatore e ottica) e dalle condizioni di eccitazione come la potenza laser. Pertanto, l'approccio TIRF-N&B produce una luminosità apparente e per questo è fondamentale impostare un "modello di cellula di riferimento" che esprime un costrutto di riferimento con stato oligomerico univoco. Il costrutto di riferimento porta lo stesso tag fluoroforo della proteina in fase di studio [qui, il (A207K)mEGFP] e si localizza nello stesso compartimento subcellulare (qui, la membrana plasmatica). In questo lavoro usiamo un costrugo glicosylphosphatidylinositol (GPI) ancorato-(A207K)mEGFP che abbiamo ripetutamente dimostrato di essere uno standard di luminosità monomerica affidabile per i recettori della superficie cellulare etichettati con lo stesso fluoroforo30, 31.

Uno dei principali inconvenienti è il verificarsi di fotosbiancamento fluoroforo che molto probabilmente accade quando la stessa cellula viene ripetutamente esposta alla luce durante una corsa cinetica, e porta ad una sottovalutazione dello stato di oligomerizzazione. Per evitare che, la cinetica di luminosità si ottiene combinando la luminosità media di celle diverse ciascuna catturata in un punto diverso (Figura 6). Vale a dire che in un piatto Petri ogni cellula è un punto temporale diverso della cinetica e un piatto di Petri rappresenta un'intera corsa cinetica.

Quando la dinamica dell'oligomerizzazione è veloce e complessa, come l'oligomerizzazione FGFR1 indotta da un ligando non canonico, NCAM31, il profilo della luminosità media normalizzata rispetto al tempo può essere variabile e instabile(Figura 6B ). In tal caso, la riproducibilità non può essere determinata leggendo replicare piatti di cellule in punti temporali precisi, a causa della necessità di muoversi e concentrarsi su una nuova cella ogni volta, selezionare un ROI, catturare e ispezionare / scartare serie temporali. Pertanto, la riproducibilità può essere valutata in termini di somiglianza del profilo cinetico e ampiezza dei cambiamenti di luminosità.

Una panoramica dei risultati è presentata in Figura 7. Il grafico a dispersione illustra solo la luminosità media misurata nelle celle dello stesso piatto, trascurando il tempo di ogni cattura. In questa trama la grande differenza indotta dai due ligandi sullo stato di oligomerizzazione del recettore rimane evidente, anche se tutte le informazioni cinetiche vengono rimosse. Tuttavia, per entrambe le serie di esperimenti (oligomerizzazione indotta da FGF2- e indotta da NCAM), l'approccio convenzionale di determinare la media : S.D. di ciascuna esecuzione nella figura 7 porterebbe a conclusioni fuorvianti poiché le molecole FGFR1 stimolate da FGF2 chiaramente transito in due stati ben definiti, mentre NCAM induce miscele FGFR1 instabili e cicliche oligomeriche che non sarebbero ben rappresentate da un valore medio S.D.

In sintesi, da un punto di vista sperimentale, N&B richiede solo l'accesso a un microscopio dotato di un modulo di acquisizione veloce e di un software dedicato. La proteina di interesse può essere etichettata con una varietà di proteine fluorescenti monomeriche o fluorofori organici, ma le misurazioni quantitative richiedono diverse condizioni per essere soddisfatte: etichettatura stoichiometrica, standard di luminosità di riferimento, rivelatore calibrazione e nessuna fotosbiancatura. In questo contesto, l'approccio N&B è un potente strumento per decifrare l'oligomerizzazione spatiotemporale delle proteine nelle cellule vive. Inoltre, i recenti progressi nel ricampionamento dei dati grezzi per risolvere la ponderazione statistica41 e la combinazione della spettroscopia incrociata a fluorescenza con N&B42 a correlazione incrociata stanno perfezionando e migliorando l'applicabilità della N Approccio &B all'oligomerizzazione delle proteine e agli studi di interazione.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Il CNIC è supportato dal Ministero della Ciencia, Innovacion y Universidades e dalla Pro CNIC Foundation, ed è un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Siamo inoltre sostenuti dal Fondo europeo di sviluppo regionale (FEDER) "Una manera de hacer Europa". UC riconosce il sostegno dell'Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, dell'Associazione per la Ricerca Internazionale sul Cancro (ora nota come Worldwide Cancer Research) e del Ministero della Salute italiano. A.T. riconosce la "Banca banca del Monte di Lombardia" in parte sostenendo il suo lavoro con la Pv Fellowship "Progettoità Professionalità Ivano Becchi" 2011-2012.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 21063029 Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10566-016 Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Biowest, Nuaillé, France X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2 TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10270106 10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishes MatTek, Ashland, MA, USA P35G-0.170-14-C uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA LONZA 17-602E supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2 PeproTech EC, Ltd., London, UK Ligand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO ThermoFisher Scientific 11360070 1 mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent MirusBio LLC, Madison, WI, USA MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 25200056
Type F Immersion liquid 10 mL Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific AM2618 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections

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References

  1. Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
  2. Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
  3. Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. Muscarinic receptor oligomerization. Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).
  4. Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
  5. Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
  6. Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
  7. Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
  8. Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
  9. Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
  10. Trussell, H. J., et al. Academic Press Library in Signal Processing. Trussell, J., et al. 4, Elsevier. 3-9 (2014).
  11. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  12. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  13. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
  14. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  15. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  16. Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
  17. Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
  18. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  19. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  20. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  21. Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
  22. Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
  23. Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047 (2016).
  24. Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
  25. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  26. Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
  27. Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
  28. Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
  29. Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
  30. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  31. Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
  32. Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
  33. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).
  34. Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
  35. Joubert, J., Sharma, D. Light microscopy digital imaging. Current Protocols in Cytometry. , (2011).
  36. Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
  37. Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).
  38. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  39. Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
  40. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
  41. Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
  42. Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).

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Biologia Numero 153 Recettori cluster N&B Numero e Luminosità analisi del momento oligomeri proteici membrana cellulare microscopia TIRF
Dinamica di oligomerizzazione dei recettori delle superfici cellulari nelle cellule viventi mediante microscopia a fluorescenza totale di riflessione interna combinata con l'analisi del numero e della luminosità
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Zamai, M., Trullo, A., Arza, E.,… More

Zamai, M., Trullo, A., Arza, E., Cavallaro, U., Caiolfa, V. R. Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60398, doi:10.3791/60398 (2019).

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